פרוטוקולים אופטימליים עבור<em&gt; Leprae Mycobacterium</em&gt; ניהול הזנים: קפוא במלאי שימור ותחזוקה בעכברים בעירום athymic

Summary

leprae Mycobacterium, הסוכן סיבתי של צרעת, אינו גדל במבחנה. אנו מתארים קל לעקוב פרוטוקול להכין השעיה מתגית כדי להבטיח השמירה על כמויות גדולות של מ ' leprae עבור מגוון רחב של יישומים. פרוטוקולים להפצה על ידי חיסון עכבר שודד דרכים, הערכה של כדאיות, הקפאה והפשרת מניית צילארית מתוארים בפירוט.

Abstract

צרעת, הנגרמת על ידי Mycobacterium leprae, היא מחלה זיהומית חשובה שעדיין אנדמי במדינות רבות ברחבי העולם, כולל ברזיל. כרגע אין שיטות ידועות לגידול מ leprae במבחנה, המציגה מכשול עיקרי במחקר של פתוגן זה במעבדה. לכן, השמירה על צמיחתו של מ ' זני leprae מבוצעים רצוי בעכברים בעירום athymic (NU-Foxn1 ^נו). תנאי המעבדה לשימוש בעכברים הם זמינים, קלים לביצוע, ונאפשר סטנדרטיזציה ופיתוח של פרוטוקולים להשגת תוצאות לשחזור. בדו"ח הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול פשוט לטיהור של חיידקים מלכפות הרגלי עכבר בעירום באמצעות טריפסין, אשר מניב השעיה עם פסולת תא מינימאלית ועם מדד כדאיות חיידקים גבוה, כפי שנקבע על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שינוי לשיטה סטנדרטית לספירת צילארית ידי Ziehl-Neelsenמכתים ומיקרוסקופ אור הוא הוכיחה גם. בנוסף, אנו מתארים פרוטוקול להקפאה והפשרת מניות צילארית כפרוטוקול חלופי לצורך התחזוקה והאחסון של מ ' זני leprae.

Introduction

צרעת, מחלה הנגרמת על ידי Mycobacterium leprae, היא בעיה בריאותית ציבורי חשובה במדינות רבות ברחבי העולם ^1,2. למרות היותו ידוע כמחלה מדבקת המשפיעה על עור ועצבים היקפיים, יש עדיין כמה פערים בידע לגבי המנגנונים המעורבים בimmunopathogenesis המורכב של המחלה.

בין המאפיינים המאתגרים של מ ' leprae המעכב את המחקר שלה הוא חוסר היכולת שלה לצמוח בתקשורת המלאכותית תרבות והזמן ארוך יחסית ההכפלה שלה (כ 14 ימים) ^3,4. רוב הפרוצדורות המשתמשות מ ' leprae מוגדרים עם חיידקים מטוהרים מנגעים בעור של חולי צרעת או ממודלים של בעלי חיים ניסיוני, כמו ארמדילים ומספר זנים של עכברי ^5,6.

במשך שנים רבות, חוקרים תלויים בטיהורו של מ ' leprae מנגעים בעור של lepr multibacillaryחולי osy לשימוש בפרוצדורות. תנאי מעבדה כמה לגידול או תחזוקה במבחנה של מ 'בשידור חי leprae כבר ניסה, אך עד כה, מודלים בבעלי החיים הוכיחו שהוא מתאים ביותר למטרות מחקר. ב1960s and 1970s, חוקרים החלו להשתמש בעכברים וארמדילים לזיהוי והערכה של מ ' כדאיות leprae, מעקב התפתחות חיידקים בתגובה לנגד מ ' תרופות leprae, ובצמיחה והתחזוקה של זני mycobacterial ^2,4.

