Protocolos otimizados para<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt; Gestão de Strain: congelada Stock Preservação e Manutenção em atímicos Nudez Ratos

Resumo

Mycobacterium leprae, o agente causador da lepra, não crescem in vitro. Nós descrevemos um fácil de seguir o protocolo para preparar uma suspensão bacilar para garantir a manutenção de grandes quantidades de M. leprae para uma variedade de aplicações. Protocolos para propagação por rato inoculação pata, avaliação de viabilidade, congelamento e descongelamento estoque bacilar são descritos em detalhes.

Resumo

A hanseníase, causada pelo Mycobacterium leprae, é uma doença infecciosa importante que ainda é endêmica em muitos países ao redor do mundo, incluindo o Brasil. Atualmente não há métodos conhecidos para o cultivo de M. leprae in vitro, apresentando um obstáculo importante no estudo do patógeno no laboratório. Portanto, a manutenção eo crescimento de M. estirpes leprae são preferencialmente realizados em ratinhos nus atímicos (NU-Foxn1 ^nu). As condições de laboratório para a utilização de ratinhos estão facilmente disponíveis, fáceis de realizar, e permitir a normalização e desenvolvimento de protocolos para a obtenção de resultados reprodutíveis. No presente relatório, nós descrevemos um protocolo simples para a purificação de bacilos de coxins de nudez do mouse usando tripsina, que rende uma suspensão de detritos mínimo celular e com alto índice de viabilidade bacteriana, conforme determinado por microscopia fluorescente. Uma modificação do método padrão para a contagem bacilar por Ziehl-Neelsena coloração e microscopia de luz é também demonstrada. Além disso, nós descrevemos um protocolo para o congelamento e descongelamento estoques bacilar como um protocolo alternativo para a manutenção e armazenamento de M. estirpes leprae.

Introdução

A hanseníase, causada pelo Mycobacterium leprae, é um importante problema de saúde pública em muitos países em todo o mundo ^1,2. Apesar de ser conhecida como uma doença infecciosa que afeta a pele e nervos periféricos, ainda existem várias lacunas no conhecimento sobre os mecanismos envolvidos na imunopatogênese complexo da doença.

Entre as características desafiadoras da M. leprae, que impedem o seu estudo são a sua incapacidade para crescer num meio de cultura artificial e o seu tempo relativamente longo (de duplicação de aproximadamente 14 dias) ^3,4. A maioria dos procedimentos experimentais que utilizam M. leprae são configurados com bacilos purificadas de lesões de pele de pacientes com hanseníase ou a partir de modelos animais experimentais, como tatus e várias linhagens de camundongos ^5,6.

Por muitos anos, os investigadores têm dependido de purificação de M. leprae a partir de lesões cutâneas de LEPR multibacilarpacientes osy para utilização em procedimentos experimentais. Várias condições de laboratório para o cultivo in vitro ou a manutenção de ao vivo M. leprae foram tentadas, mas até à data, modelos animais têm provado ser mais adequado para fins de investigação. Nos anos 1960 e 1970, os pesquisadores começaram a usar camundongos e tatus para a detecção e avaliação de M. leprae viabilidade, acompanhamento do crescimento bacteriano em resposta ao anti-M. drogas leprae, e no crescimento e manutenção de estirpes micobacterianas ^2,4.

Os modelos animais têm algumas limitações, especialmente em tatus e primatas não-humanos, incluindo as preocupações éticas, custo de manutenção, infra-estrutura especial necessário para a manutenção de animais e pobre reprodutibilidade dos resultados e rendimentos finais. Atualmente, camundongos são o modelo animal preferido para a pesquisa em hanseníase. As condições de laboratório para a utilização de ratinhos estão facilmente disponíveis, fáceis de realizar, e permitir que os protocolos padronizados ^{7,8,9. Os ratinhos nus foram utilizados na manutenção de M. leprae cepas, porque, mesmo com baixa carga bacilar viáveis, a resposta imune deficiente de células T leva à formação de granuloma exuberante e boa multiplicação bacilar. Assim, este modelo animal ganhou ampla aceitação na comunidade científica lepra.}

