Protocoles optimisés pour<em&gt; Mycobacterium leprae</em&gt; Gestion de traction: Frozen Stock préservation et l&#39;entretien dans des souris nude athymiques

Résumé

Mycobacterium leprae, l'agent responsable de la lèpre, ne pousse pas in vitro. Nous décrivons un outil facile à suivre le protocole pour préparer une suspension bacillaire pour assurer le maintien de grandes quantités de M. leprae pour une variété d'applications. Protocoles pour la propagation par patte inoculation à la souris, l'évaluation de la viabilité, la congélation et la décongélation bacillaire actions sont décrites en détail.

Résumé

La lèpre, causée par Mycobacterium leprae, est une maladie infectieuse importante qui est encore endémique dans de nombreux pays à travers le monde, notamment au Brésil. Il n'y a pas de méthodes connues pour la culture M. leprae in vitro, en présentant un obstacle majeur à l'étude de ce pathogène dans le laboratoire. Par conséquent, le maintien et la croissance de M. souches leprae sont de préférence réalisées dans athymique souris nude (NU-Foxn1 ^nu). Les conditions de laboratoire pour l'utilisation de la souris sont disponibles, faciles à réaliser, et permettent la normalisation et le développement de protocoles pour obtenir des résultats reproductibles. Dans le présent rapport, nous décrivons un protocole simple pour la purification de bacilles de coussinets de souris nues utilisant la trypsine, ce qui donne une suspension de débris de cellule minimum et à haut indice de viabilité bactérienne, telle que déterminée par microscopie à fluorescence. Une modification de la méthode de référence pour le comptage bacillaire par la coloration de Ziehl-Neelsencoloration et microscopie optique est également démontrée. En outre, nous décrivons un protocole pour la congélation et la décongélation des stocks bacillaires comme un protocole alternatif pour la maintenance et le stockage de M. souches leprae.

Introduction

La lèpre, une maladie provoquée par Mycobacterium leprae, est un problème important de santé publique dans de nombreux pays à travers le monde ^1,2. En dépit d'être connue comme une maladie infectieuse qui affecte la peau et les nerfs périphériques, il ya encore plusieurs lacunes dans les connaissances sur les mécanismes impliqués dans la immunopathogenèse complexe de la maladie.

Parmi les caractéristiques difficiles de M. leprae qui entravent son étude sont son incapacité à croître dans des milieux de culture artificielle et son temps de doublement relativement longue (environ 14 jours) ^3,4. La plupart des procédures expérimentales qui utilisent M. leprae sont mis en place avec des bacilles purifiés à partir de lésions de la peau de patients atteints de la lèpre ou de modèles animaux expérimentaux, comme le tatou et plusieurs souches de souris ^5,6.

Pendant de nombreuses années, les chercheurs ont compté sur la purification de M. leprae des lésions cutanées de LEPR multibacillairepatients osy pour utilisation dans des procédures expérimentales. Plusieurs des conditions de laboratoire pour la culture ou le maintien in vitro de M. direct leprae ont été tentées, mais à ce jour, les modèles animaux se sont révélés être le plus approprié à des fins de recherche. Dans les années 1960 et 1970, les chercheurs ont commencé à utiliser la souris et le tatou pour la détection et l'évaluation de M. leprae viabilité, la surveillance de la croissance bactérienne en réponse à anti-M. médicaments leprae, et dans la croissance et l'entretien des souches de mycobactéries ^2,4.

Les modèles animaux ont des limites, en particulier chez les tatous et les primates non humains, y compris les préoccupations éthiques, le coût de la maintenance, de l'infrastructure spéciale nécessaire à l'entretien des animaux, et une mauvaise reproductibilité des résultats et des rendements finaux. Actuellement, les souris sont le modèle animal préféré pour la recherche sur la lèpre. Les conditions de laboratoire pour l'utilisation de la souris sont disponibles, faciles à réaliser, et permettent des protocoles normalisés ^{7.8.9. Les souris nude ont été utilisés dans le maintien de M. leprae souches parce que, même avec de faibles charges bacillaire viables, la réponse immunitaire déficient lymphocytes T conduit à la formation de granulomes exubérante et bon multiplication bacillaire. Ainsi, ce modèle animal a gagné une large acceptation au sein de la communauté de recherche sur la lèpre.}