יש מודלים של בעלי החיים כמה מגבלות, במיוחד בארמדילים וקופים לא אנושיים, ובכלל זה שיקולים אתיים, עלות התחזוקה, תשתיות מיוחדות הדרושות לאחזקת בעלי חיים, ואת שחזור גרוע של תוצאות ותשואות סופיות. נכון לעכשיו, עכברים הם בעלי החיים מודל המועדפים למחקר צרעת. תנאי המעבדה לשימוש בעכברים הם זמינים, קלים לביצוע, ולאפשר פרוטוקולים סטנדרטיים ^{7,8,9. עכברים בעירום היו בשימוש באחזקתו של מ ' leprae זנים כי, גם עם המון צילארית קיימא נמוך, התגובה החיסונית לקויה T-cell מביאה להיווצרות גרנולומה צוהלות וכפל צילארית טוב. לפיכך, מודל חיה זה צבר קבלה רחבה בתוך קהילת מחקר הצרעת.}

בדו"ח הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול פשוט לטיהור האנזימטית של חיידקים מלכפות הרגלי עכבר בעירום, המיועד להכנת מ ' השעיה leprae עם פסולת תא מינימאלית ועם מדד כדאיות חיידקים גבוה. הכדאיות נקבעת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אשר יכול להתבצע במהירות במעבדה. אנחנו גם מדגימים שינוי לשיטה סטנדרטית לספירת צילארית ידי מכתים Ziehl-Neelsen הקר ומיקרוסקופ אור. בנוסף, אנו מציגים פרוטוקול חלופי לצורך התחזוקה והאחסון של מ ' זני leprae, הקפאה והפשרה של רחוב צילארית מאפשרתocks.

Protocol

1. הכנת ההשעיה leprae Mycobacterium

1. לפני והרדמת חסד עכבר עירום athymic (NU-Foxn1 ^נו), להכין את פתרון טריפסין ותרבות תקשורת (פרוטוקול של חומרים כימיים - פרוטוקולי 1, 2, ו -3). להרדים את העכברים בעירום הודעה 4-5 חודשי חיסון עם מ ' leprae פי הנחיות AVMA להמתת החסד של בעלי חיים: 2013 Edition ¹⁰ (הניסויים ושימוש בתמונות של בעלי חיים אושרו ונערכו בהתאם להנחיות ועדת הטיפול בבעלי חיים של Faculdade דה Odontologia דה פורו, USP). בתוך ארון בטיחות ביולוגי המשמש לטיפול בבעלי חיים, לנקות את כל העכבר עם 70% אלכוהול אתנול.
2. החזק את כף הרגל האחורית באמצעות מלקחיים עוצר דמום דיסטלי למפרק הקרסול. חותכים את הכפה את עם מספריים מתחת למלקחיים ולטבול את הכף ביוד 2% עבור 20 דקות. ואז, לחזור על התהליך עבור הכפה האחורית אחרת.
3. העבר את כפות לארון בטיחות ביולוגית נקי עבור עבודה נוספת. קחו את כפות מיוד 2%, לייבש אותם עם גזה סטרילית ולאחר מכן לאסוף את שני הכריות ההרגלים שימוש במספר 22 או 23 להב סכין מנתחים, הסרת כל הרקמות רכות (העור, האפידרמיס, גידים, ועצבים) הקרובים לעצם. הסר את עצמות metatarsals ו1 והפלנגות 5. מניחים את החומרים בצלחת פטרי סטרילית ולהסיר את האפידרמיס, על ידי גירוד אותו עם להב סכין המנתחים. חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות עם מספריים ולהעביר אותם לצינור תחתון עגול. משקל הרקמה ולהוסיף 1 מיליליטר של תמיסת מלח מאוזנת הנקס (HBSS). שמור את הצינור על קרח, כדי למנוע ההתחממות של המדגם.
4. הוסף 1 מיליליטר נוסף של HBSS וhomogenize המדגם באמצעות homogenizer רקמות.
   1. מחזור ראשון המגון: 3 פולסים של 15 שניות במהירות 4 (14,450 סל"ד).
   2. מעביר את supernatant לצינור חרוטי 50 מיליליטר סטרילי, זה עובר דרך מסננת תא לחסל את הפסולת שנותרה. אפשר הפתרון עובר gravity.
   3. להוסיף 2 מיליליטר נוסף של HBSS, ולחזור על מחזור הומוגניזציה (סעיף 1.4.1), ולהעביר את הדגימות דרך מסננת התא שוב.
   4. יש לשטוף את המסננת על ידי הוספת HBSS כדי להביא את הנפח עד 9 מיליליטר. מחק את מסננת התא.
5. הפשירו aliquot של .0.5% פתרון טריפסין. הוסף 1 מיליליטר של טריפסין ל9 מיליליטר של השעיה תא להשיג טריפסין 0.05% ריכוז סופי. בטל טריפסין מופשר שנותר. דגירה של 60 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לאחר דגירה, להביא את הנפח עד 40 מיליליטר על ידי הוספת מלח סטרילית כדי לדלל את טריפסין.
6. צנטריפוגה ב 1,700 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C.
7. בטל supernatant על ידי צינור היפוך בזהירות. Resuspend את הכדור על ידי הקשה על הצינור ולאחר מכן להוסיף 1 מיליליטר של תמיסת מלח סטרילית. מעביר את ההשעיה לצינור חרוטי חדש מדידת הנפח הסופי של ההשעיה (כדי לחשב את התשואה / גרם של רקמה).
8. Homogenize ההשעיה צילארית באמצעות 1 מ 'מזרק l אינסולין עם מחט G 26 בעת העברת ההשעיה לצינור חדש.
9. לבצע בקרת מיקרוביולוגית של ההשעיה על ידי הצבת 2 טיפות (50 ul) שלו בכל מדיום: 7H9 ובינוני לוינשטיין-ג'נסן ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 ימים, לגילוי של זיהום mycobacteria. באופן דומה, לחסן בינוני מוח לב עירוי (BHI) ו דגירה של 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס, לגילוי זיהום חיידקים אירוביים.
10. Aliquot ההשעיה לתוך צינורות עבור מכתים: 35 μl עבור מכתים קר Ziehl-Neelsen (פרוטוקול 2), ו200 μl לקביעת כדאיות (פרוטוקול 3).
11. לאחר צביעת Ziehl-Neelsen (Zn), לחשב את מספר מיליליטר חומצת חיידקים מהירים / (AFB / מיליליטר). עבור חיסון עכברים בעירום, להכין AFB / השעיה מיליליטר 1 x 10 ^8; לוודא שיש מספיק נפח לחסן 30 μl / שודד / בעלי חיים (פרוטוקול 5), ולשמור על קור ההשעיה עד חיסון. להקפאה, להכין 1 x 10 ⁷ AFB / sus מיליליטרפנסיה (פרוטוקול 4).

