Protocolli ottimizzati per<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt; Strain Management: congelata Stock Conservazione e Manutenzione in topi nudi atimici

Riepilogo

Mycobacterium leprae, l'agente eziologico della lebbra, non cresce in vitro. Descriviamo un facile seguire protocollo per preparare una sospensione bacillare per assicurare il mantenimento di grandi quantità di M. leprae per una varietà di applicazioni. Protocolli per la propagazione tramite mouse zampa inoculazione, la valutazione della vitalità, il congelamento e lo scongelamento magazzino bacillare sono descritte in dettaglio.

Abstract

La lebbra, causata dal Mycobacterium leprae, è una malattia infettiva importante che è ancora endemica in molti paesi del mondo, tra cui il Brasile. Non ci sono metodi noti per la coltivazione di M. leprae in vitro, presentando un grave ostacolo nello studio di questo patogeno in laboratorio. Pertanto, il mantenimento e la crescita di M. ceppi leprae sono preferibilmente effettuati in topi nudi atimici (NU-Foxn1 ^nu). Le condizioni di laboratorio per l'utilizzo di topi sono facilmente disponibili, facile da eseguire, e consentire la standardizzazione e lo sviluppo di protocolli per ottenere risultati riproducibili. Nel presente rapporto, descriviamo un semplice protocollo per la purificazione dei bacilli da piedini nudi del mouse utilizzando tripsina, che produce una sospensione di detriti minimo cellulare e con alto indice di vitalità batterica, come determinato dalla microscopia a fluorescenza. Una modifica al metodo standard per il conteggio bacillare da Ziehl-Neelsencolorazione e la microscopia ottica è inoltre dimostrato. Inoltre, si descrive un protocollo per congelamento e scongelamento stock bacillare come un protocollo alternativo per la manutenzione e la conservazione di M. ceppi leprae.

Introduzione

La lebbra, una malattia causata dal Mycobacterium leprae, costituisce un importante problema di salute pubblica in molti paesi in tutto il mondo ^1,2. Nonostante sia conosciuta come una malattia infettiva che colpisce la pelle e nervi periferici, ci sono ancora diverse lacune nelle conoscenze sui meccanismi coinvolti nel complesso immunopatogenesi della malattia.

Tra le caratteristiche difficili di M. leprae che ostacolano il suo studio sono la sua incapacità di crescere in mezzi di coltura artificiale e il suo tempo relativamente lungo raddoppio (circa 14 giorni) ^3,4. La maggior parte delle procedure sperimentali che utilizzano M. leprae sono istituiti con bacilli purificate da lesioni della pelle di malati di lebbra o da modelli sperimentali animali, come armadilli e diversi ceppi di topi ^5,6.

Per molti anni, i ricercatori hanno dipendeva purificazione del M. leprae da lesioni cutanee di LEPR multibacillarepazienti Osy per l'uso in procedure sperimentali. Diverse condizioni di laboratorio per la coltivazione in vitro o la manutenzione di live M. leprae è stato tentato, ma fino ad oggi, modelli animali hanno dimostrato di essere più adatto per scopi di ricerca. Negli anni 1960 e 1970, i ricercatori hanno iniziato ad usare mouse e armadilli per la rilevazione e la valutazione di M. leprae vitalità, monitoraggio della crescita batterica in risposta anti-M. farmaci leprae, e nella crescita e mantenimento di ceppi micobatterici ^2,4.

I modelli animali hanno alcune limitazioni, soprattutto in armadilli e primati non umani, comprese le questioni etiche, costi di manutenzione, infrastrutture speciali per la manutenzione degli animali, e la scarsa riproducibilità dei risultati e rendimenti finali. Attualmente, i topi sono il preferito modello animale per la ricerca lebbra. Le condizioni di laboratorio per l'utilizzo di topi sono facilmente disponibili, facile da eseguire, e permettono protocolli standardizzati ^{7,8,9. Topi nudi sono stati utilizzati nella manutenzione di M. leprae ceppi perché, anche con carichi bassi bacillari vitali, la risposta immunitaria carente T-cellule porta alla formazione di granulomi esuberante e di buona moltiplicazione bacillare. Quindi, questo modello animale ha guadagnato un'ampia accettazione all'interno della comunità di ricerca lebbra.}

