Için optimize Protokoller<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt; Gerilme Yönetimi: Atimik Çıplak Farelerde Dondurulmuş Hazır Koruma ve Bakım

Özet

Mycobacterium leprae, cüzzam neden olan madde, in vitro olarak büyümez. Biz M. büyük miktarlarda bakım sağlamak için bir basil süspansiyon hazırlamak için protokolü takip etmek kolay bir tarif çeşitli uygulamalar için leprae. Fare ayak tabanı aşılama, canlılığı değerlendirilmesi, dondurma ve eritme basil stok tarafından yayılması için protokoller detaylı olarak tarif edilmektedir.

Özet

Mycobacterium leprae'nın neden Lepra, Brezilya dahil olmak üzere dünyanın birçok ülkesinde, hala endemik olan önemli bir bulaşıcı hastalıktır. M. büyüyen için bilinen bir yöntem bulunmamaktadır leprae in vitro, laboratuarda, bu patojenin çalışmada önemli bir engel sunulması. Bu nedenle, M. bakım ve büyüme leprae suşları tercihen atimik çıplak farelerde ^(nu NU-Foxn1) gerçekleştirilir. Fareler kullanmak için laboratuar şartları kolaylıkla kullanılabilir yapmak kolay ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için standardizasyon ve protokoller gelişmesini sağlar. Floresan mikroskopisi ile tespit edildiği üzere, bu yazıda, en az hücre artıkları ve yüksek bakteriyel canlılığı indeksi ile bir süspansiyon elde edilir, tripsin kullanılarak çıplak fare ayak yastıklarından ikinci basil saflaştırılması için bir protokol açıklar. Ziehl-Neelsen basil sayım için standart bir yöntem için bir modifikasyonboyama ve ışık mikroskobu da kanıtlanmıştır. Ayrıca, M. bakım ve depolama için alternatif bir protokol olarak dondurma ve çözdürme basil hisse senetleri için bir protokol açıklar lepra suşları.

Giriş

Lepra, Mycobacterium leprae'nın neden olduğu bir hastalık, dünya çapında ^1,2 birçok ülkede önemli bir halk sağlığı sorunudur. Deri ve periferik sinir etkiler bir enfeksiyon hastalığı olarak da bilinen olmasına rağmen, hastalığın karmaşık immünopatogenezinde de dahil mekanizmalar ile ilgili bilgi çeşitli boşluklar hala vardır.

M. zorlu özellikleri arasında Onun çalışmasını engelleyen lepra yapay kültür medya ve nispeten uzun bir süre iki katına (yaklaşık 14 gün) ^3,4 büyümek için kendi yetersizlik vardır. M. kullanan çoğu deneysel prosedürler lepra cüzzam hastalarının deri lezyonları veya bu armadillos ve farelerin ^5,6 birkaç suşları olarak deneysel hayvan modellerinde, saflaştırılmış basili ile ayarlanır.

Uzun yıllar boyunca, araştırmacılar M. saflaştırılması bağlıydı var lepra multibacillary leptin reseptör deri lezyonları itibarendeney prosedürlerinde kullanım için osy hastalar. Canlı M. in vitro kültivasyonu veya bakım için birkaç laboratuar koşulları leprae teşebbüs edilmiş, ancak bugüne kadar, hayvan modelleri, araştırma amaçları için en uygun olduğu kanıtlanmıştır. 1960 ve 1970'li yıllarda, araştırmacılar M. tespiti ve değerlendirilmesi için fareler ve armadillos kullanmaya başladı anti-M tepki olarak bakteri gelişimini izleme leprae canlılığı, leprae ilaçlar ve mikobakteri suşlarının ^2,4 büyümesi ve bakım.

