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Mycobacterium leprae, der Erreger der Lepra, wächst nicht in vitro. Wir beschreiben eine einfach zu Protokoll folgen, um eine Suspension herzustellen Bazillen, die Wartung von großen Mengen von M. gewährleisten leprae für eine Vielzahl von Anwendungen. Protokolle für die Vermehrung von Maus Fußballen Impfung, die Bewertung der Rentabilität, Einfrieren und Auftauen bazilläre Lager im Detail beschrieben werden.
Lepra, die durch Mycobacterium leprae verursacht wird, ist eine wichtige Infektionskrankheit, die immer noch endemisch ist in vielen Ländern der Welt, darunter Brasilien. Es gibt derzeit keine bekannten Verfahren zum Züchten von M. leprae in vitro und präsentiert ein großes Hindernis in der Studie des Erregers im Labor. Daher ist die Erhaltung und das Wachstum von M. leprae-Stämme werden vorzugsweise in Nacktmaus (NU-Foxn1 nu) durchgeführt. Die Laborbedingungen unter Verwendung von Mäusen sind leicht zugänglich, einfach durchzuführen und ermöglicht die Standardisierung und Entwicklung von Protokollen zur Erzielung reproduzierbarer Ergebnisse. In dem vorliegenden Bericht beschreiben wir ein einfaches Protokoll für die Reinigung von Bazillen von Nacktmaus Fußballen unter Verwendung von Trypsin, die eine Suspension mit minimalem Zelltrümmer und mit hoher Lebensfähigkeit der Bakterien-Index ergibt, wie durch Fluoreszenzmikroskopie bestimmt. Eine Änderung der Standardmethode für bazilläre Zählen von Ziehl-NeelsenFärbung und Lichtmikroskopie wird auch demonstriert. Zusätzlich beschreiben wir ein Protokoll zum Einfrieren und Auftauen bacillary Bestände als alternatives Protokoll für die Wartung und Lagerung von M. leprae-Stämme.
Lepra, eine Krankheit, die durch Mycobacterium leprae verursacht wird, ist ein wichtiges Problem der öffentlichen Gesundheit in vielen Ländern auf der ganzen Welt 1,2. Obwohl es als eine Infektionskrankheit, die sowohl Haut-und peripheren Nerven wirkt bekannt, gibt es noch einige Lücken im Wissen über die Mechanismen in der komplexen Immunpathogenese der Erkrankung beteiligt sind.
Unter den herausfordernden Eigenschaften von M. leprae, der seine Studie behindern seiner Unfähigkeit, in künstlichen Nährmedien und seine relativ lange Verdopplungszeit (ca. 14 Tage) 3,4 wachsen. Die meisten experimentellen Verfahren, die M. benutzen leprae sind mit Bazillen von Hautläsionen der Lepra-Patienten oder von experimentellen Tiermodellen, wie Gürteltiere und verschiedene Stämme von Mäusen 5,6 gereinigt eingestellt.
Seit vielen Jahren haben die Forscher auf die Reinigung von M. hing leprae von Hautläsionen der multibacillary LEPRosy Patienten für den Einsatz in experimentellen Verfahren. Mehrere Laborbedingungen für die in vitro-Kultivierung oder Wartung von lebenden M. leprae sind versucht worden, aber bis heute haben Tiermodellen erwiesen sich als am besten geeignet für Forschungszwecke. In den 1960er und 1970er Jahren begannen die Forscher mit Mäusen und Gürteltiere zur Erfassung und Bewertung von M. leprae Lebensfähigkeit Überwachen bakteriellen Wachstums in Reaktion auf Anti-M. leprae Drogen und das Wachstum und die Pflege von mycobakteriellen Stämmen 2,4.
