Protocolos optimizados para<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt; Gestión Strain: Congelado Stock Conservación y Mantenimiento en ratones desnudos atímicos

Resumen

Mycobacterium leprae, el agente causante de la lepra, no crece in vitro. Describimos un fácil seguir el protocolo para preparar una suspensión bacilar para asegurar el mantenimiento de grandes cantidades de M. leprae para una variedad de aplicaciones. Protocolos para la propagación por el ratón de la inoculación de la almohadilla plantar, la evaluación de la viabilidad, la congelación y descongelación de stock bacilar se describen en detalle.

Resumen

La lepra, causada por Mycobacterium leprae, es una enfermedad infecciosa importante que todavía es endémica en muchos países de todo el mundo, entre ellos Brasil. Actualmente no hay métodos conocidos para el cultivo de M. leprae in vitro, presentando un obstáculo importante en el estudio de este patógeno en el laboratorio. Por lo tanto, el mantenimiento y el crecimiento de M. cepas leprae se realizan preferiblemente en ratones desnudos atímicos (NU-Foxn1 ^nu). Las condiciones de laboratorio para el uso de los ratones son de fácil acceso, fácil de realizar, y permiten la normalización y el desarrollo de protocolos para la obtención de resultados reproducibles. En el presente informe se describe un protocolo sencillo para la purificación de los bacilos de bandoleros desnudos ratón utilizando tripsina, que produce una suspensión con restos celulares mínimo y con un alto índice de viabilidad bacteriana, según lo determinado por microscopía de fluorescencia. Una modificación en el método estándar para el recuento bacilar por Ziehl-Neelsentinción y microscopía de luz también está demostrada. Además, se describe un protocolo de congelación y descongelación stocks bacilar como un protocolo alternativo para el mantenimiento y conservación de M. cepas leprae.

Introducción

La lepra, una enfermedad causada por Mycobacterium leprae, es un problema importante de salud pública en muchos países en todo el mundo ^1,2. A pesar de ser conocida como una enfermedad infecciosa que afecta la piel y los nervios periféricos, todavía hay varias lagunas en el conocimiento sobre los mecanismos implicados en el complejo inmunopatogénesis de la enfermedad.

Entre las características desafiantes de M. leprae, que dificultan su estudio son su incapacidad para crecer en medios artificiales cultura y su tiempo relativamente largo duplicar (aproximadamente 14 días) ^3,4. La mayoría de los procedimientos experimentales que utilizan M. leprae se configuran con bacilos purificadas de lesiones en la piel de los enfermos de lepra o de modelos animales experimentales, como armadillos y varias cepas de ratones ^5,6.

Durante muchos años, los investigadores han dependido de purificación de M. leprae de lesiones cutáneas de LEPR multibacilarpacientes osy para su uso en los procedimientos experimentales. Varias condiciones de laboratorio para el cultivo in vitro o mantenimiento de M. vivo leprae se han intentado, pero hasta la fecha, los modelos animales han demostrado ser más adecuado para fines de investigación. En los años 1960 y 1970, los investigadores comenzaron a utilizar ratones y armadillos para la detección y evaluación de M. viabilidad leprae, control del crecimiento bacteriano en respuesta a anti-M. medicamentos leprae, y en el crecimiento y mantenimiento de cepas de micobacterias ^2,4.

Los modelos animales tienen algunas limitaciones, sobre todo en los armadillos y los primates no humanos, incluidas las preocupaciones éticas, el costo de mantenimiento, infraestructura especial que se necesita para el mantenimiento de los animales, y la mala reproducibilidad de los resultados y de los rendimientos finales. Actualmente, los ratones son los animales modelo preferido para la investigación de la lepra. Las condiciones de laboratorio para el uso de los ratones son de fácil acceso, fácil de realizar, y permiten a los protocolos estandarizados ^{7.8.9. Los ratones desnudos se han utilizado en el mantenimiento de M. leprae cepas, ya que, incluso con cargas bacilos viables bajas, la respuesta inmunitaria deficiente de células T conduce a la formación de granulomas exuberante y buena multiplicación bacilar. Por lo tanto, este modelo animal se ha ganado una amplia aceptación en la comunidad investigadora de la lepra.}