Dans le présent rapport, nous décrivons un protocole simple pour la purification enzymatique de bacilles de coussinets de souris nude, destinés à la préparation d'un M. leprae suspension de débris de cellule minimale et à haut indice de viabilité bactérienne. La viabilité est déterminée par microscopie à fluorescence, qui peut être effectuée rapidement au laboratoire. Nous démontrons également une modification de la méthode de référence pour le comptage par bacillaire froid coloration de Ziehl-Neelsen et la microscopie optique. En outre, nous présentons un protocole alternatif pour l'entretien et le stockage de M. souches leprae, permettant la congélation et la décongélation de bacillaire stocks.

Protocole

Une. Préparation de Suspension Mycobacterium leprae

1. Avant euthanasier la souris nude athymiques (NU-Foxn1 ^nu), préparer la solution de trypsine et de milieux de culture (Protocole des réactifs - Protocoles 1, 2 et 3). Euthanasier la souris nude 4-5 mois après l'inoculation avec M. leprae selon les lignes directrices de l'AVMA sur l'euthanasie des animaux: 2013 Édition ¹⁰ (les expériences et l'utilisation des images d'animaux ont été approuvées et menées en conformité avec les directives du Comité de protection des animaux de Faculdade de Odontologia de Bauru, USP). L'intérieur d'une enceinte de sécurité biologique utilisé pour la manipulation des animaux, nettoyer toute la souris avec de l'alcool d'éthanol à 70%.
2. Maintenez la patte arrière à l'aide des pinces hémostatiques distales à l'articulation du tarse. Couper la patte avec des ciseaux en dessous des pinces et plongez la patte dans 2% d'iode pour 20 min. Ensuite, répétez la procédure pour l'autre patte arrière.
3. Transférer les pattes à uneenceinte de sécurité biologique propre pour la poursuite des travaux. Prenez pattes sur les 2% d'iode, les sécher avec une gaze stérile et recueillir les deux coussinets en utilisant le numéro 22 ou 23 lame de scalpel, enlever tous les tissus mous (derme, épiderme, les tendons et les nerfs) près de l'os. Retirez les métatarsiens os et le 1er et 5e phalanges. Placez le matériel dans une boîte de Pétri stérile et retirer l'épiderme, par racler avec la lame de scalpel. Coupez le tissu en petits morceaux avec des ciseaux et de les transférer dans un tube à fond rond. Poids du tissu et ajouter 1 ml de solution saline équilibrée de Hanks (HBSS). Maintenir le tube sur de la glace pour éviter l'échauffement de l'échantillon.
4. Ajouter un autre 1 ml de HBSS et homogénéiser l'échantillon en utilisant un homogénéisateur de tissu.
   1. Premier cycle d'homogénéisation: 3 impulsions de 15 secondes à la vitesse 4 (14 450 rpm).
   2. Transférer le surnageant dans un tube de 50 ml conique stérile, faisant passer à travers un tamis cellulaire pour éliminer les débris restants. Laisser la solution passe par gravité.
   3. Ajouter un 2 ml supplémentaires de HBSS, et répéter le cycle d'homogénéisation (section 1.4.1), et passer les échantillons à travers le tamis de la cellule à nouveau.
   4. Rincer la crépine en ajoutant HBSS pour porter le volume à 9 ml. Jeter le filtre cellulaire.
5. Décongeler une aliquote de solution de trypsine à 0,5%. Ajouter 1 ml de trypsine à 9 ml de suspension de cellules pour obtenir une concentration finale de 0,05% de trypsine. Jeter le reste de la trypsine décongelé. Incuber pendant 60 min dans un bain-marie à 37 °. Après incubation, porter le volume à 40 ml par addition d'une solution saline stérile pour diluer la trypsine.
6. Centrifuger à 1700 g pendant 30 min à 4 ° C.
7. Jeter le surnageant en retournant soigneusement le tube. Reprendre le culot en appuyant sur le tube, puis ajouter 1 ml de solution saline stérile. Transférer la suspension dans un nouveau tube conique mesurant le volume final de la suspension (à calculer le rendement / gramme de tissu).
8. Homogénéiser la suspension bacillaire l'aide d'un 1 ml insuline seringue avec une aiguille 26 G pendant le transfert de la suspension dans un nouveau tube.
9. Effectuer un contrôle microbiologique de la suspension en plaçant 2 gouttes (50 ul) de celui-ci dans chaque milieu: 7H9 et milieu de Lowenstein-Jensen et incuber à 37 ° C pendant 30 jours, pour la détection de contamination mycobactéries. De même, inoculer une infusion cœur-cervelle (BHI) moyen et incuber pendant 24 heures à 37 ° C, pour la détection de contamination de bactéries aérobies.
10. Aliquoter la suspension dans des tubes pour la coloration: 35 pi pour Cold Ziehl-Neelsen (protocole n ° 2), et 200 pi pour la détermination de la viabilité (protocole n ° 3).
11. Après Ziehl-Neelsen (ZN), calculer le nombre de bacilles acido / ml (AFB / ml). Pour nu souris inoculation, préparer un AFB / ml suspension 1 x 10 ^8, assurez-vous d'avoir assez de volume pour inoculer 30 pl / coussinet / animaux (protocole n ° 5), et de garder le froid de suspension jusqu'à l'inoculation. Pour la congélation, préparer un 1 x 10 ⁷ AFB / ml suspensionpension (protocole n ° 4).