Hayvan modelleri etik kaygılar, bakım maliyeti, hayvan bakım için gerekli özel altyapı ve sonuçların kötü tekrarlanabilirlik ve son ürünleri de dahil olmak üzere, özellikle armadillos ve primatlarda, bazı sınırlamalar var. Şu anda, fareler cüzzam araştırma için tercih edilen bir model hayvan bulunmaktadır. Fareler kullanarak için laboratuvar koşulları gerçekleştirmek kolay, hazır, ve standart protokolleri izin ^{7,8,9. Çıplak fareler M. bakımında kullanılmaktadır daha düşük uygun bir basil yükleri ile, bir T-hücresi bağışıklık tepkisi eksikliği canlı granülom oluşumunda ve iyi basil çarpma yol açar, çünkü leprae suşları. Böylece, bu hayvan modeli cüzzam araştırma toplum içinde geniş kabul görmüştür.}

Bu raporda, biz çıplak fare footpads gelen basilinin enzimatik saflaştırılması için basit bir protokol tanımlayan, bir M. hazırlanması için tasarlanmıştır minimal hücre artıkları ve yüksek bakteriyel canlılık indeksi ile lepra süspansiyon. Canlılığı hızla laboratuarda yapılabilir floresan mikroskobu ile tespit edilir. Biz de soğuk Ziehl-Neelsen boyama ve ışık mikroskobu ile basil sayım için standart yönteme bir değişiklik göstermektedir. Ayrıca, M. bakım ve depolanması için alternatif bir protokol mevcut leprea suşları, izin donma ve basilli st çözdürmeocks.

Protokol

1.. Mycobacterium leprae Süspansiyonunun Hazırlanması

1. Atimik çıplak fare (NU-Foxn1 ^nu) ötenazi önce, Tripsin çözeltisi ve kültür ortamı hazırlar (reaktiflerin Protocol - Protokoller 1, 2 ve 3). Çıplak farelere M. ile 4-5 ay sonra aşılama Euthanize lepra Hayvanların ötanazi AVMA İlkelerine göre: 2013 Edition ¹⁰ (hayvanların görüntüleri deneyler ve kullanım onaylı ve Faculdade de Odontología de Bauru, USP Hayvan Bakım Komitesi kurallarına uygun olarak yapılmıştır). % 70 etanol alkol ile tüm fare temizlemek, hayvanlar taşıma için kullanılan bir biyolojik güvenlik kabini içinde.
2. Tarsal eklem distalinde hemostatik forseps kullanarak arka pençe tutun. Forseps altında makas ile pençe kesin ve 20 dakika boyunca 2% iyot pençe bırakın. Ardından, diğer arka pençe için prosedürü tekrarlayın.
3. Bir için pençeleri transferfazla çalışma için temiz biyolojik güvenlik kabini. ,% 2 iyot üzerinden pençelerini steril gazlı bez ile kurulayın ve ardından kemiğe yakın tüm yumuşak doku (dermis, epidermis tendonlar ve sinirler) kaldırarak, sayı 22 veya 23 neşter bıçak kullanarak iki ayak pedleri toplamak. Metatarsalların kemikleri ve 1 ve 5. parmak kemikleri çıkarın. Steril bir Petri tabağına yerleştirin malzeme ve bisturi bıçağı ile kazınmasıyla, epidermis çıkarın. Makasla küçük parçalar halinde doku kesilir ve yuvarlak alt tüp aktarabilirsiniz. Ağırlık doku ve Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde 1 ml. Numunenin ısınma önlemek için buz üzerinde tüp tutun.
4. HBSS başka bir 1 ml ilave edilir ve bir doku homojenleştirici kullanılarak örnek homojenleştirin.
   1. İlk homojenizasyon döngüsü: hız 4 (14,450 rpm) 15 saniye 3 bakliyat.
   2. Kalan enkaz ortadan kaldırmak için bir hücre süzgecinden geçirmeden, steril bir 50 ml konik bir tüp süpernatantı aktarın. Çözüm gra geçmesine izinvity.
   3. HBSS'nin ek 2 ml ekleyin ve homojenizasyon döngüsü (Bölüm 1.4.1) tekrar ve tekrar hücre süzgecinden örnekleri geçmektedir.
   4. 9 ml hacim getirmek için HBSS ekleyerek süzgeç durulayın. Hücre süzgeç atın.
5. % 0.5 tripsin çözeltisi bir kısım çözülme. A bir nihai konsantrasyonu,% 0.05 tripsin elde edilmesi için hücre süspansiyonu 9 ml tripsin 1 ml ilave edilir. Kalan çözülmüş tripsin atın. Bir 37 ° C su banyosu içinde 60 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tripsin sulandırmak için steril tuzlu su eklenmesi ile 40 ml hacmi getirmek.
6. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 1700 x g'de santrifüje
7. Dikkatli Tersine tüp süpernatant atın. Tüpü dokunarak pelletini ve daha sonra steril tuz 1 ml. Süspansiyonun (doku verim / gram hesaplamak için) ve son hacim ölçen yeni bir konik tüp süspansiyon aktarın.
8. 1 m kullanarak basil süspansiyon homojenleştirinizbir 26 G iğne ile l insülin şırınga yeni bir tüpe transfer süspansiyon ise.
9. Her bir ortamda bunu 2 damla (50 ul) yerleştirilmesi ile süspansiyondan mikrobiyolojik kontrol yapın: 7H9 ve Lowenstein-Jensen, orta ve mikobakteriler kirletici tespiti için, 30 gün boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Benzer şekilde, bir Beyin Kalp İnfüzyon (BHI) inoküle orta ve aerobik bakteriler kirletici saptanması için, 37 ° C'de 24 saat boyunca inkübe edilir.
10. Boyama için tüpler içine süspansiyon tümbölen: Soğuk Ziehl-Neelsen boyama (Protokol 2) için 35 ul ve canlılığı belirlenmesi (Protokolü 3) 200 ul.
11. Ziehl-Neelsen boyama (ZN) sonra, asit dirençli basil / ml (AFB / ml) sayısını hesaplamak. Çıplak fareler aşılaması için, 1 x 10 ⁸ AFB / ml süspansiyon hazırlamak; 30 ul / haydut / hayvan (Protokol 5) aşılamak için yeterli hacme sahip emin olun, ve aşılama kadar süspansiyon soğuk tutmak. Dondurma için, 1 x 10 ⁷ AFB / ml sus hazırlamakemeklilik (Protokolü 4).