En el presente informe se describe un protocolo sencillo para la purificación enzimática de bacilos de almohadillas de ratón desnudo, destinados a la preparación de una M. suspensión leprae con restos celulares mínimo y con un alto índice de viabilidad bacteriana. La viabilidad se determinó por microscopía de fluorescencia, que puede realizarse rápidamente en el laboratorio. También demostramos una modificación en el método estándar para el recuento bacilar por tinción de Ziehl-Neelsen frío y microscopía de luz. Además, presentamos un protocolo alternativo para el mantenimiento y conservación de M. cepas leprae, lo que permite la congelación y descongelación de bacilar Stocks.

Protocolo

1. Preparación de la suspensión de Mycobacterium leprae

1. Antes de la eutanasia de los ratones desnudos atímicos (NU-Foxn1 ^nu), preparar la solución de tripsina y medios de cultivo (Protocolo de los reactivos - Protocolos 1, 2 y 3). La eutanasia a los ratones desnudos 4-5 meses después de la inoculación con M. leprae acuerdo con las Directrices de la AVMA para la eutanasia de los animales: 2013 Edición ¹⁰ (se aprobaron y llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado de Animales de la Facultad de Odontologia de Bauru, USP los experimentos y el uso de imágenes de los animales). Dentro de una cabina de seguridad biológica se utiliza para el manejo de los animales, limpiar todo el ratón con alcohol al 70% de etanol.
2. Sostenga la pata trasera con unas pinzas hemostáticas distal a la articulación del tarso. Cortar la pata con unas tijeras por debajo de los fórceps y sumerja la pata en 2% de yodo durante 20 min. A continuación, repita el procedimiento con la otra pata trasera.
3. Transferencia de las patas a unalimpia cabina de seguridad biológica para seguir trabajando. Tome las patas del yodo al 2%, séquelos con una gasa estéril y recoger las dos almohadillas utilizando el número 22 o 23 hoja de bisturí, la eliminación de todo el tejido blando (dermis, epidermis, los tendones y los nervios) cerca del hueso. Retire los metatarsianos huesos y la primera y quinta falanges. Coloque el material en una placa de Petri estéril y eliminar la epidermis, por raspado apagado con la hoja de bisturí. Cortar el tejido en trozos pequeños con tijeras y transferirlos a un tubo de fondo redondo. Peso del tejido y añadir 1 ml de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS). Mantenga el tubo en hielo para evitar el calentamiento de la muestra.
4. Agregar otro 1 ml de HBSS y homogeneizar la muestra utilizando un homogeneizador de tejidos.
   1. Primer ciclo de homogeneización: 3 pulsos de 15 segundos a velocidad 4 (14.450 rpm).
   2. Transferir el sobrenadante a un tubo cónico de 50 ml estéril, pasándolo por un filtro de células para eliminar los escombros restante. Deje que la solución pasa por gravidad.
   3. Añadir un adicional de 2 ml de HBSS, y repetir el ciclo de homogeneización (Sección 1.4.1), y pasar las muestras a través del filtro de células de nuevo.
   4. Enjuague el filtro mediante la adición de HBSS para llevar el volumen a 9 ml. Deseche el filtro celular.
5. Descongelar una alícuota de una solución de tripsina al 0,5%. Añadir 1 ml de tripsina para los 9 ml de suspensión celular para obtener una concentración final de 0,05% de tripsina. Deseche restante tripsina descongelado. Incubar durante 60 min en un 37 ° C baño de agua. Después de la incubación, llevar el volumen hasta 40 ml mediante la adición de solución salina estéril para diluir la tripsina.
6. Centrifugar a 1700 xg durante 30 min a 4 ° C.
7. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente invirtiendo el tubo. Resuspender el precipitado tocando el tubo y luego agregar 1 ml de solución salina estéril. Transferir la suspensión a un nuevo tubo cónico de medir el volumen final de la suspensión (para calcular el rendimiento / gramo de tejido).
8. Homogeneizar la suspensión bacilar usando un 1 ml jeringa de insulina con una aguja de calibre 26 durante la transferencia de la suspensión a un tubo nuevo.
9. Realizar el control microbiológico de la suspensión mediante la colocación de 2 gotas (50 ul) de la misma en cada medio: 7H9 y medio de Lowenstein-Jensen y se incuba a 37 ° C durante 30 días, para la detección de la contaminación de las micobacterias. Del mismo modo, inocular un Infusión de Cerebro Corazón (BHI) medio y se incuba durante 24 horas a 37 ° C, para la detección de la contaminación de bacterias aerobias.
10. Alícuota de la suspensión en tubos para la tinción: 35 l para la tinción de Ziehl-Neelsen Fría (Protocolo 2), y 200 l para la determinación de la viabilidad (Protocolo n º 3).
11. Después de la tinción de Ziehl-Neelsen (ZN), calcular el número de bacilos ácido alcohol resistentes / ml (AFB / ml). Para la inoculación de ratones nude, prepare un 1 x 10 ⁸ AFB / ml suspensión, asegúrese de tener el volumen suficiente para inocular 30 l / almohadilla / animal (Protocolo 5), y mantener el frío suspensión hasta la inoculación. Para la congelación, preparar una AFB / ml sos 1 x 10 ⁷pensiones (Protocolo n º 4).