2. Froid Ziehl-Neelsen

1. Avant de commencer la coloration, préparer la solution de sérum / phénol et les solutions de coloration ZN (Protocole des réactifs - Protocoles 4 et 5). Dessinez trois cercles (diamètre intérieur 10 mm) sur trois lames de verre à l'aide d'un stylo d'immunohistochimie. Identifier les diapositives: (1) normales ou non dilués, (2) 1:10, et (3) 1:100 aide d'un crayon numéro 2 (Note: certains graphite s'estompe après ZN).
2. Diluer la suspension bacillaire (étape 1.10) à 01h10 et 1:100 dilutions en série, c'est à dire ajouter 5 ul de suspension non diluée et 45 ul de solution saline, puis prendre 5 pi de 01h10 et ajouter 45 ul de solution saline.
3. Ajouter 5 ul de la solution de sérum / phénol et 10 ul de suspension bacillaire par cercle. Homogénéiser et répartir uniformément autour de la zone du cercle avec la poignée d'une boucle jetable. Attendez que la suspension à sécher sur une table à niveau.
4. Après drying, fixer le frottis en passant la lame 3 fois au cours de la flamme bleue d'un bec Bunsen (environ 20 secondes au total) ^11.
5. Pour la coloration, couvrir toute la surface de la lame avec filtré carbofuchsine Ziehl-Neelsen (environ 5 ml) pendant 20 min.
6. Rincer sous l'eau (débit lent) en cours d'exécution.
7. Recouvrir la lame avec une solution à 10% d'alcool de l'acide pour environ 20 sec.
8. Laver ensuite la lame dans l'eau courante.
9. Recouvrir la lame avec une solution de bleu de méthylène pendant 5 min.
10. Rincer sous l'eau courante et laissez-les sécher à température ambiante.
11. Comptez 20 champs / cercle (total 60 champs / diaporama) en utilisant un objectif à immersion d'huile 100X. Le calcul des bacilles acido / ml (AFB / ml) se fait comme suit, selon la description dans les techniques de laboratoire pour la lèpre ^12:
    AFB / champ = nombre total de bacilles présents dans les 3 cercles (60 champs) divisé par 60.
    AFB / ml = AFB / champ constante x (aire du cerclex 100 divisé par zone de l'ouverture de l'objectif), et si le comptage d'une suspension diluée, multipliez le nombre de BAAR / ml par le facteur de dilution (10 ou 100).