No presente relatório, nós descrevemos um protocolo simples para a purificação enzimática de bacilos de coxins de nudez do rato, destina-se a preparação de um M. leprae suspensão com restos celulares mínima e com alto índice de viabilidade bacteriana. A viabilidade é determinado por microscopia de fluorescência, a qual pode ser realizada rapidamente no laboratório. Nós também demonstram uma modificação do método padrão para contagem bacilar pelo frio coloração de Ziehl-Neelsen e microscopia de luz. Além disso, apresentamos um protocolo alternativo para a manutenção e armazenamento de M. cepas leprae, permitindo congelamento e descongelamento de bacilar ruaocks.

Protocolo

1. Preparação da suspensão de Mycobacterium leprae

1. Antes de eutanásia o mouse nu atímico (NU-Foxn1 ^nu), prepare a solução de tripsina e meios de cultura (Protocolo dos reagentes - Protocolos n.os 1, 2 e 3). Eutanásia dos camundongos nu 4-5 meses após a inoculação com M. leprae de acordo com as Diretrizes para a AVMA eutanásia de animais: 2013 Edição ¹⁰ (os experimentos eo uso de imagens de animais foram aprovados e conduzidos de acordo com as diretrizes do Comitê Animal Care da Faculdade de Odontologia de Bauru, USP). Dentro de uma cabine de segurança biológica usada para o tratamento de animais, limpar todo o mouse com álcool a 70% de etanol.
2. Segure a pata traseira com pinça hemostática distais à articulação do tarso. Corte a pata fora com tesoura abaixo a pinça e mergulhe a pata em 2% de iodo por 20 min. Em seguida, repita o procedimento para a outra pata traseira.
3. Transferir as patas de umlimpo cabine de segurança biológica para o trabalho futuro. Tire as patas fora do iodo 2%, seque-os com gaze estéril e depois recolher os dois coxins usando o número 22 ou 23, lâmina de bisturi, removendo todo o tecido mole (derme, epiderme, tendões e nervos) perto do osso. Retire os ossos metatarsos e do 1 º e 5 falanges. Colocar o material numa placa de Petri estéril e remover a epiderme, raspando-o com a lâmina de bisturi. Corte o tecido em pequenos pedaços com uma tesoura e transferi-los para um tubo de fundo redondo. Peso do tecido e adicionar 1 ml de solução salina equilibrada de Hanks (HBSS). Mantenha o tubo em gelo para evitar o aquecimento da amostra.
4. Adicionar mais 1 ml de HBSS e homogeneizar a amostra usando um homogeneizador de tecidos.
   1. Primeiro ciclo de homogeneização: 3 pulsos de 15 segundos na velocidade 4 (14.450 rpm).
   2. Transferir o sobrenadante para um tubo de 50 ml estéril, passando-a através de um filtro de células para eliminar detritos remanescentes. Permitir que a solução passe por gravidade.
   3. Adicionar um adicional de 2 ml de HBSS, e repita o ciclo de homogeneização (Seção 1.4.1), e passar as amostras através do filtro de células novamente.
   4. Lavar o filtro adicionando HBSS para levar o volume a 9 ml. Descarte o filtro de células.
5. Descongelar uma alíquota de solução de tripsina a 0,5%. Adicionar 1 mL de tripsina para os 9 ml de suspensão de células para obter uma concentração de 0,05% de tripsina final. Descarte restante tripsina descongelado. Incubar durante 60 min num banho de água a 37 C °. Após a incubação, levar o volume até 40 ml por adição de solução salina estéril para diluir a tripsina.
6. Centrifugar a 1.700 xg durante 30 min a 4 ° C.
7. Descartar o sobrenadante cuidadosamente, invertendo o tubo. Ressuspender o sedimento tocando no tubo e, em seguida, adicionar 1 ml de solução salina estéril. Transferir a suspensão para um novo tubo cónico de medir o volume final da suspensão (para calcular o rendimento de / grama de tecido).
8. Homogeneizar a suspensão bacilar, utilizando um 1 ml seringa de insulina com uma agulha G 26, enquanto que a transferência da suspensão para um novo tubo.
9. Realizar o controlo microbiológico da suspensão colocando duas gotas (50 ul) de que em cada um dos meios: 7H9 e meio de Lowenstein-Jensen e incubar a 37 ° C durante 30 dias, para a detecção de contaminantes micobactérias. Da mesma forma, inocular um meio de infusão de cérebro e coração (BHI) e incubar durante 24 horas a 37 ° C, para a detecção de contaminação de bactérias aeróbias.
10. Alíquota da suspensão para dentro de tubos para a coloração: 35 ul para a coloração de Ziehl-Neelsen fria (Protocolo 2), e 200 ul para a determinação de viabilidade (Protocolo 3).
11. Depois de Ziehl-Neelsen (ZN), calcular o número de BAAR / ml (AFB / ml). Para inoculação camundongos nu, preparar uma suspensão AFB 1 x 10 ⁸ / ml, certifique-se de ter um volume suficiente para inocular 30 mL / pata / animal (Protocolo 5), e manter o frio suspensão até a inoculação. Para o congelamento, preparar um 1 x 10 ⁷ AFB / ml suspensão (Protocolo 4).