Die Tiermodelle haben einige Einschränkungen, vor allem in Gürteltiere und nicht-menschlichen Primaten, einschließlich des ethischen Bedenken, Kosten für Wartung, besondere Infrastruktur für die Tierwartungsaufwand und schlechte Reproduzierbarkeit der Ergebnisse und Abschluss Erträge. Derzeit sind Mäuse die bevorzugte Tiermodell für Lepra-Forschung. Die Laborbedingungen unter Verwendung von Mäusen sind leicht zugänglich, leicht durchzuführen, und für einen standardisierten Protokollen 7.8.9. Nacktmäuse wurden in der Wartung von M. verwendet leprae-Stämme, weil auch bei geringen Lasten lebensfähigen Bazillen führt die T-Zell-Immunantwort auf mangelhaft üppigen Granulome und gute bazilläre Multiplikation. So hat dieses Tiermodell breite Akzeptanz in der Lepra-Forschung gewonnen.
In dem vorliegenden Bericht ein einfaches Protokoll zur enzymatischen Reinigung von Bazillen von Nacktmaus Fußballen beschreiben wir, für die Zubereitung eines M. bestimmt leprae Suspension mit minimaler Zelltrümmer und mit hohen Keimfähigkeit Index. Die Tragfähigkeit wird durch Fluoreszenz-Mikroskopie, die sich schnell im Labor durchgeführt werden können, bestimmt. Wir haben auch eine Modifikation der Standard-Methode für bazilläre Zählung durch Kalt Ziehl-Neelsen-Färbung und Lichtmikroskopie zu demonstrieren. Zusätzlich stellen wir ein alternatives Protokoll für die Wartung und Lagerung von M. leprae-Stämme, so dass Einfrieren und Auftauen von bazilläre stocks.
1. Herstellung von Mycobacterium leprae Hänge
2. Kalte Ziehl-Neelsen-Färbung
3. Lebensfähigkeit
4. Einfrieren / Auftauen M. leprae Hänge
5. Maus-Impfung
Der Erfolg des Protokolls kann auf drei Arten bewertet werden. Zuerst wird Bewertung der Qualität des Inokulums durch die Menge der Zelltrümmer und die resultierende Prozentsatz der lebensfähigen Bazillen in der endgültigen Suspension (siehe Protokoll Nr. 3) bestimmt. Wie in den 1 und 2 gezeigt, der letzte bazilläre Suspension enthalten sehr wenig Zelltrümmer und hohe Rentabilität (Score 0 +), beachten Sie, dass die meisten Bazillen mit dem Syto 9 grün fluoreszierenden Fleck (Fleck eindringt 100% der beiden tot und lebendig Bakterien befleckt, Figur 1) und ist nur wenige Bazillen mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff PI (Fleck dringt nur Bakterien mit beschädigten Membranen, Fig. 2) gefärbt.
Fig. 1 ist. Syto 9 Anfärbung M. leprae Federung. Grüne Fluoreszenz zeigt die Anwesenheit von lebendig und tot M. leprae. 400X.
2. PI-Färbung von M. leprae Federung. Rote Fluoreszenz, die die kleine Zahl der Toten M. leprae. 400X.
Zweitens wird ein Inokulum mit hoher Rentabilität auf die Vermehrung der Bazillen in die Fußballen der Tiere nach 4-5 Monaten nach der Impfung beeinflussen, mit der Entwicklung von der Hand makroskopische Läsion, wie in dem Video (Protokoll 1). Der dritte Weg, um den Erfolg des Protokolls zu beurteilen ist durch die Auswertung der Überlebensrate und die Vermehrung von AFB in Maus-Straßenräuber mit Bazillen, die für verschiedene Zeiträume eingefroren worden war, angeimpft (siehe Protokoll Nr. 4).