Nel presente rapporto, descriviamo un semplice protocollo per la purificazione enzimatica di bacilli da footpads nude topo, destinati alla preparazione di un M. sospensione leprae con detriti cellulari minimo e con alto indice di vitalità batterica. La vitalità è determinata mediante microscopia a fluorescenza, che può essere rapidamente eseguita in laboratorio. Abbiamo anche dimostrare una modifica al metodo standard per il conteggio bacillare dal freddo colorazione Ziehl-Neelsen e microscopia ottica. Inoltre, presentiamo un protocollo alternativo per la manutenzione e la conservazione di M. ceppi leprae, che consente di congelamento e scongelamento dei bacillare stocks.

Protocollo

1. Preparazione del Mycobacterium leprae sospensione

1. Prima di eutanasia il atimico topo nudo (NU-Foxn1 ^nu), preparare la soluzione tripsina e terreni di coltura (protocollo dei reagenti - protocolli 1, 2, e 3). Euthanize il topi nudi 4-5 mesi dopo l'inoculazione con M. leprae secondo le Linee Guida AVMA per l'eutanasia degli animali: 2013 Edizione ¹⁰ (gli esperimenti e l'uso di immagini di animali sono stati approvati e condotti in conformità con le linee guida del Comitato Animal Care di Faculdade de Odontologia de Bauru, USP). All'interno di un armadio di sicurezza biologica usata per la movimentazione di animali, pulire l'intera mouse con alcool al 70% di etanolo.
2. Tenere la zampa posteriore con pinza emostatica distale al giunto tarsale. Tagliare la zampa fuori con le forbici sotto la pinza ed immergere la zampa in 2% di iodio per 20 min. Quindi, ripetere la procedura per l'altra zampa posteriore.
3. Trasferire le zampe ad uncappa di sicurezza biologica pulita per ulteriori lavori. Prendere zampe di iodio 2%, asciugarle con garza sterile e poi raccogliere i due piedini con il numero 22 o 23 lame bisturi, eliminando tutti i tessuti molli (derma, epidermide, tendini e nervi), vicino all'osso. Rimuovere i metatarsi ossa e il 1 ° e 5 ° falangi. Posizionare il materiale in una piastra di Petri sterile e rimuovere l'epidermide, raschiando via con il bisturi. Tagliare il tessuto in piccoli pezzi con le forbici e trasferirli in una provetta a fondo tondo. Peso del tessuto e aggiungere 1 ml di soluzione salina bilanciata Hanks (HBSS). Mantenere la provetta in ghiaccio per evitare il riscaldamento del campione.
4. Aggiungere altre 1 ml di HBSS e omogeneizzare il campione utilizzando un omogeneizzatore tessuto.
   1. Primo ciclo omogeneizzazione: 3 impulsi di 15 secondi a velocità 4 (14.450 rpm).
   2. Trasferire il supernatante in una provetta conica da 50 ml sterile, passando attraverso un colino cella per eliminare i detriti rimanenti. Lasciare che la soluzione per passare da gravità.
   3. Aggiungere un ulteriore 2 ml di HBSS, e ripetere il ciclo di omogeneizzazione (sezione 1.4.1), e passare i campioni attraverso il filtro delle cellule di nuovo.
   4. Risciacquare il filtro aggiungendo HBSS per portare il volume a 9 ml. Eliminare il filtro cella.
5. Scongelare una aliquota di soluzione di tripsina 0,5%. Aggiungere 1 ml di tripsina ai 9 ml di sospensione cellulare per ottenere una concentrazione finale di 0,05% tripsina. Eliminare restante tripsina scongelati. Incubare per 60 minuti in un bagno d'acqua a 37 °. Dopo l'incubazione, portare il volume a 40 ml con l'aggiunta di soluzione salina sterile per diluire la tripsina.
6. Centrifugare a 1700 xg per 30 min a 4 ° C.
7. Eliminare il supernatante capovolgendo con attenzione il tubo. Risospendere il pellet toccando il tubo e poi aggiungere 1 ml di soluzione fisiologica sterile. Trasferire la sospensione in un tubo conico misurando il volume finale della sospensione (per calcolare il rendimento / grammo di tessuto).
8. Omogeneizzare la sospensione bacillare utilizzando un 1 ml siringa da insulina con un ago G 26 durante il trasferimento della sospensione in una nuova provetta.
9. Eseguire il controllo microbiologico della sospensione mettendo 2 gocce (50 ul) di esso in ciascun mezzo: 7H9 e Lowenstein-Jensen medio e incubare a 37 ° C per 30 giorni, per il rilevamento di contaminanti micobatteri. Analogamente, inoculare un medium Brain Heart Infusion (BHI) e incubare per 24 ore a 37 ° C, per il rilevamento di contaminanti batteri aerobi.
10. Aliquota la sospensione in provette per la colorazione: 35 microlitri per Cold Ziehl-Neelsen (protocollo 2), e 200 ml per la determinazione della redditività (protocollo 3).
11. Dopo Ziehl-Neelsen (ZN), calcolare il numero di bacilli acido / ml (AFB / ml). Per nudo topi inoculazione, preparare una AFB / sospensione 1 x 10 ⁸ ml, assicurarsi di avere abbastanza volume per inoculare 30 ml / footpad / animale (protocollo 5), e mantenere il freddo sospensione fino inoculazione. Per il congelamento, preparare un 1 x 10 ⁷ AFB / ml suspensione (protocollo 4).