2. Fría Ziehl-Neelsen tinción

1. Antes de comenzar la tinción, preparar la solución de suero / fenol y las soluciones de tinción ZN (Protocolo de los reactivos - Protocolos 4 y 5). Dibuje tres círculos (diámetro interno 10 mm) en tres portaobjetos de cristal utilizando una pluma de inmunohistoquímica. Identificar las diapositivas: (1) normales o sin diluir, (2) 01:10, y (3) 1:100 usando un lápiz del número 2 (Nota: algunos de grafito se desvanece después de la tinción de ZN).
2. Diluir la suspensión bacilar (paso 1,10) a 1:10 y 1:100 diluciones en serie, es decir, añadir 5 l de suspensión sin diluir y 45 l de solución salina, a continuación, tomar 5 l de 1:10 y añadir 45 l de solución salina.
3. Añadir 5 l de la solución de suero / fenol y 10 l de suspensión de bacilar por círculo. Homogeneizar y extender uniformemente alrededor de la zona del círculo con el mango de un bucle desechable. Espere a que la suspensión se seque sobre una mesa nivelada.
4. Después drying, fijar el frotis pasando la diapositiva 3 veces sobre la llama azul de un mechero Bunsen (alrededor de 20 segundos en total) ^11.
5. Para la tinción, cubrir toda la superficie de la corredera con filtrada carbofuchsine de Ziehl-Neelsen (aproximadamente 5 ml) durante 20 min.
6. Enjuague el portaobjetos en agua (flujo lento) que se ejecuta.
7. Cubrir el portaobjetos con una solución de alcohol ácido 10% durante aproximadamente 20 seg.
8. Lavar el portaobjetos de nuevo en el agua corriente.
9. Cubrir el portaobjetos con una solución de azul de metileno durante 5 min.
10. Enjuague el portaobjetos con agua corriente y dejar secar a temperatura ambiente.
11. Cuente 20 campos / círculo (total 60 campos / slide), utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 100X. El cálculo de bacilos ácido alcohol resistentes / ml (AFB / ml) se realiza de la siguiente manera, de acuerdo a la descripción en las técnicas de laboratorio para la Lepra ^12:
    AFB / campo = número total de bacilos que se encuentran en los 3 círculos (60 campos), dividido por 60.
    AFB / ml = AFB / campo x constante (área del círculox 100 dividido por el área de la abertura de la lente objetiva), y si al contar una suspensión diluida, multiplique el número de AFB / ml por el factor de dilución (10 ó 100).