2. Fria Ziehl-Neelsen

1. Antes de iniciar a coloração, preparar a solução de soro / fenol e as soluções de coloração ZN (Protocolo de reagentes - Protocolos 4 e 5). Desenhe três círculos (diâmetro interno 10 mm) em três lâminas de vidro, utilizando uma caneta de imuno-histoquímica. Identificar os slides: (1) normais ou não diluídas, (2) 01:10, e (3) 1:100 usando um lápis número 2 (Nota: alguns grafite desaparece depois de ZN).
2. Dilui-se a suspensão bacilar (Passo 1,10) a 1:10 e 1:100 diluições em série, ou seja, adicionam-se 5 mL de suspensão não diluída e 45 uL de solução salina, em seguida, tomar 5 ul de 1:10 e adicionar 45 ul de solução salina.
3. Adicionar 5 ml da solução de soro / fenol e 10 ul de suspensão bacilar por círculo. Homogeneizar e espalhar uniformemente ao redor da área do círculo com o cabo de uma alça descartável. Espere até que a suspensão a secar sobre uma mesa nivelada.
4. Depois drying, fixar o esfregaço, passando a lâmina três vezes sobre a chama azul de um bico de Bunsen (cerca de 20 seg total) ^11.
5. Para a coloração, cobrir a totalidade da superfície da lâmina com filtrada carbofuchsine de Ziehl-Neelsen (cerca de 5 ml) durante 20 min.
6. Lavar a lâmina em água (fluxo lento) em execução.
7. Cobrir a lâmina com uma solução de álcool a 10% de ácido durante cerca de 20 seg.
8. Lava-se a corrediça de novo em água corrente.
9. Cobrir a lâmina com uma solução de azul de metileno, durante 5 min.
10. Lavar a lâmina em água corrente e deixe secar em temperatura ambiente.
11. Contagem 20 campos / círculo (total 60 campos / slide), utilizando uma objectiva de imersão em óleo 100X. O cálculo do BAAR / ml (AFB / ml) é feito da seguinte forma, de acordo com a descrição no Técnicas de Laboratório para a Hanseníase ^12:
    AFB / campo = número total de bacilos encontrados nos três círculos (60 campos), dividido por 60.
    AFB / ml = AFB / field x constante (área do círculox 100 dividido pela área da abertura da lente da objectiva), e se a contagem de uma suspensão diluída, multiplicar o número de AFB / ml pelo factor de diluição (10 ou 100).