2. קר Ziehl-Neelsen מכתים

1. לפני שמתחיל מכתים, להכין את פתרון הסרום / פנול ופתרוני צביעת ZN (פרוטוקול של חומרים כימיים - פרוטוקולי 4 ו -5). צייר שלושה מעגלים (פנימי בקוטר 10 מ"מ) על שלוש שקופיות זכוכית באמצעות עט אימונוהיסטוכימיה. זהה את השקופיות: (1) רגילות או חי, (2) 1:10, ו (3) 1:100 באמצעות עיפרון מספר 2 (הערה: חלק גרפיט נמוג מעל לאחר צביעת ZN).
2. לדלל את ההשעיה מהתגית (שלב 1.10) ל1:10 ו 1:100 דילולים סדרתי, כלומר להוסיף 5 μl של השעיה חי ו45 μl של תמיסת מלח, ואז לקחת 5 μl של 1:10 ולהוסיף 45 μl של תמיסת מלח.
3. הוסף 5 μl של פתרון הסרום / פנול ו10 μl של השעיה מתגית למעגל. Homogenize ולהתפשט באופן שווה מסביב לאזור של המעגל עם ידית לולאה חד פעמית. חכה להשעיה לייבוש על שולחן מפולס.
4. אחרי דrying, לתקן את הכתם על ידי העברת השקופית 3 פעמים מעל הלהבה הכחולה של מבער בונזן (סביב 20 שניות סך הכל) ^11.
5. עבור מכתים, לכסות את כל פני השטח של השקופית עם carbofuchsine המסונן Ziehl-Neelsen (כ 5 מיליליטר) עבור 20 דקות.
6. יש לשטוף את השקופיות במים זורמים (זרימה איטית).
7. כסה את השקופית עם פתרון אלכוהול חומצה 10% לכ -20 שניות.
8. שטוף את השקופיות שוב במים זורמים.
9. כסה את השקופית עם פתרון מתילן כחול למשך 5 דקות.
10. יש לשטוף את השקופיות במים זורמים ולתת לו להתייבש בטמפרטורת חדר.
11. רוזן 20 שדות / עיגול (סה"כ 60 שדות / שקופיות) באמצעות מטרת טבילת שמן 100X. החישוב של מיליליטר חומצת חיידקים מהירים / (AFB / מיליליטר) נעשה באופן הבא, על פי התיאור בטכניקות המעבדה ^ל12 צרעת:
    AFB / שדה = מספר כולל של חיידקים שנמצאו ב3 העיגולים (60 שדות) מחולקים ב60.
    AFB / מיליליטר = AFB / שדה קבוע x (שטח המעגללפי תחומי צמצם העדשה האובייקטיבי x 100 מחולקים), ואם סופרים השעיה בדילול מלא, להכפיל את מספר AFB / מיליליטר על ידי הגורם לדילול (10 או 100).