2. Soğuk Ziehl-Neelsen Boyama

1. Boyama başlamadan önce, serum / fenol çözeltisi ve ZN boyama çözüm hazırlanması (reaktiflerin Protocol - Protokoller 4 ve 5). Bir immünhistokimya kalem kullanarak üç cam slaytlar üzerine üç daire (iç çapı 10 mm) çizin. (1) normal veya sulandırılmamış, (2) 1:10, ve (3) 1:100 sayı 2 kalem (Not: bazı grafit ZN boyama sonra kapalı kaybolur) kullanılarak: slaytlar tanımlayın.
2. 01:10 ve 1:100 seri seyreltileri için basil süspansiyonu (1,10 Aşama) seyreltin, yani seyreltilmemiş süspansiyonunun 5 ul ve 45 ul tuzlu su eklemek, daha sonra 01:10 5 ul almak ve tuzlu su için 45 ul ekle.
3. Serum / fenol çözeltisi 5 ul ve daire başına basil süspansiyonu 10 ul ekle. Homojenize ve atılabilir bir döngünün saplı dairenin alanı çevresinde yayılır. Süspansiyon bir tesviye masaya kuruması için bekleyin.
4. Gün sonrarying, bir Bunsen beki (yaklaşık 20 sn toplam) ¹¹ mavi ateşte slayt 3 kez geçirerek smear düzeltmek.
5. Boyama için, 20 dakika boyunca, süzüldü Ziehl-Neelsen carbofuchsine (yaklaşık 5 mi) ile sürgünün tüm yüzeyini kapsamaktadır.
6. Su (yavaş akım) çalışan slayt durulayın.
7. 20 saniye için% 10 asit ile alkol solüsyonu slayt örtün.
8. Akan su içinde yeniden slayt yıkayın.
9. 5 dakika boyunca bir metilen mavisi çözeltisi ile slayt örtün.
10. Akar su slayt durulayın ve oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
11. Bir 100X immersiyon yağı hedefi kullanılarak 20 alan / daire (toplam 60 alan / slayt) saymak. Aşağıdaki gibi asit hızlı basil / ml (AFB / ml) 'nin hesaplanması için ¹² Lepra Laboratory Techniques in açıklamasına göre yapılır:
    AFB / alan = 60 bölü 3 çevrelerinde (60 alanlar) bulunan basil sayısı.
    AFB / ml = AFB / alan x sabit dairenin (bölgex 100) objektif lens açıklığı alanına bölünmesi ve seyreltilmiş bir süspansiyon sayımı kullanılırsa, seyreltme faktörü (10 veya 100) ile AFB / ml sayısını çarpın.