3. Détermination viabilité

1. Avant de commencer, préparer l'M. autoclave leprae suspension (Protocole des réactifs - Protocole n ° 7). Utilisez le kit approprié (voir tableau des réactifs et du matériel) pour la détermination qualitative de M. leprae viabilité dans la suspension. Diluer les solutions comme suit (toutes les procédures doivent être effectuées sous une lumière faible): diluer la solution A par un facteur de 10 dans une solution saline (1 pi actions plus 9 pi saline), diluer la solution B 20 d'un facteur dans une solution saline (1 pi actions plus 19 ul solution saline).
2. Ajouter 3,6 pl d'une solution diluée et 6 ul de solution B diluée à 200 ul de la suspension bacillaire à tester (étape 1.10). A M. préalablement autoclave leprae suspension est couramment utilisé comme uncontrôle egative pour la viabilité coloration.
3. Incuber les suspensions pendant 15 minutes, à la température ambiante dans l'obscurité.
4. Centrifuger le tube à 10 600 g pendant 5 min à 4 ° C.
5. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 15 ul de 10% de glycérol. Appliquer 8 pi à la surface d'une lame de verre propre et couvrir avec une petite lamelle. Analyser la diapositive à l'aide d'un microscope à fluorescence, contenant les filtres appropriés (voir les recommandations Molecular Probes). Évaluer les résultats en comparant Syto 9 (Sy) coloration à l'iodure (PI) coloration propidium.
   Remarque: Sy tache pénètre à 100% des deux bactéries mortes et vivantes, et PI tache ne pénètre que les bactéries avec des membranes endommagées. La suspension autoclavée (témoin négatif) peut se former des amas de bactéries en raison de la présence de débris cellulaires. L'échelle utilisée pour l'évaluation semi-quantitative en direct / morts varie de 0 à 2 +; 0 indique que moins de 30% des cellules sont positives pour PI tache; 1 + signifie entre 30 -50% des cellules sont positives pour la coloration PI; 2 + signifie que plus de 50% des cellules sont positives pour la coloration PI. Un score de 0 est considérée comme la plus appropriée pour l'utilisation.

4. Point de congélation / décongélation M. leprae Suspension

1. Avant de commencer, préparer le milieu de congélation (Protocole des réactifs - Protocole n ° 6). Pour la congélation, utiliser les étapes décrites ci-dessous:
   1. Ajouter 150 ul de la suspension contenant de 1 x 10 ⁷ AFB / ml à un tube cryogénique stérile avec 1 ml de milieu de congélation.
   2. Placer le tube cryogénique dans un récipient de congélation et de stocker le récipient à -80 ° C pendant 24 heures.
   3. Transférer le flacon congelé à une boîte de rangement et stocker à -80 ° C.
2. Pour la décongélation, suivez les étapes décrites ci-dessous:
   1. Retirer le tube cryogénique avec la suspension congelée de -80 ° C et le placer dans un bain d'eau à 37 ° C pour démarrer la décongélation de la suspension.
   2. Verser la suspension dans un tube contenant 20 ml de stérilesune solution saline. Mélanger la suspension doucement jusqu'à ce que la décongélation est terminée.
   3. Centrifuger la suspension pendant 30 minutes, à 1700 xg, à 4 ° C.
   4. Jeter le surnageant et ajouter suffisamment de solution saline stérile pour atteindre le volume souhaité. Homogénéiser la suspension en la faisant passer à travers une seringue (étape 1.8).
   5. Pour la coloration de ZN, la détermination de la viabilité et de l'inoculation, suivre les protocoles 2, 3 et 5.

5. Souris inoculation

1. Deux personnes sont nécessaires pour cette procédure, un pour retenir la souris et un autre pour administrer l'inoculum. L'animal doit être inoculé doit être manipulé selon les directives et les règlements éthiques et toutes les procédures doit être approuvée par le comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle. Retenez la souris nude par la peau du cou avec les pattes vers le haut.
2. Homogénéiser la suspension en la faisant passer à travers une aiguille 26 G. Avec une seringue de 1 ml, aspirer suffisamment de suspension bacillaire à inoculumste deux coussinets (30 pl / coussinet plantaire).
3. Maintenez la patte arrière, nettoyer la patte avec de l'éthanol alcool à 70% avant l'injection et introduire la voie intradermique aiguille avec le biseau de l'aiguille pointée vers le haut, de l'extrémité proximale de la partie distale de la patte. Injecter 30 ul de la suspension. Les injections peuvent être réalisées coussinet plantaire chez des souris anesthésiées.
4. Attendez 5 secondes avant de retirer l'aiguille de la peau pour éviter le reflux de l'inoculum. Souris devraient être hébergés sur le doux literie après l'inoculation, et la marche et des signes d'automutilation doivent être surveillés.