"Cellspacing =" 0 "> Experiment (Tier) Anzahl der AFB / ml eingefroren am Tag 0 Die Lebensfähigkeit Punktzahl / Tag 0 Einfrieren Zeit (Tage) Anzahl der AFB nach dem Einfrieren geimpft Die Lebensfähigkeit Punktzahl nach dem Einfrieren Anzahl der AFB / ml nach 7 Monaten wieder 1 (1) 1,0 x 10 7 0 + 60 1,7 x 10 5 1 + 2,3 x 10 8 1 (2) 1,0 x 10 7 0 + 60 1,7 x 10 5 1 + 3,8 x 10 7 1 (3) 1,0 x 10 7 0 + 60 1,7 x 10 5 1 + 8,5 x 10 7 1 (4) 1,0 x 10 7 0 + 60 1,7 x 10 5 1 + 4,6 x 10 7 2 (1) 1,0 x 10 7 0 + 15 4,2 x 10 5 1 + 1,7 x 10 7 2 (2) 1,0 x 10 7 0 + 15 4,2 x 10 5 1 + 4,8 x 10 6 2 (3) 1,0 x 10 7 0 + 15 4,2 x 10 5 1 + 8,6 x 10 6 3 (1) 1,0 x 10 7 0 + 15 1,7 x 10 5 1 + 1,2 x 10 7 3 (2) 1,0 x 10 7 0 + 15 1,7 x 10 5 1 + 1,8 x 10 7 3 (3) 1,0 x 10 7 0 + 15 1,7 x 10 5 1 + 1,8 x 10 7 3 (4) 1,0 x 10 7 0 + 15 1,7 x 10 5 1 + 2,6 x 10 7 3 (5) 1,0 x 10 7 0 + 15 1,7 x 10 5 1 + 3,7 x 10 6Tabelle 1. Ergebnisse von M. leprae Multiplikation mit Post Einfrieren Suspensionen.
Tabelle 1 zeigt Ergebnisse der M. leprae Wachstum mit Suspensionen nach dem Einfrieren. Die Lebensfähigkeit Punktzahl der Suspensionen nach dem Auftauen war 1 +. Das Gefrierprotokoll wurde in drei unabhängigen Experimenten durchgeführt, um die unterschiedliche Gefrierzeiten testen. In beiden Experimenten mit Inokula für 15 oder 60 Tage eingefroren, das Ergebnis war ähnlich, S.ropagation nach Einfrieren ergab 10-1000 Zeiten erhöhen die Zahl der AFB erholte sich von jedem Fußballen nach 7 Monaten der Inokulation (Tabelle 1). Daher das Einfrieren von M. leprae Suspensionen in 7H9-Medium mit OADC (Ölsäure-Albumin-Dextrose-Katalase) ergänzt führte Wartung der Lebensfähigkeit.
Drei Inokula wurden verwendet, um M. zu bewerten leprae Multiplikation nach zwei verschiedenen Gefrierzeiten (15 und 60 Tage). Nach 7 Monaten wurden Bazillen aus Fußballen von Mäusen geimpft erholt und nach Ziehl-Neelsen-Färbung gezählt. Semiquantitative Lebensfähigkeit Skala: 0 bedeutet bis zu 30% der PI-gefärbten Zellen fehlt; 1 + Mittel zwischen 30-50% der PI-gefärbten Zellen, 2 + bedeutet, über 50% der PI-gefärbten Zellen. AFB: säurefesten Stäbchen.
Eine detaillierte Beschreibung eines gut veranschaulicht, erfolgreiche Protokoll für die Vermehrung von M. leprae wird dringend benötigt. Unsere Studie zeigt, dass das Protokoll von Inokulumzubereitung durch Filtration und Trypsin Verdauung kann der Inokula mit sehr kleinen Zelltrümmer und mit hoher Rentabilität von Bazillen erhalten (Score 0 +) werden. Natriumhydroxid wurde verwendet, um das Gewebe für die Reinigung von Bazillen 6 disaggregieren. Studien in unserem Labor mit Natronlauge zur Reinigung von M. durchgeführt leprae führte zur Bildung von Klumpen von Bazillen, behindern die Homogenisierung der Suspension für die Lebensfähigkeit und Tierimpfung (Daten nicht gezeigt).
Potenzielle Probleme mit der Inokulumzubereitung durch Filtration und Trypsin Verdauung angetroffen umfassen große Menge Zelltrümmer und Verunreinigungen des Inokulums mit bakteriellen oder Pilzmittel. Bei großen Mengen von Zell DEBRist, werden nach der Reinigung beobachtet, entweder Trypsin nicht mehr aktiv ist, oder es ist eine übermäßige Menge an biologischem Material. Die enzymatische Aktivität der Trypsin-Stammlösung ausgewertet werden. Wenn übermäßige Menge der ursprünglichen biologischen Material vermutet wird, sollte das Material aliquotiert werden und das Protokoll sollte in getrennten Ansätzen durchgeführt werden. Um eine Kontamination des Inokulums mit bakteriellen oder Pilzmittel zu vermeiden, muss darauf geachtet werden, das Material unter sterilen Bedingungen verarbeitet werden. Wenn Pilz-und / oder bakteriellen Kontamination festgestellt werden, sollten die Suspension verworfen werden.