3. Viabilidade Determinação

1. Antes de começar, prepare o M. autoclavado leprae suspensão (Protocolo dos reagentes - Protocolo 7). Utilize o kit correspondente (ver tabela de reagentes e equipamentos) para a determinação qualitativa de M. leprae viabilidade na suspensão. Dilui-se as soluções como se segue (todos os procedimentos devem ser realizados sob luz fraca): diluir a solução A, por um factor de 10 numa solução salina (estoque 1 ul mais 9 ul de solução salina), dilui-se a solução B de 20 por um factor de em solução salina (estoque 1 ul além de 19 ul de solução salina).
2. Adicionar 3,6 ml de solução diluída A e 6 uL de solução diluída de B a 200 ul da suspensão bacilar a ser testado (passo 1.10). A M. previamente autoclavada leprae suspensão é rotineiramente utilizado como umcontrole egative para a coloração de viabilidade.
3. Incubar as suspensões durante 15 minutos, à temperatura ambiente, no escuro.
4. Centrifuga-se o tubo a 10.600 xg durante 5 min a 4 ° C.
5. Descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 15 mL de 10% de glicerol. Aplicar 8 mL para a superfície de uma lâmina de vidro limpa e cubra-o com uma pequena lamela. Analisar o slide usando um microscópio de fluorescência, contendo os filtros apropriados (ver sondas moleculares recomendações). Avaliar os resultados comparando Syto 9 (Sy) coloração de iodeto de propídio (PI) a coloração.
   Nota: Sy mancha penetra 100% de ambas as bactérias mortas e vivas, e PI mancha penetra apenas bactérias com membranas danificadas. A suspensão autoclavado (controlo negativo) podem formar aglomerados de bactérias, devido à presença de resíduos celulares. A escala semi-quantitativa utilizada para avaliação ao vivo / morto varia de 0 a 2 +; 0 indica que menos de 30% das células são positivas para PI mancha; 1 + significa entre 30 -50% das células são positivas para PI mancha, 2 + significa mais do que 50% das células são positivas para PI mancha. Uma pontuação de 0 é considerado o mais adequado para o uso.

4. Congelamento / descongelamento M. leprae Suspensão

1. Antes de começar, prepare o meio de congelamento (Protocolo dos reagentes - Protocolo 6). Para congelamento, use os passos descritos abaixo:
   1. Adicionar 150 ul da suspensão contendo 1 x 10 ⁷ AFB / ml para um criotubo esterilizado juntamente com 1 ml de meio de congelação.
   2. Colocar o frasco de congelação num recipiente de congelação e de armazenar o recipiente a -80 ° C durante 24 hr.
   3. Transferir o frasco congelado a uma caixa de armazenamento e armazená-lo a -80 ° C.
2. Para descongelar, use os passos descritos abaixo:
   1. Retirar o frasco de congelação com a suspensão congelada de -80 ° C e coloca-se numa banho de água a 37 ° C para iniciar o descongelamento da suspensão.
   2. Despeje a suspensão para um tubo contendo 20 ml de estérilsalina. Misture a suspensão suavemente até o descongelamento está completa.
   3. Centrifugar a suspensão durante 30 min, a 1700 xg, a 4 ° C.
   4. Descartar o sobrenadante e adicionar suficiente de soro fisiológico estéril para atingir o volume desejado. Homogeneizar a suspensão fazendo-a passar através de uma seringa (passo 1.8).
   5. Para a coloração ZN, a determinação da viabilidade e da inoculação, siga protocolos 2, 3 e 5.

5. Rato Inoculação

1. Duas pessoas são necessárias para este procedimento, uma para conter o mouse e outro para administrar o inóculo. O animal a ser inoculado deve ser tratado de acordo com as diretrizes e normas éticas e todos os procedimentos devem ser aprovados pelo comitê de cuidados com os animais e uso institucional. Contenha o mouse nu pela nuca com as patas para cima.
2. Homogeneizar a suspensão fazendo-a passar através de uma agulha G 26. Com uma seringa de 1 ml, aspirado suficiente suspensão bacilar para inóculoste dois coxins (30 mL / pata).
3. Segurar a pata traseira, limpar a pata com álcool a 70% de etanol antes da injecção, e introduzir a agulha intradérmica com o bisel da agulha apontado para cima, a partir do proximal ao lado distal da pata. Injecte 30 ul da suspensão. As injecções podem ser realizadas almofada da pata em ratos anestesiados.
4. Esperar 5 segundos, antes de retirar a agulha da pele a fim de evitar o refluxo do inoculo. Ratos devem ser alojados em cama macia pós inoculação, e deambulação e sinais de auto-mutilação deve ser monitorado.