Résultats

Le succès du protocole peut être évaluée de trois façons. Premièrement, l'évaluation de la qualité de l'inoculum est déterminée par la quantité de débris cellulaires et le pourcentage résultant de bacilles viables dans la suspension finale (voir protocole 3). Comme le montre les figures 1 et 2, la suspension bacillaire final contenait très peu de débris cellulaires et une viabilité élevée (score 0 +); noter que la plupart des bacilles colorés avec la Syto 9 tache fluorescente verte (tache pénètre à 100% des deux bactéries mortes et vivantes, Figure 1) et seulement quelques bacilles colorés avec le colorant fluorescent de PI rouge (tache ne pénètre que les bactéries avec des membranes endommagées, figure 2).

Figure 1. Syto 9 coloration de M. leprae suspension. Fluorescence verte démontre la présence de vivant et mort M. leprae. 400X.

Figure 2. PI coloration de M. leprae suspension. Rouge fluorescence montrant le petit nombre de morts M. leprae. 400X.

Deuxièmement, un inoculum de haute viabilité aura un impact sur la multiplication des bacilles dans les pattes des animaux après 4-5 mois après l'inoculation, avec le développement de la lésion macroscopique évidente, comme le montre la vidéo (Protocole 1). La troisième façon d'évaluer le succès du protocole consiste à évaluer la survie et la multiplication des BAAR dans les coussinets plantaires de souris inoculées avec des bacilles qui avaient été gelés pour différentes périodes (Voir protocole n ° 4).

"Cellspacing =" 0 "> Expérience (animal) Nombre de AFB / ml congelé au jour 0 Le score à la viabilité / jour 0 Période de congélation (jours) Nombre de AFB inoculé après congélation Le score à la viabilité après congélation Nombre de BAAR / ml récupérés après 7 mois 1 (1) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 60 1,7 x 10 ⁵ 1 + 2,3 x 10 ⁸ 1 (2) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 60 1,7 x 10 ⁵ 1 + 3,8 x 10 ⁷ 1 (3) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 60 1,7 x 10 ⁵ 1 + 8,5 x 10 ⁷ 1 (4) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 60 1,7 x 10 ⁵ 1 + 4,6 x 10 ⁷ 2 (1) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 4,2 x 10 ⁵ 1 + 1,7 x 10 ⁷ 2 (2) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 4,2 x 10 ⁵ 1 + 4,8 x 10 ⁶ 2 (3) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 4,2 x 10 ⁵ 1 + 8,6 x 10 ⁶ 3 (1) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1,7 x 10 ⁵ 1 + 1,2 x 10 ⁷ 3 (2) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1,7 x 10 ⁵ 1 + 1,8 x 10 ⁷ 3 (3) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1,7 x 10 ⁵ 1 + 1,8 x 10 ⁷ 3 (4) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1,7 x 10 ⁵ 1 + 2,6 x 10 ⁷ 3 (5) 1,0 x 10 ⁷ 0 + 15 1,7 x 10 ⁵ 1 + 3,7 x 10 ⁶

Tableau 1. Les résultats de M. multiplication leprae utilisant des suspensions poste de congélation.

Le tableau 1 représente les résultats de M. croissance leprae utilisant des suspensions après congélation. Le score de viabilité des suspensions après décongélation était de 1 +. Le protocole de congélation a été effectuée dans trois expériences indépendantes pour tester différentes périodes de gel. Dans les deux expériences avec inoculum congelé pendant 15 ou 60 jours, le résultat était similaire, propagation après congélation donné 10-1000 fois augmenter le nombre de BAAR récupéré de chaque pied après 7 mois d'inoculation (tableau 1). Par conséquent, le gel de M. suspensions leprae en milieu 7H9 supplémenté avec OADC (acide oléique-albumine-dextrose-catalase) a entraîné le maintien de la viabilité.