3. Determinación de viabilidad

1. Antes de comenzar, preparar el autoclave M. leprae suspensión (Protocolo de los reactivos - Protocolo 7). Utilice el kit adecuado (vea la tabla de reactivos y equipos) para la determinación cualitativa de M. viabilidad leprae en la suspensión. Diluir las soluciones siguientes (todos los procedimientos deben realizarse con poca luz): diluir la solución A en un factor de 10 en solución salina (1 l acciones más 9 l de solución salina), diluir la solución B 20 en un factor de en solución salina (1 l de stock además de 19 l de solución salina).
2. Añadir 3,6 l de solución diluida A y 6 l de solución diluida de B a 200 l de la suspensión bacilar a ser probado (paso 1,10). A M. previamente tratada en autoclave leprae suspensión es habitualmente utilizado como unegative de control para la tinción de viabilidad.
3. Incubar las suspensiones durante 15 min, a temperatura ambiente en la oscuridad.
4. Centrifugar el tubo a 10.600 xg durante 5 min a 4 ° C.
5. Descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 15 l de 10% de glicerol. Aplicar 8 l de la superficie de un portaobjetos de vidrio limpio y cubrirlo con una pequeña hoja de la cubierta. Analizar el portaobjetos con un microscopio de fluorescencia, que contiene los filtros adecuados (véanse las recomendaciones Molecular Probes). Evaluar los resultados comparando Syto 9 (Sy) y la tinción de yoduro de propidio (PI) tinción.
   Nota: Sy mancha penetra el 100% de las bacterias muertas y vivas, y la tinción PI penetra sólo las bacterias con las membranas dañadas. La suspensión tratada en autoclave (control negativo) puede formar montones de bacterias debido a la presencia de restos celulares. La escala semicuantitativa utilizada para la evaluación vivo / muerto varía de 0 a 2 +; 0 indica que menos del 30% de las células son positivas para tinción PI; 1 + significa entre 30 -50% de las células son positivas para tinción PI; 2 + significa más de 50% de las células son positivas para tinción PI. Una puntuación de 0 se considera el más adecuado para su uso.

4. Congelación / descongelación M. leprae Suspensión

1. Antes de empezar, prepare el medio de congelación (Protocolo de los reactivos - Protocolo 6). Para la congelación, siga los pasos descritos a continuación:
   1. Añadir 150 l de la suspensión que contienen 1 x 10 ⁷ AFB / ml a un criovial estéril junto con 1 ml de medio de congelación.
   2. Colocar el vial en un recipiente de congelación y almacenar el recipiente a -80 ° C durante 24 h.
   3. Transferir el vial congelado a una caja de almacenamiento y almacenarlo a -80 ° C.
2. Para descongelar, utilice los pasos descritos a continuación:
   1. Retire el vial con la suspensión congelada de -80 ° C y colocarlo en un baño de agua a 37 ° C para iniciar la descongelación de la suspensión.
   2. Se vierte la suspensión en un tubo que contiene 20 ml de estérilsolución salina. Mezclar la suspensión suavemente hasta la descongelación se ha completado.
   3. Centrifugar la suspensión durante 30 minutos, a 1.700 xg, a 4 ° C.
   4. Eliminar el sobrenadante y añadir una cantidad suficiente de solución salina estéril para alcanzar el volumen deseado. Homogeneizar la suspensión pasándolo a través de una jeringa (paso 1.8).
   5. Para la tinción de ZN, la determinación de la viabilidad y la inoculación, seguir los protocolos 2, 3 y 5.

5. Inoculación de ratones

1. Se necesitan dos personas para este procedimiento, uno para frenar el ratón y otra para administrar el inóculo. El animal a inocular debe ser manejado de acuerdo con las directrices y normas éticas y todos los procedimientos deben ser aprobados por el comité de cuidado de los animales y el uso institucional. Prohibir al ratón desnudo por la piel del cuello con las patas hacia arriba.
2. Homogeneizar la suspensión pasándolo a través de una aguja de calibre 26. Con una jeringa de 1 ml, aspirado suficiente suspensión bacilar a inóculosTE dos almohadillas de las patas (30 l / almohadilla plantar).
3. Mantenga la pata trasera, limpiar la almohadilla de la pata con 70% de etanol de alcohol antes de la inyección por vía intradérmica e introducir la aguja con el bisel de la aguja apuntando hacia arriba, desde el extremo proximal hacia el lado distal de la almohadilla de la pata. Inyectar 30 l de la suspensión. Las inyecciones de la almohadilla plantar se pueden realizar en ratones anestesiados.
4. Esperar 5 segundos antes de retirar la aguja de la piel para evitar el reflujo del inóculo. Los ratones deben ser alojados en la suavidad de post juegos de cama de la inoculación, y la deambulación y signos de automutilación deben ser controlados.