Resultados

O sucesso do protocolo pode ser avaliada em três formas. Em primeiro lugar, a avaliação da qualidade do inoculo é determinada pela quantidade de detritos celulares e a percentagem resultante de bacilos viáveis ​​na suspensão final (Ver Protocolo 3). Como mostrado nas Figuras 1 e 2, a suspensão bacilar final continha muito pouco detritos celulares e alta viabilidade (contagem 0 +); notar que a maioria dos bacilos corados com o corante fluorescente verde Syto 9 (mancha penetra 100% de ambas as bactérias mortas e vivas, Figura 1) e poucos bacilos corados com o corante fluorescente PI vermelho (mancha penetra apenas bactérias com membranas danificadas, figura 2).

Figura 1. Syto 9 de coloração Suspensão M. leprae. Fluorescência verde demonstra a presença de vivo e morto M. leprae. 400X.

Figura 2. Coloração PI de M. leprae suspensão. Red fluorescência mostrando o pequeno número de mortos M. leprae. 400X.

Em segundo lugar, um inóculo com alta viabilidade terá impacto sobre a multiplicação do bacilo em coxim plantar de animais após 4-5 meses após a inoculação, com desenvolvimento de lesão macroscópica óbvio, como mostrado no vídeo (Protocolo 1). A terceira maneira de avaliar o sucesso do protocolo é através da avaliação da sobrevivência e multiplicação de BAAR em pata de camundongo inoculados com bacilos que tinham sido congelados por diferentes períodos (Veja Protocol 4).

"Cellspacing =" 0 "> Experiment (animal) Número de AFB / ml congelado no dia 0 Pontuação Viabilidade / dia 0 Período de congelamento (dias) Número de AFB inoculados após o congelamento Viabilidade pontuação após o congelamento Número de BAAR / ml recuperaram após sete meses 1 (1) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 60 1,7 x 10 ⁵ 1 + 2,3 x 10 ⁸ 1 (2) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 60 1,7 x 10 ⁵ 1 + 3,8 x 10 ⁷ 1 (3) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 60 1,7 x 10 ⁵ 1 + 8,5 x 10 ⁷ 1 (4) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 60 1,7 x 10 ⁵ 1 + 4,6 x 10 ⁷ 2 (1) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 4,2 x 10 ⁵ 1 + 1,7 x 10 ⁷ 2 (2) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 4,2 x 10 ⁵ 1 + 4,8 x 10 ⁶ 2 (3) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 4,2 x 10 ⁵ 1 + 8,6 x 10 ⁶ 3 (1) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1,7 x 10 ⁵ 1 + 1,2 x 10 ⁷ 3 (2) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1,7 x 10 ⁵ 1 + 1,8 x 10 ⁷ 3 (3) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1,7 x 10 ⁵ 1 + 1,8 x 10 ⁷ 3 (4) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1,7 x 10 ⁵ 1 + 2,6 x 10 ⁷ 3 (5) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1,7 x 10 ⁵ 1 + 3,7 x 10 ⁶

Tabela 1. Os resultados de M. multiplicação leprae usando suspensões pós congelamento.

A Tabela 1 apresenta os resultados de M. crescimento leprae usando suspensões após a congelação. A contagem da viabilidade das suspensões, após descongelamento é 1 +. O protocolo de congelamento foi efectuado em três experiências independentes para testar diferentes períodos de congelamento. Em ambos os experimentos com inóculos congelado por 15 ou 60 dias, o resultado foi semelhante, propagation após congelação resultou 10-1000 vezes o aumento do número de AFB recuperado de cada almofada da pata, após 7 meses de inoculação (Tabela 1). Portanto, o congelamento de M. suspensões leprae em meio 7H9 suplementado com OADC (ácido oleico-albumina-dextrose-catalase) resultou na manutenção da viabilidade.