Eine Begrenzung der Protokoll die Subjektivität der Lebensfähigkeit Auswertung unter Verwendung der beschriebenen halbquantitativen Methode. Die Lebensfähigkeit semi-quantitativ bewertet ist praktischer, wenn auch weniger präzise als die quantitative Methode 6 veröffentlicht. Die Lebensfähigkeit Bewertung von 0 + und 1 + zufriedenstellend sind für die Instandhaltung der Ausbreitung und das Einfrieren vonM. leprae. Lahiri et al. haben bereits gezeigt, dass Nacktmäusen mit 80-90% lebensfähig Impfstoff geimpft, führen zu Straßenräuber geeignet für die Ernte (hohe Lebensfähigkeit Bazillen) bei 4-5 Monaten der Impfung. Daher ist eine frühe Infektion (ca. 4 Monate) die beste Erntezeit. Für die Ernte von gefrorenen Inokula wurden die Mäuse in der vorliegenden Protokoll geimpften für längere Zeit (7 Monate) auf Wachstumskurven garantieren gehalten. Ein kritischer Schritt, um eine ausreichende Tragfähigkeit zu gewährleisten, ist die Verwendung von frischen Bazillen Suspensionen, vorzugsweise innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme von biologischem Material von dem Host und Verarbeitung. Außerdem Qualität der Reagenzien, frisch zubereitete verdünnten Trypsin und Lebensfähigkeit Färbelösungen, sind notwendig, um reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten.
Eine weitere Einschränkung dieses Protokolls ist, daß die endgültige M. leprae Federung ist nicht frei von Wirts-DNA-, RNA-, Protein-, etc. Daher müssen andere Reinigungsschritte hinzugefügt werden to erhalten eine M. leprae Suspension frei von Wirtszellkomponenten.
Verfahren zum Aufrechterhalten einer lebensfähigen Bazillen durch Einfrieren gesamten Gewebeproben von M. leprae Läsionen berichtet worden 9. Allerdings ist die Studie von Portaels et al. zeigten einen signifikanten Verlust der Lebensfähigkeit, die zwischen 65-97% nach dem Einfrieren und Auftauen von M. leprae infiziert Gewebeproben von Gürteltier 9 erhalten. Unser Protokoll gezeigt, dass die in M. beobachtet Lebensfähigkeit Index leprae Suspensionen nach Einfrieren und Auftauen fallen im Vergleich zu den Aliquots, die nicht fixiert (Tabelle 1) war. In der Tat, das Einfrieren des M. leprae Suspension in gefrierenden Medien ergab Lebensfähigkeit von 50-70%, mit Lebensfähigkeit Score 1 +, während die Lebensfähigkeit Punktzahl 0 + wurde in der nicht gefrorenen Suspension erhalten. Dennoch ist die Vermehrung von M. leprae war nach 7 Monaten nach der Inokulation von Nacktmäusen befriedigend ( Tabelle 1). Die Inokulation von Nacktmäusen mit rekonstituierten Proben gehalten für 60 Tage führte zu mittleren 100fache Erhöhung der Anzahl von Bazillen im Vergleich zum ursprünglichen Inokulum eingefroren. Es scheint, dass das Einfrieren des M. leprae Suspension in Gefriermedium anstelle der infizierten Gewebeproben, ist effizienter. Ein entscheidender Schritt unseres Protokolls ist die langsame Einfrieren der AFB in einem Gefrierbehälter notwendig, die Bazillen lebensfähig zu halten, wie von Colston Hilson und 8 demonstriert. Zukünftige Experimente werden durchgeführt, um die Lebensfähigkeit der Bazillen nach längeren Perioden Einfrieren zu beurteilen.