Resultados

El éxito del protocolo se puede evaluar en tres maneras. En primer lugar, la evaluación de la calidad del inóculo se determina por la cantidad de restos celulares y el porcentaje resultante de bacilos viables en la suspensión final (Ver Protocolo 3). Como se muestra en las figuras 1 y 2, la suspensión bacilar final contenía muy poco los desechos celulares y de alta viabilidad (puntuación de 0 +); tenga en cuenta que la mayoría de los bacilos tiñeron con la tinción fluorescente verde Syto 9 (mancha penetra 100% de ambas bacterias muertas y vivas, Figura 1) y sólo unos pocos bacilos teñidos con la tinción fluorescente PI rojo (tinte penetra sólo las bacterias con las membranas dañadas, Figura 2).

Figura 1. Syto 9 tinción de M. leprae suspensión. Fluorescencia verde demuestra la presencia de vivos y muertos M. leprae. 400X.

Figura 2. Tinción PI de M. leprae suspensión. Red de fluorescencia que muestra el pequeño número de muertos M. leprae. 400X.

En segundo lugar, un inóculo con una alta viabilidad tendrá un impacto en la multiplicación de bacilos en las almohadillas de las patas de los animales después de 4-5 meses después de la inoculación, con el desarrollo de lesión macroscópica obvia, como se muestra en el video (Protocolo 1). La tercera manera de evaluar el éxito del protocolo es mediante la evaluación de la supervivencia y multiplicación de AFB en almohadillas de las patas de ratones inoculados con bacilos que habían sido congelados durante diferentes períodos (Ver Protocolo 4).

"Cellspacing =" 0 "> Experimento (animal) Número de AFB / ml congelado el día 0 Puntuación de Viabilidad / día 0 Congelación periodo (días) Número de AFB inoculados después de la congelación Viabilidad puntuación después de la congelación Número de AFB / ml recuperados luego de 7 meses 1 (1) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 60 1.7 x 10 ⁵ 1 + 2,3 x 10 ⁸ 1 (2) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 60 1.7 x 10 ⁵ 1 + 3,8 x 10 ⁷ 1 (3) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 60 1.7 x 10 ⁵ 1 + 8,5 x 10 ⁷ 1 (4) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 60 1.7 x 10 ⁵ 1 + 4,6 x 10 ⁷ 2 (1) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 4.2 x 10 ⁵ 1 + 1,7 x 10 ⁷ 2 (2) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 4.2 x 10 ⁵ 1 + 4.8 x 10 ⁶ 2 (3) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 4.2 x 10 ⁵ 1 + 8.6 x 10 ⁶ 3 (1) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1.7 x 10 ⁵ 1 + 1,2 x 10 ⁷ 3 (2) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1.7 x 10 ⁵ 1 + 1,8 x 10 ⁷ 3 (3) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1.7 x 10 ⁵ 1 + 1,8 x 10 ⁷ 3 (4) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1.7 x 10 ⁵ 1 + 2,6 x 10 ⁷ 3 (5) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1.7 x 10 ⁵ 1 + 3.7 x 10 ⁶

Tabla 1. Resultados de M. leprae multiplicación utilizando suspensiones posterior congelación.

Tabla 1 representa los resultados de M. crecimiento leprae utilizando suspensiones después de la congelación. La puntuación viabilidad de las suspensiones después de la descongelación fue de 1 +. El protocolo de congelación se llevó a cabo en tres experimentos independientes para probar diferentes períodos de congelación. En ambos experimentos con inóculos congelado durante 15 o 60 días, el resultado fue similar, propagation después de la congelación produjo 10-1.000 veces aumentan en el número de AFB recuperado de cada almohadilla después de 7 meses de la inoculación (Tabla 1). Por lo tanto, la congelación de M. suspensiones leprae en 7H9 medio suplementado con OADC (ácido oleico-albúmina-dextrosa-catalasa) dieron como resultado el mantenimiento de la viabilidad.