Três inóculos foram usadas para avaliar M. leprae multiplicação após dois períodos de congelamento diferentes (15 e 60 dias). Depois de sete meses, os bacilos foram recuperados a partir de coxim plantar de camundongos inoculados e contado após coloração de Ziehl-Neelsen. Semiquantitativa viabilidade escala: 0 significa ausência de até 30% de células coradas PI; 1 + significa que entre 30-50% das células marcadas PI, 2 + significa superior a 50% de células coradas de PI. AFB: BAAR.

Discussão

Uma descrição detalhada de um bem ilustrada, o protocolo de sucesso para a propagação de M. leprae é muito necessário. O nosso estudo mostra que o protocolo de preparação do inóculo por filtração e digestão de tripsina permite a inóculos para ser obtido com muito pouco detritos celulares e com alta viabilidade do bacilo (score 0 +). Hidróxido de sódio foi usado para desagregar o tecido para purificação de bacilos ^6. Estudos realizados em nosso laboratório, utilizando hidróxido de sódio para a purificação de M. leprae resultou na formação de aglomerados de bacilos, o que dificulta a homogeneização da suspensão para determinação da viabilidade e a inoculação de animais (dados não mostrados).

Os potenciais problemas encontrados com a preparação de inoculo por filtração e digestão de tripsina incluem grande quantidade de restos celulares e de contaminação do inoculo com agentes bacterianos ou fúngicos. No caso de grandes quantidades de debr celularse são observados, após a purificação, ou a tripsina, não está activo ou há uma quantidade excessiva de material biológico. A actividade enzimática da solução estoque de tripsina devem ser avaliadas. Se se suspeitar de uma quantidade excessiva de material biológico inicial, o material deve ser dividida em alíquotas e o protocolo deve ser realizado em lotes separados. Para evitar a contaminação do inoculo com agentes bacterianos ou fúngicos, deve ser tomado cuidado para processar o material, sob condições assépticas. Se fungos e / ou contaminação bacteriana são detectados a suspensão deve ser descartado.

Uma limitação do nosso protocolo é a subjetividade da avaliação de viabilidade utilizando o método semi-quantitativo descrito. Viabilidade avaliada semi-quantitativamente é mais prático, embora menos preciso do que o método quantitativo publicado ^6. Pontuação Viabilidade de 0 + e 1 + são satisfatórias para a manutenção de propagação e congelamento deM. leprae. Lahiri et al. já demonstraram que camundongos nude inoculados com 80-90% de inóculo viável, resultam em coxins adequadas para a colheita (bacilos alta viabilidade) em 4-5 meses após a inoculação. Portanto, a infecção precoce (em torno de 4 meses) é a melhor época de colheita. Para a colheita de inóculos congelado, os ratos no presente protocolo foram mantidos inoculado por períodos mais longos (7 meses) para garantir curvas de crescimento. Um passo fundamental para assegurar a viabilidade adequada é a utilização de suspensões de bacilos frescos, de preferência no prazo de 24 horas após a recolha de material biológico do hospedeiro e de processamento. Além disso, a qualidade dos reagentes, soluções de coloração de tripsina e de viabilidade diluídas preparadas na hora, são necessárias para garantir a reprodutibilidade dos resultados.

Outra limitação deste protocolo é que o M. última leprae suspensão não está livre de DNA do hospedeiro, RNA, proteínas, etc. Portanto, outras etapas de purificação deve ser adicionado to obter uma M. leprae suspensão livre de componentes da célula hospedeira.