Trois inoculums ont été utilisés pour évaluer M. leprae multiplicative après deux périodes de gel différentes (15 et 60 jours). Après 7 mois, les bacilles ont été récupérés de coussinets de souris inoculées et comptées après Ziehl-Neelsen. Échelle semi-quantitative de la viabilité: 0 signifie absent jusqu'à 30% de cellules colorées PI; 1 + signifie entre 30-50% de cellules marquées PI; 2 + signifie plus de 50% de cellules colorées PI. AFB: bacilles acido.

Discussion

Une description détaillée d'un bien illustré, le protocole de propagation de succès pour M. leprae est grandement nécessaire. Notre étude démontre que le protocole de préparation de l'inoculum par filtration et digestion par la trypsine permet l'inoculation d'obtenir avec très peu de débris cellulaires et avec une grande viabilité des bacilles (score 0 +). L'hydroxyde de sodium a été utilisé pour désagréger le tissu pour la purification de bacilles ^6. Des études effectuées dans notre laboratoire en utilisant de l'hydroxyde de sodium pour la purification de M. leprae a donné lieu à la formation d'amas de bacilles, ce qui entrave l'homogénéisation de la suspension pour la détermination de la viabilité et l'inoculation des animaux (données non présentées).

Les problèmes potentiels rencontrés avec la préparation de l'inoculum par filtration et digestion par la trypsine comprennent une grande quantité de débris cellulaires et de la contamination de l'inoculum avec les agents bactériens ou fongiques. En cas de grandes quantités de debr cellulaireest sont observés après purification, soit la trypsine n'est plus active ou il ya une quantité excessive de matière biologique. L'activité enzymatique de la solution mère de la trypsine doit être évaluée. Si la quantité excessive de matière biologique initial est suspectée, le matériel doit être divisé en aliquotes et le protocole doit être effectué en lots séparés. Pour éviter la contamination de l'inoculum avec les agents bactériens ou fongiques, des précautions doivent être prises pour traiter le matériau dans des conditions aseptiques. Si fongique et / ou la contamination bactérienne sont détectées la suspension doit être jetée.

Une limitation de notre protocole est la subjectivité de l'évaluation de la viabilité en utilisant la méthode semi-quantitative décrite. Viabilité évaluée semi-quantitativement est plus pratique, bien que moins précise que la méthode quantitative publié ^6. Le score à la viabilité de 0 + et 1 + sont satisfaisants pour l'entretien de la propagation et le gel desM. leprae. Lahiri et al. ont déjà montré que des souris nues inoculées avec 80-90% inoculum viable, entraînent coussinets appropriés pour la récolte (haute viabilité des bacilles) à 4-5 mois de l'inoculation. Par conséquent, l'infection précoce (environ 4 mois) est le meilleur moment de la récolte. Pour la récolte de inoculum congelé, les souris dans le présent protocole ont été maintenues inoculé pendant de longues périodes (7 mois) pour garantir des courbes de croissance. Une étape cruciale pour assurer la viabilité adéquat est l'utilisation de suspensions de bacilles fraîches, de préférence moins de 24 h après le prélèvement de la matière biologique de l'hôte et de la transformation. En outre, la qualité des réactifs, des solutions de coloration de la trypsine et de viabilité dilué fraîchement préparés, sont nécessaires pour garantir des résultats reproductibles.

Une autre limitation de ce protocole est que la finale M. leprae suspension n'est pas exempt d'ADN de l'hôte, de l'ARN, protéine, etc. Par conséquent, d'autres étapes de purification doivent être ajoutés to obtenir un M. leprae suspension exempte de composants cellulaires de l'hôte.