3. קביעת כדאיות

1. לפני שמתחיל, להכין מ autoclaved ההשעיה leprae (פרוטוקול של חומרים כימיים - 7 לפרוטוקול). השתמש בערכה המתאימה (ראה טבלה של חומרים כימיים וציוד) להגדרה איכותית של מ ' כדאיות leprae בהשעיה. לדלל את הפתרונות באופן הבא (יש לבצע את כל הנהלים תחת אור העמום): לדלל פתרון בפקטור של 10 בתמיסת מלח (מניית μl 1 בתוספת מלח μl 9), לדלל פתרון B 20 בפקטור של בתמיסת מלח (מניית μl 1 בתוספת 19 מלוח μl).
2. הוספת 3.6 μl של פתרון מדולל ו6 μl של פתרון B המדולל ל200 μl של ההשעיה מהתגית להיבדק (צעד 1.10). מ 'autoclaved בעבר ההשעיה leprae משמשת באופן שגרתי כשליטת egative עבור מכתים כדאיות.
3. דגירה ההשעיות במשך 15 דקות, בטמפרטורת חדר בחושך.
4. צנטריפוגות הצינור ב10,600 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.
5. בטל supernatant ו resuspend את הכדור ב 15 μl של גליצרול 10%. החל 8 μl אל פני השטח של שקופית זכוכית נקייה ולכסות אותו עם להחליק את מכסה קטן. נתח את השקופית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, המכיל המסננים המתאימים (ראה המלצות בדיקות מולקולריות). להעריך את התוצאות על ידי השוואת Syto 9 (סאי) מכתים לpropidium יודיד מכתים (PI).
   הערה: כתם סאי חודר של שני חיידקים מתים וחיים 100%, וכתם PI חודר חיידקים רק עם ממברנות שניזוקו. ההשעיה autoclaved (הבקרה שלילית) עלולה להיווצר גושים של חיידקים בשל נוכחותם של פסולת הסלולר. בקנה מידה semiquantitative משמש להערכה חיות / מת משתנה 0-2 +; 0 מציין כי פחות מ 30% מהתאים הם חיוביים עבור כתם PI; 1 + פירוש בין 30 -50% מהתאים הם חיוביים עבור כתם PI; 2 + פירושו יותר מ -50% מהתאים הם חיוביים לכתם לצרכן. ציון של 0 נחשב מתאים ביותר לשימוש.