3. Canlılık Belirlenmesi

1. Başlamadan önce, otoklav M. hazırlamak lepra süspansiyon (reaktiflerin Protokol - Protokol 7). M. kalitatif tayini için uygun kiti (reaktifler ve ekipman tabloya bakınız) kullanın süspansiyon içinde leprae mevcudiyetini göstermektedir. Aşağıdaki gibi (tüm işlemler loş ışık altında yapılmalıdır) seyreltilmiş solüsyonları,:, tuzlu su içinde 10 kat (1 ul stok artı 9 ul tuzlu su) çözeltisi ile seyreltik tuzlu su içinde bir faktör ile B solüsyonu 20 seyreltilmiş (1 ul stok ayrıca 19 ul tuzlu su).
2. Test edilecek olan basil süspansiyon (aşama 1.10) 200 ul seyreltilmiş çözelti A 3.6 ul seyreltilmiş ve çözelti B 6 ul ekleyin. Önceden otoklavlanmış M. leprae rutin bir süspansiyon olarak kullanılırgeçerlilik boyaması için egative kontrolü.
3. Karanlıkta, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin süspansiyonlar.
4. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 10,600 x g'de santrifüje tüp
5. Süpernatant atılır ve% 10 gliserol içinde 15 ul pelletini. Temiz bir cam slayt yüzeyine 8 ul uygulayın ve küçük bir kapak kayma ile örtün. (Moleküler Problar öneriler bakınız) uygun filtreler içeren bir floresan mikroskop kullanılarak slayt analiz edin. Iyodür (PI) boyama Propidium için boyama Syto 9 (Sy) karşılaştırarak sonuçlarını değerlendirin.
   Not: Sy leke hem de ölü ve canlı bakterilerin% 100 nüfuz ve PI leke hasarlı zarları ile sadece bakterileri nüfuz eder. Süspansiyon otoklav (negatif kontrol) hücre enkaz varlığı nedeniyle bakteri kümeleri oluşabilir. Ölü / canlı değerlendirilmesi için kullanılan yarı-kantitatif cetvel 0 ila 2 arasında değişir +, 0, hücrelerin en az% 30 PI boyama için pozitif olduğunu göstermektedir; 1 + 30 arasında demektir -Hücrelerin% 50 PI leke için pozitif olan, 2 + hücrelerin% 50'den fazla PI boyama için pozitif olduğu anlamına gelir. 0 puan kullanım için, en uygun olarak kabul edilir.