Procédé pour maintenir bacilles viables par congélation des échantillons de tissus entiers de M. lésions leprae a été rapporté ^9. Cependant, l'étude par Portaels et al. démontré une perte significative de viabilité, comprise entre 65-97% après congélation et décongélation de M. leprae infecté échantillons de tissus obtenus à partir de tatou ^9. Notre protocole a montré que l'indice de viabilité observée en M. suspensions leprae après congélation et de décongélation a chuté par rapport à l'aliquote qui n'avaient pas été congelée (tableau 1). En effet, le gel ou le M. leprae suspension dans un milieu de congélation a abouti à la viabilité allant de 50-70%, avec un score de viabilité 1 +, tandis que des notes de viabilité 0 + a été obtenue dans la suspension non gelée. Néanmoins, la multiplication de M. leprae a été satisfaisante après 7 mois après l'inoculation des souris nues ( Tableau 1). L'inoculation des souris nude avec des échantillons reconstitués maintenu congelé pendant 60 jours a entraîné moyenne 100 fois augmentation du nombre de bacilles par rapport à l'inoculum initial. Il ressort que la congélation M. leprae suspension dans un milieu de congélation, à la place des échantillons de tissus infectés, est plus efficace. Une étape cruciale de notre protocole est la congélation lente de l'AFB dans un récipient le gel, nécessaire pour maintenir la bacilles viables, comme l'a démontré par Colston et Hilson ^8. Futures expériences seront menées pour évaluer la viabilité des bacilles après des périodes de gel plus longues.

En résumé, parce que M. leprae ne pousse pas in vitro, notre protocole permet une alternative rapide et facile pour l'entretien de l'inoculum viable, et l'étape de congélation succès permet le maintien des souches sans passage continu chez les animaux, permettant ainsi la création d'une banque de souches définies.

Cette section contient des instructions pour la préparation de réactifs pour effectuer ce protocole.

Une. Trypsine

Trypsine	0,5 g
L'eau distillée	Compléter à 100 ml

Stériliser par filtration. Conserver à -20 ° C.

2. 7H9

7H9 base de bouillon	4,7 g
40% stock de glycérol	5 ml
L'eau distillée	jusqu'à 900 ml

Mélanger la base avec de l'eau puis ajouter le glycérol en remuant. Autoclave à 121 ° C pendant 20 min pour stériliser. Stocker à 4 ° C.

3. l'infusion de coeur de cerveau (BHI)

BHI	37 g
L'eau distillée	jusqu'à 1000 ml

Autoclave à 121 ° C pendant 15 min pour stériliser. Stocker à 4 ° C.

4. de sérum de Phénol

4.1) 5% de phénol

Phénol	5 ml
L'eau distillée	Compléter à 100 ml

4.2) phénol Serum

sérum de veau foetal	2 ml
5% de phénol	98 ml

Stocker à 4 ° C.

5. Solutions pour le froid Ziehl-Neelsen

5.1) CarboFuchsin

Fuchsin	1 g
cristaux de phénol fusionnés à 60 ° C	5 ml
Alcool éthylique pur	10 ml
L'eau distillée	Compléter à 100 ml

Filtrage avant chaque utilisation.

5.2) de bleu de méthylène base

Bleu de méthylène	3 g
L'alcool éthylique à 95%	jusqu'à 200 ml

5.3) Alcool Acide

70% d'alcool	990 ml
acide chloridric	10 ml

6. Moyenne pour la congélation:

OADC	10 ml
Glycérol	20 ml
Milieu 7H9	Compléter à 100 ml

Autoclave glycérol avant utilisation et stériliser OADC par filtration.

7. M. autoclave leprae suspension

Autoclave à 121 ° C pendant 20 min. Conserver à -20 ° C.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
BacLight Bacterial Viability Kit	Invitrogen; Molecular Probes	L7007
Hanks' balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma	H9269
Cryo 1 °C Freezing Container	Nalgene	5100001
Lowenstein-Jensen medium	LB Laborclin	901122
Saline	TEK Nova Inc	S5812
Pen	Dako	S2002
Centrifuge tube 50 ml/conical base	TPP	91050
Cell strainer  - 40 µm Nylon	BD Falcon	352340
Trypsin	Sigma	T-7409
Middlebrook 7H9 Broth Base	Sigma-Aldrich	M0178 Fluka
Glycerol	Gibco BRL	15514011
Brain heart infusion (BHI)	Oxoid LTDA	CM1135
Fuchsin	Merck Millipore	1159370025
Phenol	Invitrogen	15509037
Ethyl alcohol	Merck Millipore	EX02764
Cloridric acid	Merck	1131349010
BBL Middlebrook OADC (oleic acid-albumin-dextrose-catalase)	Becton Dickinson	211886
Fetal bovine serum	Gibco; LifeTechnologies	26140079