Zusammenfassend, weil M. leprae nicht in vitro wachsen, ermöglicht unser Protokoll für eine schnelle und einfache Alternative für die Wartung von lebensfähigen Impfstoff, und die erfolgreiche Gefrierschritt ermöglicht die Wartung von Stämmen ohne kontinuierliche Durchgang bei Tieren, so dass die Gründung einer Bank von definierten Stämmen.
Dieser Abschnitt enthält Anweisungen für die Vorbereitung Reagenzien dieses Protokoll durchzuführen.
1. Trypsin
Trypsin | 0,5 g |
Destilliertes Wasser | auf 100 ml |
Filter zu sterilisieren. Lagerung bei -20 ° C.
2. 7H9
7H9-Bouillon-Basis | 4,7 g |
40% Glycerin Lager | 5 ml |
Destilliertes Wasser | bis zu 900 ml |
Mischen Sie den Boden mit Wasser, dann fügen Sie die Glycerin unter Rühren. Autoklaven bei 121 ° C für 20 min sterilisiert. Lagern bei 4 ° C
3. Hirn-Herz-Infusion (BHI)
BHI | 37 g |
Destilliertes Wasser | bis zu 1000 ml |
Autoklaven bei 121 ° C für 15 min sterilisiert. Lagern bei 4 ° C
4. Phenol Serum
4.1) 5% Phenol
Phenol | 5 ml |
Destilliertes Wasser | auf 100 ml |
4.2) Serum Phenol
fötales Rinderserum | 2 ml |
5% Phenol | 98 ml |
Lagern bei 4 ° C
5. Lösungen für kalte Ziehl-Neelsen-Stain
5.1) CarboFuchsin
Fuchsin | 1 g |
Phenol Kristallen auf 60 ° C geschmolzen | 5 ml |
Reinem Äthylalkohol | 10 ml |
Destilliertes Wasser | auf 100 ml |
Filter vor jedem Gebrauch.
5.2) Methylenblau Basis
Methylenblau | 3 g |
95% Ethylalkohol | bis zu 200 ml |
5.3) Alkohol-Säure
70% Alkohol | 990 ml |
aus Chlor | 10 ml |
6. Medium zum Einfrieren:
OADC | 10 ml |
Glycerol | 20 ml |
7H9 Medium | auf 100 ml |
Autoklav Glycerin vor dem Gebrauch und sterilisieren OADC durch Filtration.
7. Autoklaviert M. leprae Suspension
Autoklaven bei 121 ° C für 20 min. Lagerung bei -20 ° C.
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Wir danken Beatriz GC Sartori, Lazara M. Trino, Ana Elisa Fusaro und Claudia Carvalho Uhr für die technische Hilfe. Wir danken Pranab K. Das für die Unterstützung der Errichtung des Tieranlage. Wir danken Lais RR Costa für die Überarbeitung des Manuskripts. Diese Studie wurde durch Zuschüsse aus Fundação Paulista contra Hanseníase Fundação de Amparo und à Pesquisa unterstützt tun Estado de São Paulo (FAPESP 2009/06122-5).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
BacLight Bacterial Viability Kit | Invitrogen; Molecular Probes | L7007 | |
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma | H9269 | |
Cryo 1 °C Freezing Container | Nalgene | 5100001 | |
Lowenstein-Jensen medium | LB Laborclin | 901122 | |
Saline | TEK Nova Inc | S5812 | |
Pen | Dako | S2002 | |
Centrifuge tube 50 ml/conical base | TPP | 91050 | |
Cell strainer - 40 µm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
Trypsin | Sigma | T-7409 | |
Middlebrook 7H9 Broth Base | Sigma-Aldrich | M0178 Fluka | |
Glycerol | Gibco BRL | 15514011 | |
Brain heart infusion (BHI) | Oxoid LTDA | CM1135 | |
Fuchsin | Merck Millipore | 1159370025 | |
Phenol | Invitrogen | 15509037 | |
Ethyl alcohol | Merck Millipore | EX02764 | |
Cloridric acid | Merck | 1131349010 | |
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase) | Becton Dickinson | 211886 | |
Fetal bovine serum | Gibco; LifeTechnologies | 26140079 |
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