4. Donma / çözülme M. lepra Süspansiyon

1. Başlamadan önce, dondurma orta (- Protokol 6 reaktiflerin Protokolü) hazırlar. Dondurma için, aşağıda açıklanan adımları kullanın:
   1. Ihtiva eden bir süspansiyon, 150 ul 1 x 10 ⁷ orta dondurma 1 ml ile birlikte steril cryovial ml AFB /.
   2. Dondurucu bir kap içinde cryovial koyun ve 24 saat boyunca -80 ° C 'de kabı saklayın.
   3. Bir saklama kutusu için dondurulmuş flakon aktarın ve -80 ° C'de saklayın
2. Çözündürmek için, aşağıda açıklanan adımları kullanın:
   1. -80 ° C donmuş süspansiyon ile dondurarak saklamaya uygun vialler çıkarın ve süspansiyonun çözülmesi başlatmak için bir 37 ° C su banyosu içine koyun.
   2. Steril 20 ml tüp ihtiva eden bir süspansiyon içine döküntuzlu su. Çözülme tamamlanıncaya kadar yavaşça süspansiyon karıştırın.
   3. 4 ° C'de, 1,700 x g, 30 dakika boyunca bir süspansiyon santrifüj
   4. Süpernatantı atın ve istenilen hacme ulaşmak için yeterli steril tuzlu su ekleyin. Bir şırıngaya (aşama 1,8) geçirilerek süspansiyon homojenize.
   5. ZN boyama, canlılık tespiti ve aşılama için, Protokolleri 2, 3 ve 5 izleyin.

5. Fare aşılama

1. İki kişi bu işlem için gerekli olan, bir inokulum yönetmek için fare ve başka dizginlemek için. Inoküle edilecek hayvan etik kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak ele alınmalıdır ve bütün prosedürler, kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı komitesi tarafından onaylanmış olmalıdır. Pençeleri yukarı bakacak şekilde boynun ense tarafından çıplak fare kısıtlamaktadır.
2. Bir 26 G iğne içinden geçirilerek süspansiyon homojenize. İnoküla için 1 ml şırınga ile, aspire yeterli basilli süspansiyonte, iki ayak tabanları (30 ul / ayak tabanı).
3. , Arka pençe tutun enjeksiyondan önce% 70 etanol alkol ile ayak desteği temizlemek ve iğne konik iğne intradermal tanıtmak proksimal patinin uzak tarafına, işaret etti. Süspansiyonun 30 ul enjekte edilir. Enjeksiyon ayak tabanı, anestezi uygulanmış farelerde gerçekleştirilebilir.
4. Inokulum reflü önlemek için deriden iğne çekilmeden önce 5 saniye bekleyin. Fareler yumuşak yataklar Aşıdan üzerinde muhafaza edilmelidir ve ambulasyon ve kendini yaralama işaretler izlenmelidir.

Sonuçlar

Protokolün başarısı üç şekilde değerlendirilebilir. İlk olarak, aşı kalitesinin değerlendirilmesi hücresel atıkların miktarı ve son süspansiyon uygun bir basilinin edilen yüzde (Protokol 3 bak) ile tespit edilir. Şekiller 1 ve 2'de gösterildiği gibi, nihai süspansiyon, basil çok az hücre artıkları ve yüksek canlılığı (+ 0 puan) içerdiği, en çok basiller Syto 9 yeşil floresan boya (leke ölü ve canlı bakteri hem de 100 ile boyanan% nüfuz unutmayın Şekil 1) ve kırmızı PI floresan boya (leke hasarlı membran, Şekil 2) ile, sadece bakteri nüfuz ile boyanmış sadece birkaç basiller.

Şekil 1. Syto 9 boyama M. leprae süspansiyon. Yeşil flüoresan canlı ve ölü M. varlığını gösterir lepra. 400X.

Şekil 2. M. PI boyama Ölü M. az sayıda gösteren lepra süspansiyon. Kırmızı floresan lepra. 400X.

Video (Protokol 1) gösterildiği gibi ikinci, yüksek canlılığı ile aşılama, bariz makroskobik lezyon gelişimi ile, 4-5 ay sonrası aşılamadan sonra hayvanların ayaklarından basilinin çoğalması etkileyecektir. Protokolünün başarısını değerlendirmek için üçüncü yol (Protokolü 4 bakınız) farklı dönemler için dondurulmuş olmuştu basili ile aşılanmış fare ayaklarından AFB hayatta kalmasını ve çoğalmasını değerlendirilmesi gereğidir.