4. מ 'הקפאה / הפשרה השעיה leprae

1. לפני שמתחיל, להכין את מדיום ההקפאה (פרוטוקול של חומרים כימיים - פרוטוקול 6). להקפאה, השתמש בשלבים המתוארים להלן:
   1. הוסף 150 μl של ההשעיה המכיל 1 x 10 ⁷ AFB / מיליליטר לcryovial סטרילי יחד עם 1 מיליליטר של הקפאה בינונית.
   2. הנח את cryovial במכל הקפאה ולאחסן את המכל ב-80 ° C ל24 שעות.
   3. העבר את הבקבוקון הקפוא לקופסא אחסון ולאחסן אותו ב -80 ° C.
2. להפשרה, השתמשו בשלבים המתוארים להלן:
   1. הסר את cryovial עם ההשעיה הקפואה מ-80 מעלות צלזיוס ולמקם אותו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס להתחיל מפשיר את ההשעיה.
   2. יוצקים את ההשעיה לתוך צינור המכיל 20 מיליליטר של סטרילימי מלח. מערבבים את ההשעיה בעדינות עד הפשרה מלאה.
   3. צנטריפוגה ההשעיה למשך 30 דקות, ב1,700 XG, ב 4 ° C.
   4. בטל supernatant ולהוסיף מלח סטרילית מספיק כדי להגיע לעוצמת קול הרצוי. Homogenize ההשעיה ידי העברתו דרך מזרק (שלב 1.8).
   5. עבור מכתים ZN, נחישות ויכולת קיום חיסון, בצע את הפרוטוקולים 2, 3 ו -5.

5. עכבר הרכבת חיסון

1. שני אנשים נדרשים להליך זה, אחד לרסן את העכבר ועוד לנהל את הבידוד. בעלי החיים להיות מחוסן צריכים להיות מטופל על פי הנחיות ותקנות אתיות וכל ההליכים חייבים להיות מאושרים על ידי ועדת טיפול בבעלי החיים ושימוש המוסדית. לרסן את העכבר בעירום בעורפו של הצוואר עם הכפות פונה כלפי מעלה.
2. Homogenize ההשעיה ידי העברתו דרך מחט G 26. עם מזרק 1 מיליליטר, השעיה מתגית מספיק לשאוב לinoculate שתי כריות הרגלים (30 μl / שודד דרכים).
3. החזק את כף הרגל האחורית, לנקות שודדים עם 70% אלכוהול אתנול לפני הזריקה ולהציג intradermally המחט עם השיפוע של המחט הצביע למעלה, מהפרוקסימלי לצד הדיסטלי של השודד. הזרק 30 μl של ההשעיה. הזריקות שודדים עשויות להתבצע בעכברים מורדמים.
4. חכה 5 שניות לפני משיכת המחט מהעור, כדי למנוע ריפלוקס של הבידוד. עכברים צריכים להיות שוכנו בהודעת מצעי חיסון רך, וניידות וסימני השחתה עצמית צריכה להיות במעקב.

תוצאות

ההצלחה של הפרוטוקול ניתן להעריך בשלוש דרכים. ראשית, הערכה של איכות הבידוד נקבעת לפי כמות פסולת הסלולר וכתוצאה מכך אחוז של חיידקי קיימא בהשעיה הסופית (ראה פרוטוקול 3). כפי שניתן לראות באיורים 1 ו -2, ההשעיה מהתגית הסופית הכילה פסולת תא קטנה מאוד וכדאיות גבוהה (ציון 0 +); לציין כי רוב החיידקים מוכתמים בכתם פלואורסצנטי הירוק Syto 9 (כתם חודר של שני חיידקים מתים וחיים 100%, איור 1) ורק כמה חיידקים מוכתמים בכתם ניאון PI האדום (כתם חודר חיידקים רק עם ממברנות פגומות, איור 2).

איור 1. Syto 9 צביעה השעיה. הקרינה גרין מ 'leprae ממחישה את נוכחותו של מ' חיים והמתים leprae. 400X.

איור 2. מכתים PI של מ ' הקרינה השעיה. אדומה leprae מראה מספר הקטן של מתים מ ' leprae. 400X.

שנית, הבידוד עם כדאיות גבוהה ישפיע על ההכפלה של חיידקים בלכפות ההרגלים של בעלי חיים לאחר הודעה 4-5 חודשי חיסון, עם התפתחות נגע מקרוסקופית מובן מאליו, כפי שמוצג בווידאו (1 לפרוטוקול). הדרך השלישית כדי להעריך את הצלחתו של הפרוטוקול היא על ידי הערכת ההישרדות וההכפלה של AFB בלכפות הרגלי עכבר מחוסן עם חיידקים שהוקפאו לתקופות שונות (ראה 4 לפרוטוקול).