Um método para a manutenção de bacilos viáveis ​​por congelamento as amostras de tecidos inteiros de M. lesões leprae foi relatado ^9. No entanto, o estudo de Portaels et al. demonstraram perda significativa de viabilidade, que varia entre 65-97% após a congelação e descongelação de M. leprae infectados amostras de tecido obtidas a partir de tatu ^9. Nosso protocolo demonstrado que o índice de viabilidade observada em M. suspensões leprae após congelamento e descongelamento caiu quando comparada com a alíquota que não tinha sido congelada (Tabela 1). Com efeito, o congelamento do M. leprae suspensão em meio de congelação resultou viabilidade variando de 50-70%, com uma pontuação de viabilidade +, enquanto que a viabilidade pontuação 0 + foi obtido a suspensão descongelada. No entanto, a multiplicação de M. leprae foi satisfatória após 7 meses após a inoculação de camundongos nude ( Tabela 1). A inoculação em camundongos nu com amostras reconstituídas mantido congelado por 60 dias resultou numa média de 100 vezes aumento do número de bacilos em comparação com o inóculo inicial. Parece que o congelamento do M. leprae suspensão em meio de congelamento, em vez de amostras de tecido infectado, é mais eficiente. Uma etapa fundamental do nosso protocolo é o congelamento lento da AFB em um recipiente de congelamento, necessário para manter o bacilos típicos, como demonstrado por Colston e Hilson ^8. Futuros experimentos serão conduzidos para avaliar a viabilidade do bacilo após períodos mais longos de congelamento.

Em resumo, porque M. O leprae não crescer in vitro, o nosso protocolo permite uma alternativa fácil e rápido para a manutenção do inóculo viável, e o passo de congelação com êxito torna possível a manutenção de estirpes sem passagem contínua em animais, assim permitindo o estabelecimento de um banco de estirpes definidas.

Esta seção contém instruções para a preparação de reagentes para realizar esse protocolo.

1. Tripsina

Tripsina	0,5 g
Água destilada	até 100 ml

Filtro de esterilizar. Armazenar a -20 ° C.

2. 7H9

7H9 base de caldo de carne	4,7 g
40% de glicerol	5 ml
Água destilada	até 900 ml

Misture a base com água, em seguida, adicionar a glicerina, com agitação. Autoclave a 121 ° C durante 20 minutos para esterilizar. Armazenar a 4 ° C.

3. Infusão de cérebro e coração (BHI)

BHI	37 g
Água destilada	até 1.000 ml

Autoclave a 121 ° C durante 15 minutos para esterilizar. Armazenar a 4 ° C.

4. Soro Fenol

4.1) 5% de fenol

Fenol	5 ml
Água destilada	até 100 ml

4.2) fenol Soro

soro fetal bovino	2 ml
5% fenol	98 ml

Armazenar a 4 ° C.

5. Soluções para frio Ziehl-Neelsen

5.1) CarboFuchsin

Fuchsin	1 g
Cristais de fenol fundido a 60 ° C	5 ml
Álcool etílico puro	10 ml
Água destilada	até 100 ml

Filtro antes de cada utilização.

5.2) Base de azul de metileno

Azul de metileno	3 g
Álcool etílico a 95%	até 200 ml

5.3) O ácido Álcool

70% de álcool	990 ml
ácido clorídrico	10 ml

6. Médio para o congelamento:

OADC	10 ml
Glicerina	20 ml
Meio 7H9	até 100 ml

Autoclave de glicerol antes do uso e esterilizar por filtração OADC.

7. Autoclavado M. leprae suspensão

Autoclave a 121 ° C durante 20 min. Armazenar a -20 ° C.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BacLight Bacterial Viability Kit	Invitrogen; Molecular Probes	L7007
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma	H9269
Cryo 1 °C Freezing Container	Nalgene	5100001
Lowenstein-Jensen medium	LB Laborclin	901122
Saline	TEK Nova Inc	S5812
Pen	Dako	S2002
Centrifuge tube 50 ml/conical base	TPP	91050
Cell strainer  - 40 µm Nylon	BD Falcon	352340
Trypsin	Sigma	T-7409
Middlebrook 7H9 Broth Base	Sigma-Aldrich	M0178 Fluka
Glycerol	Gibco BRL	15514011
Brain heart infusion (BHI)	Oxoid LTDA	CM1135
Fuchsin	Merck Millipore	1159370025
Phenol	Invitrogen	15509037
Ethyl alcohol	Merck Millipore	EX02764
Cloridric acid	Merck	1131349010
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase)	Becton Dickinson	211886
Fetal bovine serum	Gibco; LifeTechnologies	26140079