"Cellspacing =" 0 "> Deney (hayvan) 0. günde AFB / ml dondurulmuş Sayısı Canlılık puan / gün 0 Donma dönemi (gün) Dondurma sonra aşılanmış AFB sayısı Dondurma sonra Canlılık puan 7 ay sonra geri kazanılan AFB / ml sayısı 1 (1) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 60 1.7 x 10 ⁵ 1 + 2.3 x 10 ⁸ 1 (2) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 60 1.7 x 10 ⁵ 1 + 3.8 x 10 ⁷ 1 (3) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 60 1.7 x 10 ⁵ 1 + 8.5 x 10 ⁷ 1 (4) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 60 1.7 x 10 ⁵ 1 + 4.6 x 10 ⁷ 2 (1) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 15 4.2 x 10 ⁵ 1 + 1.7 x 10 ⁷ 2 (2) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 15 4.2 x 10 ⁵ 1 + 4.8 x 10 ⁶ 2 (3) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 15 4.2 x 10 ⁵ 1 + 8.6 x 10 ⁶ 3 (1) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 15 1.7 x 10 ⁵ 1 + 1.2 x 10 ⁷ 3 (2) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 15 1.7 x 10 ⁵ 1 + 1.8 x 10 ⁷ 3 (3) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 15 1.7 x 10 ⁵ 1 + 1.8 x 10 ⁷ 3 (4) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 15 1.7 x 10 ⁵ 1 + 2.6 x 10 ⁷ 3 (5) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 15 1.7 x 10 ⁵ 1 + 3.7 x 10 ⁶

Tablo 1. M. Sonuçlar Mesajı donma süspansiyonlar kullanılarak lepra çarpma.

Tablo 1 sonuçları göstermektedir M. dondurma işleminden sonra süspansiyon kullanılarak leprae büyümesi. Çözündükten sonra süspansiyonlarının yaşayabilirliği skoru 1 + idi. Donma protokolü farklı donma süreleri test etmek için üç bağımsız deneyde de gerçekleştirilmiştir. 15 ya da 60 gün boyunca dondurulmuş inokulum ile Her iki deneyde de, benzer bir sonuç, s ididondurma işleminin ropagation 10-1,000 kez aşılama (Tablo 1), 7 ay sonra, her patinin geri kazanılan AFB sayısındaki artış elde edilmiştir. Bu nedenle, M. donma OADC (oleik asit-albümin-dekstroz-katalaz) ile takviye edilmiş ortam içinde 7H9 leprae süspansiyonlar canlılığı bakım ile sonuçlanmıştır.

Üç inokulumlar M. değerlendirmek için kullanıldı lepra iki farklı dondurma dönem (15 ve 60 gün sonra) Çarpma. 7 ay sonra, basil aşılanmış farelerin ayak yastıklarından dan elde edildi ve Ziehl-Neelsen boyama sonra sayılır. Yarı niceliksel canlılığı ölçek: 0 anlamına gelir PI boyalı hücrelerin% 30 kadar mevcut değildir; 1 + PI boyalı hücrelerin% 30-50 arasında araç; 2 + PI boyalı hücrelerin% 50 üstünde anlamına gelmektedir. AFB: aside dirençli basil.

Tartışmalar

M. yayılması için iyi gösterildiği üzere, başarılı bir protokol ayrıntılı bir açıklaması leprae büyük ölçüde gereklidir. Bu çalışma, süzme ve tripsin emdirme ile aşı hazırlama protokol uygulanması gibi (+ 0 puan) çok az hücre kalıntıları ve basil yüksek canlılığı ile elde edilmesini sağlar göstermektedir. Sodyum hidroksit basili ⁶ saflaştırılması için doku parçalamak için kullanılmıştır. M. saflaştırılması için sodyum hidroksit kullanılarak laboratuvarımızda yapılan çalışmalarda leprae canlılığı belirlenmesi ve hayvan aşılama (veriler gösterilmemiştir) için süspansiyonun homojenizasyon engelleyici, basil kümeleri oluşumu ile sonuçlanmıştır.