Tres inóculos se utilizaron para evaluar M. leprae multiplicación después de dos períodos de congelación diferentes (15 y 60 días). Después de 7 meses, los bacilos se recuperaron de almohadillas de ratones inoculados y se contaron después de la tinción de Ziehl-Neelsen. Escala viabilidad Semicuantitativo: 0 significa ausente hasta el 30% de las células teñidas PI; 1 + significa entre un 30-50% de las células teñidas PI; 2 + significa más del 50% de las células teñidas PI. AFB: bacilos ácido alcohol resistentes.

Discusión

Una descripción detallada de un bien ilustrado, protocolo de éxito para la propagación de M. leprae es muy necesaria. Nuestro estudio demuestra que el protocolo de preparación del inóculo por filtración y digestión con tripsina permite la inóculos para obtenerse con muy poco restos celulares y con alta viabilidad de los bacilos (puntuación de 0 +). El hidróxido de sodio se ha utilizado para desagregar el tejido para la purificación de bacilos ^6. Estudios realizados en nuestro laboratorio utilizando hidróxido de sodio para la purificación de M. leprae dio lugar a la formación de grumos de bacilos, lo que dificulta la homogeneización de la suspensión para la determinación de la viabilidad y la inoculación de animales (datos no mostrados).

Los problemas potenciales encontrados con la preparación del inóculo por filtración y digestión con tripsina incluyen gran cantidad de restos celulares y la contaminación del inóculo con agentes bacterianos o fúngicos. En caso de grandes cantidades de debr celularse se observó después de la purificación, ya sea la tripsina ya no está activo o no hay una cantidad excesiva de material biológico. La actividad enzimática de la solución madre de tripsina se debe evaluar. Si se sospecha cantidad excesiva de material biológico inicial, el material debe ser dividida en partes alícuotas y el protocolo debe llevarse a cabo en lotes separados. Para evitar la contaminación del inóculo con agentes bacterianos o fúngicos, se debe tener cuidado para procesar el material en condiciones asépticas. Si se detectan por hongos y / o la contaminación bacteriana de la suspensión debe ser desechada.

Una limitación de nuestro protocolo es la subjetividad de la evaluación de la viabilidad utilizando el método semi-cuantitativo descrito. Viabilidad evaluado semi-cuantitativamente es más práctico, aunque menos preciso que el método cuantitativo publicado ^6. Puntuación de Viabilidad de 0 + y 1 + son satisfactorios para el mantenimiento de la propagación y la congelación deM. leprae. Lahiri et al. ya han demostrado que los ratones desnudos inoculados con el 80-90% de inóculo viable, resultan en almohadillas adecuadas para la cosecha (bacilos alta viabilidad) a los 4-5 meses de la inoculación. Por lo tanto, la infección temprana (alrededor de 4 meses) es el mejor momento de la cosecha. Para la recolección de los inóculos congelado, los ratones en el presente Protocolo se mantuvieron inoculado por períodos más largos (7 meses) para garantizar las curvas de crecimiento. Un paso crítico para asegurar la viabilidad adecuada es el uso de suspensiones de bacilos frescas, preferiblemente dentro de 24 horas después de la recogida del material biológico desde el host y el procesamiento. Por otra parte, la calidad de los reactivos, soluciones de tinción de tripsina y viabilidad diluidas recién preparados, son necesarios para garantizar resultados reproducibles.

Otra limitación de este protocolo es que la final M. leprae suspensión no está libre de acogida de ADN, ARN, proteínas, etc. Por lo tanto, otras etapas de purificación se deben añadir to obtener una M. leprae suspensión libre de componentes de la célula huésped.