2. Freddo Ziehl-Neelsen

1. Prima di iniziare la colorazione, preparare la soluzione siero / fenolo e le soluzioni ZN colorazione (Protocollo dei reagenti - Protocolli 4 e 5). Disegnare tre cerchi (diametro interno 10 mm) su tre vetrini utilizzando una penna immunoistochimica. Identificare le diapositive: (1) normali o non diluiti, (2) 01:10, e (3) 1:100 utilizzando una matita numero 2 (Nota: alcuni grafite svanisce dopo ZN colorazione).
2. Diluire la sospensione bacillare (punto 1.10) a 1:10 e 1:100 diluizioni seriali, cioè aggiungere 5 ml di sospensione non diluito e 45 ml di soluzione fisiologica, poi 5 ml di 1:10 e aggiungere 45 ml di soluzione fisiologica.
3. Aggiungere 5 ml di soluzione di siero / fenolo e 10 ml di sospensione bacillare a cerchio. Omogeneizzare e diffondere uniformemente intorno alla zona del cerchio con il manico di un ciclo monouso. Attendere che la sospensione ad asciugare su un tavolo livellata.
4. Dopo drying, fissare lo striscio passando il vetrino 3 volte sopra la fiamma blu di un becco Bunsen (circa 20 sec totale) ^11.
5. Per la colorazione, coprire l'intera superficie del vetrino con filtrato carbofuchsine Ziehl-Neelsen (circa 5 ml) per 20 min.
6. Sciacquare il vetrino in acqua (flusso lento) in esecuzione.
7. Coprire il vetrino con una soluzione alcolica acida 10% per circa 20 sec.
8. Lavare nuovamente il vetrino in acqua corrente.
9. Coprire il vetrino con una soluzione di blu di metilene per 5 min.
10. Sciacquare il vetrino in acqua corrente e lasciare asciugare a temperatura ambiente.
11. Conta 20 campi / cerchio (totale 60 campi / slide) con un obiettivo ad immersione in olio 100X. Il calcolo degli acidi bacilli / ml (AFB / ml) viene fatto come segue, secondo la descrizione delle tecniche di laboratorio per la lebbra ^12:
    AFB / field = numero totale di bacilli si trovano nei 3 cerchi (60 campi) diviso per 60.
    AFB / ml = AFB / campo x costante (area del cerchiox 100 diviso per area dell'apertura lente dell'obiettivo), e se il conteggio una sospensione diluita, moltiplicare il numero di AFB / ml per il fattore di diluizione (10 o 100).