Filtrasyon ve tripsin emdirme ile aşılama hazırlanması ile karşılaşılan potansiyel problemler, bakteriyel veya mantar maddeleri ile inokulum hücre döküntüleri ve kirlenme büyük miktarda bulunur. Durumda, hücre Debr büyük miktarlardasaflaştırmadan sonra gözlenen, ya da tripsin artık aktif ya da biyolojik bir malzeme fazla miktarda var olmasıdır. Tripsin stok çözeltisi enzimatik aktivitesi değerlendirilmelidir. Ilk biyolojik maddenin aşırı miktarda şüphelenildiğinde, malzeme kısma bölünmüş olmalıdır ve protokol ayrı gruplar halinde yapılmalıdır. Bakteriyel veya fungal ajanlarla inokulum kirlenmesini önlemek için, bakım aseptik şartlar altında malzemeyi işlemek için alınmalıdır. Mantar ve / veya bakteriyel kontaminasyon algılanırsa, süspansiyon atılmalıdır.

Bizim protokol bir sınırlama anlatılan yarı-nicel bir yöntem kullanarak canlılığı değerlendirme öznellik olduğunu. Yayımlanmış kantitatif ⁶ daha az hassas olsa da, yarı-nicel değerlendirildi Canlılık, daha pratiktir. 0 + ve 1 + Canlılık puan yayılması ve donma bakımı için tatminkarM. leprae. Lahiri et al. önceden% 80-90 uygun inokulum ile aşılanır çıplak fareler, aşılamadan 4-5 aylıkken (yüksek canlılığı basili) hasat edilmesi için uygun olan ayak yastıklarından neden olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, (4 aylıkken) erken enfeksiyon iyi hasat zamanı. Dondurulmuş inoculum hasat için, mevcut protokolde fareler büyüme eğrileri garanti uzun süre (7 ay) Aşılanan korundu. Yeterli canlılığı sağlamak için kritik bir safha, tercih edilen ana ve işleme biyolojik maddenin toplanmasından sonra 24 saat içinde, taze basili süspansiyonların kullanılmasıdır. Ayrıca, reaktifler kalitesi, taze hazırlanmış seyreltilmiş tripsin ve canlılığı boyama çözeltiler, yeniden üretilebilir sonuçlar garanti etmek için gereklidir.

Bu protokolün diğer bir sınırlama olduğu kesin M. lepra süspansiyon konak DNA, RNA, protein, vb özgür değildir. Bu nedenle, diğer saflaştırma adımları t eklenmelidiro M. elde lepra süspansiyon konakçı hücre bileşenlerinin ücretsiz.

M. bütün doku örnekleri dondurma ile uygun bir basili muhafaza edilmesi için bir yöntem leprae lezyonlar ⁹ bildirilmiştir. Ancak, Portaels ve arkadaşları tarafından çalışma. donma ve M. çözülmeden sonra 65-97% arasında değişen canlılığı ortaya önemli bir kayıp lepra armadillo ⁹ elde edilen doku örnekleri bulaşmış. Bizim protokol göstermiştir ki, M. gözlenen canlılık indeksi (Tablo 1) dondurulmuş olmasaydı kana göre donma ve erime sonrasında leprae süspansiyonlar düştü. Gerçekten de, M. dondurma donma medyada lepra süspansiyon değişen canlılığı vermiştir canlılığı skoru 1 + ile% 50-70, canlılık skoru 0 + donmamış süspansiyon elde iken gelen. Bununla birlikte, M. çarpma lepra (çıplak farelerin 7 ay Aşıdan sonra tatmin oldu Tablo 1). Sulandırılan numuneler ile çıplak farelerin aşı ortalama 100 kat başlangıç ​​inokulum ile karşılaştırıldığında basilinin sayısındaki artış ile sonuçlanmıştır 60 gün boyunca donmuş olarak muhafaza. Öyle görünüyor ki M. dondurma Bunun yerine, enfeksiyon oluşmuş doku örneklerinin dondurma ortamı içinde süspansiyon leprae, daha etkilidir. Bizim protokol kritik bir safha, Colston ve Hilson ⁸ ile gösterildiği gibi basiller uygun bir muhafaza edilmesi için gerekli bir dondurma kaptaki AFB yavaş dondurma, vardır. Gelecek deneyler uzun donma dönemlerinden sonra basilinin canlılığını değerlendirmek için yapılacaktır.