Un método para mantener bacilos viables mediante la congelación de muestras de tejido enteras de M. lesiones leprae se ha informado ^9. Sin embargo, el estudio realizado por Portaels et al. demostrado una pérdida significativa de viabilidad, que oscila entre 65-97% después de la congelación y descongelación de M. leprae infectado muestras de tejido obtenidas de armadillo ^9. Nuestro protocolo demostró que el índice de viabilidad observada en M. suspensiones leprae después de la congelación y descongelación se redujo en comparación con la alícuota que no había sido congelado (Tabla 1). De hecho, la congelación de la M. leprae suspensión en medio de congelación dio viabilidad que van desde 50-70%, con puntuación de viabilidad 1 +, mientras que la viabilidad puntuación de 0 + se obtuvo en la suspensión no congelada. Sin embargo, la multiplicación de M. leprae fue satisfactorio después de 7 meses después de la inoculación de ratones desnudos ( Tabla 1). La inoculación de ratones desnudos con las muestras reconstituidas mantuvo congelado durante 60 días dio lugar a la media de 100 veces aumento en el número de bacilos en comparación con el inóculo inicial. Parece que la congelación del M. leprae suspensión en medio de congelación, en lugar de muestras de tejido infectados, es más eficiente. Un paso crítico de nuestro protocolo es la congelación lenta de la AFB en un recipiente de congelación, necesarios para mantener la bacilos viables, como se demuestra por Colston y Hilson ^8. Se llevaron a cabo experimentos adicionales para evaluar la viabilidad de los bacilos después de períodos de congelación más largos.

En resumen, debido a M. leprae no crece in vitro, nuestro protocolo permite una alternativa rápida y fácil para el mantenimiento de inóculo viable, y la etapa de congelación con éxito hace posible el mantenimiento de cepas y sin paso continuo en los animales, lo que permite el establecimiento de un banco de cepas definidas.

Esta sección contiene instrucciones para la preparación de reactivos para llevar a cabo este protocolo.

1. Tripsina

Tripsina	0,5 g
Agua destilada	hasta 100 ml

Se esteriliza con filtro. Almacenar a -20 ° C.

2. 7H9

Base de caldo 7H9	4,7 g
40% de glicerol	5 ml
Agua destilada	hasta 900 ml

Mezclar la base con agua y después añadir el glicerol mientras se agita. Autoclave a 121 ° C durante 20 min para esterilizar. Almacenar a 4 ° C.

3. Infusión de cerebro y corazón (BHI)

BHI	37 g
Agua destilada	hasta 1000 ml

Autoclave a 121 ° C durante 15 min para esterilizar. Almacenar a 4 ° C.

4. Suero Fenol

4,1) 5% de fenol

Fenol	5 ml
Agua destilada	hasta 100 ml

4.2) fenol suero

suero bovino fetal	2 ml
5% de fenol	98 ml

Almacenar a 4 ° C.

5. Soluciones para el frío Ziehl-Neelsen

5.1) CarboFuchsin

Fucsina	1 g
Cristales de fenol fusionan a 60 ° C	5 ml
Alcohol etílico puro	10 ml
Agua destilada	hasta 100 ml

Filtrar antes de cada uso.

5.2) de azul de metileno Base

Azul de metileno	3 g
95% de alcohol etílico	hasta 200 ml

5.3) alcohol ácido

70% de alcohol	990 ml
ácido clorhídrico	10 ml

6. Medio para la congelación:

OADC	10 ml
Glicerol	20 ml
Medio 7H9	hasta 100 ml

Autoclave de glicerol antes de su uso y esterilizar por filtración OADC.

7. Autoclave M. leprae suspensión

Autoclave a 121 ° C durante 20 min. Almacenar a -20 ° C.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BacLight Bacterial Viability Kit	Invitrogen; Molecular Probes	L7007
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma	H9269
Cryo 1 °C Freezing Container	Nalgene	5100001
Lowenstein-Jensen medium	LB Laborclin	901122
Saline	TEK Nova Inc	S5812
Pen	Dako	S2002
Centrifuge tube 50 ml/conical base	TPP	91050
Cell strainer  - 40 µm Nylon	BD Falcon	352340
Trypsin	Sigma	T-7409
Middlebrook 7H9 Broth Base	Sigma-Aldrich	M0178 Fluka
Glycerol	Gibco BRL	15514011
Brain heart infusion (BHI)	Oxoid LTDA	CM1135
Fuchsin	Merck Millipore	1159370025
Phenol	Invitrogen	15509037
Ethyl alcohol	Merck Millipore	EX02764
Cloridric acid	Merck	1131349010
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase)	Becton Dickinson	211886
Fetal bovine serum	Gibco; LifeTechnologies	26140079