3. Viabilità Determinazione

1. Prima di iniziare, preparare il M. autoclavato leprae sospensione (protocollo dei reagenti - Protocollo 7). Utilizzare l'apposito kit (vedi tabella di reagenti e attrezzature) per la determinazione qualitativa di M. leprae vitalità nella sospensione. Diluire le soluzioni come segue (in tutte le procedure devono essere eseguite sotto la luce fioca): diluita A di un fattore 10 in soluzione fisiologica (1 ml magazzino più 9 ml di soluzione salina), diluita B 20 di un fattore in soluzione salina (1 ml magazzino più 19 ml di soluzione salina).
2. Aggiungere 3,6 ml di soluzione diluita A e 6 ml di soluzione diluita B a 200 microlitri della sospensione bacillare da testare (passo 1.10). A M. precedentemente autoclavato sospensione leprae viene normalmente utilizzato comecontrollo egative per la vitalità colorazione.
3. Incubare le sospensioni per 15 minuti, a temperatura ambiente al buio.
4. Centrifugare la provetta a 10.600 xg per 5 minuti a 4 ° C.
5. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 15 ml di glicerolo al 10%. Applicare 8 microlitri alla superficie di un vetrino pulito e coprirlo con una piccola copertura antiscivolo. Analizzare il vetrino utilizzando un microscopio a fluorescenza, che contiene i filtri appropriati (vedere le raccomandazioni sonde molecolari). Valutare i risultati confrontando Syto 9 (Sy) colorazione di ioduro di propidio (PI) colorazione.
   Nota: macchia Sy penetra il 100% di entrambi i batteri vivi e morti, e macchia PI penetra solo i batteri con membrane danneggiate. La sospensione autoclavato (controllo negativo) può formare blocchi di batteri dovuti alla presenza di detriti cellulari. La scala semiquantitativa utilizzato per la valutazione vivo / morto varia da 0 a 2 +, 0 indica che meno del 30% delle cellule sono positive alla colorazione PI; 1 + significa tra 30 -50% delle cellule sono positive alla colorazione PI; 2 + significa più del 50% delle cellule sono positive alla colorazione PI. Un punteggio di 0 è considerato più adeguato per l'uso.

4. Congelamento / scongelamento M. leprae Sospensione

1. Prima di iniziare, preparare il terreno di congelamento (protocollo dei reagenti - Protocollo 6). Per il congelamento, utilizzare le procedure descritte di seguito:
   1. Aggiungere 150 microlitri della sospensione contenente 1 x 10 ⁷ AFB / ml ad una esageratamente sterile con 1 ml di mezzo congelamento.
   2. Posizionare il esageratamente in un contenitore di congelamento e conservare il recipiente a -80 ° C per 24 ore.
   3. Trasferire il flacone congelato per una scatola e conservarlo a -80 ° C.
2. Per lo scongelamento, utilizzare le procedure descritte di seguito:
   1. Rimuovere il esageratamente con la sospensione congelata da -80 ° C e inserirlo in un bagno d'acqua a 37 ° C per iniziare lo scongelamento sospensione.
   2. Versare la sospensione in una provetta contenente 20 ml di soluzione sterilesalina. Mescolare la sospensione delicatamente fino scongelamento è completo.
   3. Centrifugare la sospensione per 30 min, a 1.700 xg, a 4 ° C.
   4. Eliminare il supernatante e aggiungere abbastanza salina sterile per raggiungere il volume desiderato. Omogeneizzare la sospensione mediante passaggio su una siringa (passo 1.8).
   5. Per ZN colorazione, la determinazione vitalità e inoculazione, seguire protocolli 2, 3 e 5.

5. Topo inoculazione

1. Due persone sono necessarie per questa procedura, uno a frenare il mouse e un altro per amministrare l'inoculo. L'animale deve essere inoculato dovrebbe essere gestito secondo le linee guida e le norme etiche e tutte le procedure devono essere approvati dalla cura degli animali e l'uso comitato istituzionale. Trattenere il mouse nudo per la collottola del collo con le zampe verso l'alto.
2. Omogeneizzare la sospensione passando attraverso un ago G 26. Con una siringa da 1 ml, aspirare abbastanza sospensione bacillare da inoculite due piedini (30 microlitri / zampa).
3. Tenere la zampa posteriore pulire la zampa con il 70% di alcol etanolo prima dell'iniezione intradermica e introdurre l'ago con il bisello dell'ago indicate up, dall'estremità prossimale verso il lato distale della zampa. Iniettare 30 ml di sospensione. Le iniezioni Footpad possono essere effettuate in topi anestetizzati.
4. Attendere 5 secondi prima di estrarre l'ago dalla pelle per evitare il reflusso di inoculo. I topi dovrebbero essere ospitati sul morbido palo biancheria da letto inoculazione, e la deambulazione e segni di auto-mutilazione devono essere monitorati.