Özet olarak, çünkü M. leprae in vitro uzamadığı, protokol uygun bir aşı bakımı için hızlı ve kolay bir alternatif sağlar, ve başarılı bir dondurma basamağı bu şekilde tanımlanmış suşları-nın bir banka kurulmasını sağlayan, hayvanlarda sürekli geçişi olmayan soylarının bakım mümkün kılar.

Bu bölüm, bu protokolü gerçekleştirmek için reaktiflerin hazırlanması için talimatları içerir.

1.. Tripsin

Tripsin	0.5 g
Damıtılmış su	kadar 100 ml

Filtre sterilize. -20 ° C'de saklayın

2. 7H9

7H9 broth base	4.7 g
% 40 gliserol stok	5 mi
Damıtılmış su	kadar 900 ml

Karıştırılarak su ile temel karışım daha sonra gliserol ekleyin. Sterilize edilmesi için 20 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav. 4 ° C'de saklayın

3. Beyin kalp infüzyon (BHI)

BHI	37 g
Damıtılmış su	1,000 ml

Sterilize edilmesi için 15 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav. 4 ° C'de saklayın

4. Fenol serum

4.1),% 5 fenol

Fenol	5 mi
Damıtılmış su	kadar 100 ml

4.2) Serum fenol

fetal sığır serumu	2 mi
% 5 fenol	98 mi

4 ° C'de saklayın

5. Soğuk Ziehl-Neelsen Lekesi için Çözümler

5.1) CarboFuchsin

Fuchsin	1 g
Fenol kristaller 60 ° C'ye kaynaşık	5 mi
Saf etil alkol	10 mi
Damıtılmış su	kadar 100 ml

Her kullanımdan önce filtre.

5.2) Metilen Mavisi Base

Metilen mavi	3 g
% 95 etil alkol	kadar 200 ml

5.3) Alkol asit

% 70 alkol	990 mi
kloridrik asit	10 mi

6. Donma için Orta:

OADC	10 mi
Gliserin	20 mi
7H9 ortamı	kadar 100 ml

Kullanmadan önce gliserol otoklavlayın ve süzülerek OADC sterilize.

7. Otoklavlanmış M. lepra süspansiyon

20 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav. -20 ° C'de saklayın

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BacLight Bacterial Viability Kit	Invitrogen; Molecular Probes	L7007
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma	H9269
Cryo 1 °C Freezing Container	Nalgene	5100001
Lowenstein-Jensen medium	LB Laborclin	901122
Saline	TEK Nova Inc	S5812
Pen	Dako	S2002
Centrifuge tube 50 ml/conical base	TPP	91050
Cell strainer  - 40 µm Nylon	BD Falcon	352340
Trypsin	Sigma	T-7409
Middlebrook 7H9 Broth Base	Sigma-Aldrich	M0178 Fluka
Glycerol	Gibco BRL	15514011
Brain heart infusion (BHI)	Oxoid LTDA	CM1135
Fuchsin	Merck Millipore	1159370025
Phenol	Invitrogen	15509037
Ethyl alcohol	Merck Millipore	EX02764
Cloridric acid	Merck	1131349010
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase)	Becton Dickinson	211886
Fetal bovine serum	Gibco; LifeTechnologies	26140079