"Cellspacing =" 0 "> ניסוי (בעלי חיים) מספר AFB / מיליליטר קפוא ביום: 0 ציון כדאיות / יום: 0 הקפאת התקופה (ימים) מספר AFB מחוסן לאחר ההקפאה ציון כדאיות לאחר ההקפאה מספר AFB / מיליליטר התאושש לאחר 7 חודשים 1 (1) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 60 1.7 x 10 ⁵ 1 + 2.3 x 10 ⁸ 1 (2) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 60 1.7 x 10 ⁵ 1 + 3.8 x 10 ⁷ 1 (3) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 60 1.7 x 10 ⁵ 1 + 8.5 x 10 ⁷ 1 (4) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 60 1.7 x 10 ⁵ 1 + 4.6 x 10 ⁷ 2 (1) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 15 4.2 x 10 ⁵ 1 + 1.7 x 10 ⁷ 2 (2) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 15 4.2 x 10 ⁵ 1 + 4.8 x 10 ⁶ 2 (3) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 15 4.2 x 10 ⁵ 1 + 8.6 x 10 ⁶ 3 (1) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 15 1.7 x 10 ⁵ 1 + 1.2 x 10 ⁷ 3 (2) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 15 1.7 x 10 ⁵ 1 + 1.8 x 10 ⁷ 3 (3) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 15 1.7 x 10 ⁵ 1 + 1.8 x 10 ⁷ 3 (4) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 15 1.7 x 10 ⁵ 1 + 2.6 x 10 ⁷ 3 (5) 1.0 x 10 ⁷ 0 + 15 1.7 x 10 ⁵ 1 + 3.7 x 10 ⁶

טבלת 1. תוצאותיו של מ ' כפל leprae באמצעות השעיות הודעה הקפאה.

טבלת 1 מציגה את תוצאותיו של מ ' צמיחת leprae באמצעות השעיות לאחר ההקפאה. הציון הכדאיות של ההשעיות לאחר ההפשרה היה + 1. פרוטוקול ההקפאה בוצע בשלושה ניסויים בלתי תלויים כדי לבחון את תקופות הקפאה שונות. בשני הניסויים עם inocula הקפוא במשך 15 או 60 ימים, התוצאה הייתה דומה, עמ 'ropagation לאחר ההקפאה הניב 10-1,000 פעמים להגדיל במספר AFB התאושש משודדות לאחר 7 חודשים של חיסון (טבלה 1). לכן, הקפאתו של מ ' השעיות leprae ב7H9 המדיום השלים עם OADC (חומצת אלבומין דקסטרוז-קטלאז אולאית) הביאו לשמירה על הכדאיות.

שלושה inocula שימש להעריך מ ' leprae כפל אחרי שתי תקופות שונות הקפאה (15 ו60 ימים). לאחר 7 חודשים, חיידקים נתגלו לכפות הרגלים של עכברים מחוסן ונספרו לאחר צביעת Ziehl-Neelsen. בקנה מידה כדאיות semiquantitative: 0 אמצעים להיעדר עד 30% מתאים מוכתמים PI; 1 + אומר בין 30-50% מתאים מוכתמים PI; 2 + אומר מעל 50% מתאים מוכתמים לצרכן. AFB: חיידקי חומצה מהירים.

Discussion

תיאור מפורט של פרוטוקול מאויר היטב, מוצלח להתפשטותו של מ ' leprae יש צורך במידה רבה. המחקר שלנו מראה כי הפרוטוקול של הכנת הבידוד על ידי סינון ועיכול טריפסין מאפשר inocula שיתקבל עם פסולת הסלולר מעט מאוד ועם כדאיות גבוהה של חיידקים (ציון 0 +). נתרן הידרוקסידי נעשה שימוש כדי disaggregate הרקמות לטיהור של חיידקים ^6. מחקרים שבוצעו במעבדה שלנו באמצעות נתרן הידרוקסידי לטיהורו של מ ' leprae הביא להיווצרותם של גושים של חיידקים, פוגע הומוגניזציה של ההשעיה לקביעת כדאיות וחיסון בעלי חיים (מידע לא מוצג).