Risultati

Il successo del protocollo può essere valutata in tre modi. In primo luogo, la valutazione della qualità dell'inoculo è determinata dalla quantità di detriti cellulari e la percentuale risultante di bacilli vitali nella sospensione finale (Vedi protocollo 3). Come mostrato nelle figure 1 e 2, la sospensione bacillare finale conteneva pochissimo detriti cellulari e alta vitalità (punteggio 0 +); notare che la maggior parte dei bacilli colorati con il colorante fluorescente Syto 9 verde (macchia penetra 100% di entrambi i batteri vivi e morti, Figura 1) e solo pochi bacilli colorati con il colorante fluorescente PI rosso (macchia penetra solo i batteri con membrane danneggiate, Figura 2).

Figura 1. Syto 9 colorazione M. leprae sospensione. Fluorescenza verde dimostra la presenza di vivi e morti M. leprae. 400X.

Figura 2. PI colorazione di M. leprae sospensione. Red fluorescenza che mostra il piccolo numero di morti M. leprae. 400X.

In secondo luogo, un inoculo con alta vitalità influirà sulla moltiplicazione di bacilli nei piedini di animali dopo 4-5 mesi dopo l'inoculazione, con sviluppo di evidente lesione macroscopica, come mostrato nel video (protocollo 1). Il terzo modo per valutare il successo del protocollo è quello di valutare la sopravvivenza e la moltiplicazione di AFB in piedini del mouse inoculati con bacilli che erano stati congelati per diversi periodi (vedi protocollo 4).

"Cellspacing =" 0 "> Experiment (animale) Numero di AFB / ml congelata al giorno 0 Punteggio Viabilità / giorno 0 Periodo di congelamento (giorni) Numero di AFB inoculato dopo il congelamento Punteggio di vitalità dopo il congelamento Numero di AFB / ml recuperati dopo 7 mesi 1 (1) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 60 1,7 x 10 ⁵ 1 + 2,3 x 10 ⁸ 1 (2) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 60 1,7 x 10 ⁵ 1 + 3.8 x 10 ⁷ 1 (3) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 60 1,7 x 10 ⁵ 1 + 8.5 x 10 ⁷ 1 (4) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 60 1,7 x 10 ⁵ 1 + 4,6 x 10 ⁷ 2 (1) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 4,2 x 10 ⁵ 1 + 1,7 x 10 ⁷ 2 (2) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 4,2 x 10 ⁵ 1 + 4,8 x 10 ⁶ 2 (3) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 4,2 x 10 ⁵ 1 + 8,6 x 10 ⁶ 3 (1) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1,7 x 10 ⁵ 1 + 1.2 x 10 ⁷ 3 (2) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1,7 x 10 ⁵ 1 + 1,8 x 10 ⁷ 3 (3) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1,7 x 10 ⁵ 1 + 1,8 x 10 ⁷ 3 (4) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1,7 x 10 ⁵ 1 + 2.6 x 10 ⁷ 3 (5) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1,7 x 10 ⁵ 1 + 3,7 x 10 ⁶

Tabella 1. Risultati di M. leprae moltiplicazione utilizzando sospensioni di post congelamento.

Tabella 1 illustra i risultati di M. crescita leprae utilizzando sospensioni dopo il congelamento. Il punteggio vitalità delle sospensioni dopo lo scongelamento era 1 +. Il protocollo di congelamento è stato effettuato in tre esperimenti indipendenti per testare diversi periodi di congelamento. In entrambi gli esperimenti con inoculi congelato per 15 o 60 giorni, il risultato è stato simile, propagation dopo il congelamento prodotto 10-1,000 volte aumentano il numero di AFB recuperato da ciascun piedino dopo 7 mesi di inoculazione (Tabella 1). Pertanto, il congelamento di M. sospensioni leprae in 7H9 medio integrato con OADC (acido oleico-albumina-destrosio-catalasi) portato nella manutenzione della redditività.

Tre inoculi sono stati utilizzati per valutare M. leprae moltiplicazione dopo due diversi periodi di congelamento (15 e 60 giorni). Dopo 7 mesi, bacilli sono stati recuperati dai polpastrelli di topi inoculati e contate dopo Ziehl-Neelsen. Semiquantitativa scala vitalità: 0 significa assenti fino al 30% di cellule colorate PI; 1 + significa che il 30-50% delle cellule colorate PI; 2 + significa sopra del 50% di cellule colorate PI. AFB: acido bacilli.

Discussione

Una descrizione dettagliata di una ben illustrato, protocollo di successo per la propagazione di M. leprae è grandemente necessario. Il nostro studio dimostra che il protocollo di preparazione inoculo mediante filtrazione e tripsina digestione permette l'inoculo di ottenere con poco detriti cellulari e con alta sostenibilità dei bacilli (punteggio 0 +). Idrossido di sodio è stato utilizzato per disaggregare il tessuto per la purificazione di bacilli ^6. Studi condotti nel nostro laboratorio utilizzando idrossido di sodio per la purificazione di M. leprae provocato la formazione di grumi di bacilli, ostacolando l'omogeneizzazione della sospensione per la determinazione vitalità e inoculazione animale (dati non mostrati).

Potenziali problemi incontrati con la preparazione dell'inoculo per filtrazione e tripsina digestione includono grande quantità di detriti cellulari e contaminazione dell'inoculo con agenti batterici o fungini. In caso di grandi quantità di debr cellularesi sono osservati dopo purificazione, sia la tripsina non è più attivo o vi è una quantità eccessiva di materiale biologico. L'attività enzimatica della soluzione stock tripsina deve essere valutata. Se si sospetta eccessiva quantità di materiale biologico iniziale, il materiale deve essere suddiviso in aliquote e il protocollo deve essere effettuata in lotti separati. Per evitare la contaminazione dell'inoculo con agenti batterici o fungini, bisogna fare attenzione per elaborare il materiale in condizioni asettiche. Se vengono rilevati funghi e / o contaminazione batterica la sospensione deve essere eliminata.

Una limitazione del nostro protocollo è la soggettività della valutazione fattibilità con il metodo semi-quantitativo descritto. Viabilità valutato semi-quantitativamente è più pratico, anche se meno preciso rispetto al metodo quantitativo pubblicato ^6. Viabilità punteggio di 0 + e 1 + sono soddisfacenti per la manutenzione di propagazione e il congelamento deiM. leprae. Lahiri et al. hanno già dimostrato che topi nudi inoculati con 80-90% inoculo vitale, producono cuscinetti plantari adatti per la raccolta (alta redditività bacilli) ai 4-5 mesi di inoculazione. Pertanto, infezione precoce (circa 4 mesi) è il miglior tempo di raccolta. Per la raccolta di inoculi congelati, i topi nel presente protocollo sono stati mantenuti inoculata per periodi più lunghi (7 mesi) per garantire curve di crescita. Un passaggio fondamentale per garantire un'adeguata redditività è l'uso di sospensioni freschi bacilli, preferibilmente entro 24 ore dopo il prelievo di materiale biologico dall'host e lavorazione. Inoltre, la qualità dei reagenti, soluzioni coloranti preparati al momento tripsina e vitalità diluiti, sono necessarie per garantire risultati riproducibili.

Un altro limite di questo protocollo è che la finale M. sospensione leprae non è libero di DNA ospite, RNA, proteine, etc. Pertanto, altre fasi di purificazione devono essere aggiunti to ottenere una M. leprae sospensione priva di componenti della cellula ospite.