בעיות פוטנציאליות נתקלו בהכנת הבידוד על ידי סינון ועיכול טריפסין כוללות כמות גדולה של פסולת וזיהום סלולריים של הבידוד עם סוכני חיידקים או פטרייתי. במקרה כמויות גדולות של debr הסלולריהוא הם נצפו לאחר טיהור, או טריפסין כבר אינו פעיל או שיש כמות מוגזמת של חומר ביולוגי. פעילות האנזימטית של פתרון מניות טריפסין חייבת להיות מוערכת. אם כמות מוגזמת של חומר ביולוגי ראשוני חשודה, החומר צריך להיות מחולק לaliquots והפרוטוקול צריכה להתבצע בקבוצות נפרדות. כדי למנוע זיהום של הבידוד עם סוכני חיידקים או פטרייתי, יש להקפיד על מנת לעבד את החומר בתנאים אספטיים. אם פטרייתי ו / או זיהום חיידקים מזוהים אמורה להיות מושלכת ההשעיה.

הגבלה של הפרוטוקול שלנו היא הסובייקטיביות של הערכת הכדאיות בשיטה חצי כמותית המתוארת. הכדאיות העריכה חצי כמותית היא מעשית יותר, אם כי פחות מדויקת מאשר בשיטה כמותית פורסמה ^6. ציון כדאיות של 0 + ו 1 + הם משביעי רצון לצורך התחזוקה של התפשטות והקפאהמ 'leprae. להירי et al. כבר הראה כי עכברים בעירום מחוסן עם 80-90% הבידוד קיימא, לגרום לכפות הרגלים מתאימות לקצירה (חיידקים גבוה כדאיות) בשעה 4-5 חודשים של חיסון. לכן, זיהום מוקדם (סביב 4 חודשים) הוא זמן הקציר הטוב ביותר. לקציר של inocula הקפוא, העכברים בפרוטוקול הנוכחי נשמרו מחוסנים לתקופות ארוכות יותר (7 חודשים) כדי להבטיח את עקומות גדילה. שלב קריטי כדי להבטיח את יכולת הקיום נאותה הוא השימוש במתלי חיידקים טריים, רצוי בתוך 24 שעות לאחר איסוף חומר ביולוגי מהמארח והעיבוד. יתר על כן, איכות של חומרים כימיים, פתרונות טריפסין וכדאיות בדילול מוכנים טרי מכתים, נחוץ כדי להבטיח תוצאות לשחזור.

מגבלה נוספת של פרוטוקול זה היא שמ 'הסופי ההשעיה leprae אינה חופשית של DNA מארח, רנ"א, חלבונים, וכו '. לכן, יש להוסיף את הפעולות טיהור אחרות to לקבל מ ' leprae השעיה חופשית של מרכיבי תא מארחים.

שיטה לשמירה על חיידקי קיימא על ידי הקפאת דגימות רקמה כולה של מ ' נגעי leprae דווחו ^9. עם זאת, המחקר על ידי Portaels et al. אובדן הפגין משמעותי של כדאיות, הנע בין 65-97% לאחר ההקפאה והפשרה של מ ' leprae נגוע דגימות רקמה המתקבלות מארמדיל ^9. הפרוטוקול שלנו הראה כי מדד הכדאיות נצפה במ השעיות leprae לאחר הקפאה והפשרת ירד בהשוואה לaliquot שלא הוקפא (טבלת 1). ואכן, הקפאה מ ' ההשעיה leprae בתקשורת הקפאה הניבה כדאיות החל 50-70%, עם ציון כדאיות 1 +, ואילו ציון כדאיות 0 + הושג בהשעיה יצאה מן ההקפאה. יחד עם זאת, הכפל של מ ' leprae היה משביע רצון לאחר הודעה 7 חודשי חיסון של עכברים בעירום ( טבלת 1). החיסון של עכברים בעירום עם דגימות מחדש נשמר קפוא ל60 ימים הביאו 100 פעמים מתכוונים להגדיל במספר החיידקים בהשוואה לבידוד הראשוני. נראה כי הקפאה מ ' ההשעיה leprae בתקשורת הקפאה, במקום דגימות רקמה נגועות, היא יעילה יותר. שלב קריטי של הפרוטוקול שלנו הוא ההקפאה האיטית של AFB במכל הקפאה, נחוצה כדי לשמור על חיידקי קיימא, כפי שהודגם על ידי Colston והילסון ^8. ניסויים עתידיים יהיו נערכו על מנת להעריך את הכדאיות של חיידקים לאחר תקופות הקפאה ארוכות יותר.

לסיכום, כי מ ' leprae לא גדל במבחנה, הפרוטוקול שלנו מאפשר לאלטרנטיבה מהירה וקלה לתחזוקה של הבידוד קיימא, וצעד ההקפאה המוצלח מאפשר התחזוקה של זנים ללא מעבר מתמשך בבעלי חיים, ובכך לאפשר הקמת בנק של זנים מוגדרים.

סעיף זה כולל הוראות להכנת חומרים כימיים כדי לבצע פרוטוקול זה.

1. טריפסין

טריפסין	0.5 גרם
מים מזוקקים	עד 100 מיליליטר

סנן לעקר. חנות ב -20 ° C.

2. 7H9

בסיס מרק 7H9	4.7 גרם
40% מניית גליצרול	5 מיליליטר
מים מזוקקים	עד 900 מיליליטר

מערבבים את הבסיס במים ולאחר מכן להוסיף גליצרול תוך ערבוב. החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לעקר. חנות ב 4 ° C.

3. עירוי לב מוח (BHI)

BHI	37 גרם
מים מזוקקים	עד 1,000 מיליליטר

החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לעקר. חנות ב 4 ° C.

4. סרום פנול

4.1) פנול 5%

פנול	5 מיליליטר
מים מזוקקים	עד 100 מיליליטר

4.2) פנול סרום

בסרום שור עוברי	2 מיליליטר
פנול 5%	98 מיליליטר

חנות ב 4 ° C.

5. פתרונות לקר Ziehl-Neelsen כתם

5.1) CarboFuchsin

Fuchsin	1 גרם
גבישי פנול התמזגו 60 ° C	5 מיליליטר
אתיל אלכוהול טהור	10 מיליליטר
מים מזוקקים	עד 100 מיליליטר

לסנן לפני כל שימוש.

5.2) מתילן בלו בסיס

מתילן בלו	3 גרם
95% אתיל אלכוהול	עד 200 מיליליטר

5.3) חומצת אלכוהול

אלכוהול 70%	990 מיליליטר
חומצת chloridric	10 מיליליטר

6. בינוני להקפאה:

OADC	10 מיליליטר
גליצרול	20 מיליליטר
בינוני 7H9	עד 100 מיליליטר

החיטוי גליצרול לפני השימוש ולעקר OADC על ידי סינון.

7. Autoclaved מ ' השעיה leprae

החיטוי ב-C ° 121 עבור 20 דקות. חנות ב -20 ° C.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BacLight Bacterial Viability Kit	Invitrogen; Molecular Probes	L7007
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma	H9269
Cryo 1 °C Freezing Container	Nalgene	5100001
Lowenstein-Jensen medium	LB Laborclin	901122
Saline	TEK Nova Inc	S5812
Pen	Dako	S2002
Centrifuge tube 50 ml/conical base	TPP	91050
Cell strainer  - 40 µm Nylon	BD Falcon	352340
Trypsin	Sigma	T-7409
Middlebrook 7H9 Broth Base	Sigma-Aldrich	M0178 Fluka
Glycerol	Gibco BRL	15514011
Brain heart infusion (BHI)	Oxoid LTDA	CM1135
Fuchsin	Merck Millipore	1159370025
Phenol	Invitrogen	15509037
Ethyl alcohol	Merck Millipore	EX02764
Cloridric acid	Merck	1131349010
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase)	Becton Dickinson	211886
Fetal bovine serum	Gibco; LifeTechnologies	26140079