Un metodo per il mantenimento bacilli vitali mediante congelamento esemplari interi tessuto di M. lesioni leprae è stata riportata ^9. Tuttavia, lo studio da Portaels et al. dimostrato la significativa perdita di vitalità, che spaziano tra il 65-97% dopo il congelamento e lo scongelamento di M. leprae infettato campioni di tessuto ottenuti da armadillo ^9. Il nostro protocollo ha dimostrato che l'indice di vitalità osservato in M. sospensioni leprae dopo congelamento e scongelamento sceso rispetto alla aliquota che non era stato congelato (Tabella 1). Infatti, il congelamento M. sospensione leprae nei media congelamento prodotto redditività vanno dal 50-70%, con vitalità punteggio di 1 +, mentre la redditività punteggio di 0 + è stato ottenuto nella sospensione scongelato. Tuttavia, la moltiplicazione di M. leprae è stato soddisfacente dopo 7 mesi dopo l'inoculazione di topi nudi ( Tabella 1). L'inoculazione di topi nudi con campioni ricostituiti mantenuto congelato per 60 giorni indotto in media 100 volte aumento del numero di bacilli rispetto al inoculo iniziale. Sembra che il congelamento del M. sospensione leprae nei media congelamento, invece di campioni di tessuto infetto, è più efficiente. Un punto critico del nostro protocollo è il lento congelamento del AFB in un contenitore di congelamento, occorre mantenere il bacilli vitali, come dimostrato da Colston e Hilson ^8. Futuri esperimenti saranno condotti per valutare la fattibilità di bacilli dopo periodi di congelamento più lunghi.

In sintesi, perché M. leprae non cresce in vitro, nostro protocollo permette un facile e veloce alternativa a manutenzione di inoculo vitale, e la fase di congelamento successo rende possibile il mantenimento di ceppi senza passaggio continuo di animali, permettendo così la creazione di una banca di ceppi definiti.

Questa sezione contiene istruzioni per la preparazione di reagenti per eseguire questo protocollo.

1. Tripsina

Tripsina	0,5 g
Acqua distillata	fino a 100 ml

Filtro sterilizzare. Conservare a -20 ° C.

2. 7H9

7H9 base di brodo	4.7 g
40% di glicerolo magazzino	5 ml
Acqua distillata	fino a 900 ml

Miscelare la base con acqua poi aggiungere il glicerolo agitando. Autoclave a 121 ° C per 20 minuti per sterilizzare. Conservare a 4 ° C.

3. Brain Heart Infusion (BHI)

BHI	37 g
Acqua distillata	fino a 1.000 ml

Autoclave a 121 ° C per 15 minuti per sterilizzare. Conservare a 4 ° C.

4. Siero fenolo

4.1) 5% fenolo

Fenolo	5 ml
Acqua distillata	fino a 100 ml

4.2) fenolo Serum

siero fetale bovino	2 ml
5% fenolo	98 ml

Conservare a 4 ° C.

5. Soluzioni per freddo Ziehl-Neelsen Stain

5.1) CarboFuchsin

Fuchsin	1 g
Fenolo cristalli fusi a 60 ° C	5 ml
Alcole etilico puro	10 ml
Acqua distillata	fino a 100 ml

Filtrare prima di ogni utilizzo.

5.2) blu di metilene Base

Blu di metilene	3 g
95% di alcol etilico	fino a 200 ml

5.3) L'acido alcol

70% di alcol	990 ml
acido cloridrico	10 ml

6. Piano per il congelamento:

OADC	10 ml
Glicerina	20 ml
7H9 medio	fino a 100 ml

Autoclave glicerolo prima dell'uso e sterilizzare OADC per filtrazione.

7. Autoclavato M. sospensione leprae

Autoclave a 121 ° C per 20 min. Conservare a -20 ° C.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
BacLight Bacterial Viability Kit	Invitrogen; Molecular Probes	L7007
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma	H9269
Cryo 1 °C Freezing Container	Nalgene	5100001
Lowenstein-Jensen medium	LB Laborclin	901122
Saline	TEK Nova Inc	S5812
Pen	Dako	S2002
Centrifuge tube 50 ml/conical base	TPP	91050
Cell strainer  - 40 µm Nylon	BD Falcon	352340
Trypsin	Sigma	T-7409
Middlebrook 7H9 Broth Base	Sigma-Aldrich	M0178 Fluka
Glycerol	Gibco BRL	15514011
Brain heart infusion (BHI)	Oxoid LTDA	CM1135
Fuchsin	Merck Millipore	1159370025
Phenol	Invitrogen	15509037
Ethyl alcohol	Merck Millipore	EX02764
Cloridric acid	Merck	1131349010
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase)	Becton Dickinson	211886
Fetal bovine serum	Gibco; LifeTechnologies	26140079