JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الانضمام إلى العدلة البطانة تفعيلها في مواقع الإصابة هي جزء لا يتجزأ من استجابة المضيف للالتهابات. وصفها في هذا التقرير هو فحص ملزم العدلة التي تسمح لل في المختبر الكميات من العدلات الإنسان الأساسية ملزمة لخلايا بطانة الأوعية الدموية تفعيلها من خلال وسطاء التهابات في ظل ظروف ثابتة.

Abstract

البطانة الوعائية يلعب دورا أساسيا في استجابة التهابية. أثناء المرحلة الحادة من الالتهاب، ويتم تنشيط الخلايا البطانية (ECS) من خلال وسطاء المضيف أو مباشرة من قبل مكونات الميكروبية الحفظ أو جزيئات خطر المضيف المشتقة. المنشط ECS صريحة السيتوكينات، كيموكينات وجزيئات الالتصاق التي تعمل على حشد وتفعيل والاحتفاظ الكريات البيض في موقع العدوى أو الإصابة. العدلات هي أول الكريات البيض للوصول، والتمسك البطانة من خلال مجموعة متنوعة من جزيئات الالتصاق موجودة على سطوح الخلايا على حد سواء. أهم وظائف العدلات هي للقضاء على تهديدات مباشرة الميكروبية، وتعزيز تجنيد الكريات البيض الأخرى من خلال الافراج عن عوامل إضافية، والشروع في إصلاح الجرح. ولذلك، تجنيدهم والتعلق البطانة هو خطوة حاسمة في الشروع في الاستجابة الالتهابية. في هذا التقرير، وصفنا في المختبر العدلة مقايسة التصاق باستخدامcalcein AM المسمى العدلات الإنسان الأساسية ل quantitate مدى الاوعية الدموية الدقيقة تنشيط الخلايا البطانية في ظل ظروف ثابتة. هذا الأسلوب له ميزة إضافية أن نفس العينات quantitated بواسطة القياس الطيفي مضان يمكن أيضا تصور مباشرة باستخدام المجهر مضان لإجراء تقييم أكثر النوعي للملزمة العدلة.

Introduction

منذ بطانة الأوعية الدموية هي في اتصال مباشر مع الدورة الدموية، وهو يقع بشكل فريد لبدء الاستجابة الالتهابية السريع خلال العدوى أو الإصابة. الخلايا البطانية (ECS) مستقبلات التعرف على نمط صريحة تعترف مجموعة متنوعة من المكونات البكتيرية الحفظ والجزيئات خطر، ومستقبلات للوسطاء المضيف التهابات مثل TNFα. تفعيل هذه المستقبلات يؤدي إلى إفراز السيتوكينات ECS (مثل IL-6، IL-8، CXCL1 وCCL2)، وupregulate جزيئات الالتصاق (على سبيل المثال E / ف selectin، VCAM-1 و ICAM-1) على سطح الخلية الخاصة بهم 1 ، 2. كل هذه الجزيئات تسهيل توطين الكريات البيض إلى مواقع الإصابة والإصابات من أجل مسح مجموعة من العوامل المعدية، والشروع في إصلاح الأنسجة 3،4. الاستجابة العدلة للإصابة ينطوي على تفاعل منسقة تنسيقا جيدا بين بطانة الأوعية الدموية والاستجابة العدلات. عند تفعيل EC، IL-8 ويفرز ويشكل التدرج داخل الأوعية الدموية على البطانة التي تسمح العدلات إلى الوطن الدخول إلى موقع العدوى أو الإصابة 5،6. E / P-selectins التوسط العدلة التقاط والمتداول من خلال الجمعيات ضعيفة نسبيا مع glycomolecules على سطح الخلية العدلة. هذه التفاعلات، جنبا إلى جنب مع IL-8 ملزم لمستقبلات لها وما شابه ذلك، وتيسير قوية، والتعلق إنتغرين بوساطة والاعتقال في نهاية المطاف من العدلات على سطح الخلية البطانية 7-10. بعد الاعتقال، يمكن العدلات تهاجر من الأوعية الدموية إلى مواقع محددة للعدوى للقضاء على مسببات الأمراض مباشرة، وتوليد الفخاخ خارج الخلية العدلات لمنع انتشار مسببات الأمراض، وتعزيز التئام الجروح والافراج عن العوامل الإضافية التي تجنيد الكريات البيض الأخرى مثل وحيدات، الضامة وشجيري الخلايا 11-17.

وصفها في هذا التقرير هو طريقة في المختبر ل quantitate التقيد العدلة لmicrovascular ECS بعد التنشيط من قبل المضيف الوسيط التهابات TNFα. تم تصميم هذا الاختبار لتقييم تفعيل ECS، وليس العدلات. العدلات الإنسان الأساسية هي الأولى في عزل باستخدام الفصل المتدرج الكثافة، ومن ثم وصفت مع calcein acetoxymethyl (AM). الاسترات داخل الخلايا الحية يتحلل calcein صباحا إلى جزيء calcein نيون للغاية مع الإثارة من 492-495 نانومتر، والانبعاثات من 513-516 نانومتر 18. ثم يتم تحضين العدلات fluorescently المسمى مع الطبقات الوحيدة EC، وتتم إزالة العدلات غير ملتصقة في وقت لاحق. ثم يقاس مضان من تبقى من العدلات، متجهة باستخدام مقياس الطيف الضوئي مضان، وتحسب كنسبة مئوية من إجمالي المدخلات مضان العدلة لكل بئر. هذا الأسلوب له ميزة إضافية أن العدلات منضم calcein المسمى المستخدمة في القياس الطيفي يمكن تصور مباشرة باستخدام المجهر مضان لإعطاء مزيد من نوعي تلا من EC ACtivation. منذ يتم تنفيذ هذا الاختبار في ظل ظروف ثابتة، وسوف يتم تقييم فقط الأحداث الأولي جدا التي تحدث في تتالي التصاق الخلايا المتعادلة. ويتأكد هذا في هذا التقرير باستخدام الأجسام المضادة حجب E-selectin لإظهار أن انضمام العدلة إلى المعالجة TNFα البشرية الرئة الاوعية الدموية الدقيقة EC (HMVEC والرئة) يتم تقليل الطبقات الوحيدة جذريا عندما تعطل التفاعل مع E-selectin.

بالإضافة إلى TNFα، وقد استخدمنا بنجاح هذا الاختبار لتحديد مدى الوريد EC تفعيل السري الإنسان (HUVEC) من قبل تول مثل مستقبلات 1/2 منبهات البروتين الدهني ببتيدوغليكان المصاحب (PAL)، murein البروتين الدهني (MLP) وPam3Cys و تفعيل HMVEC والرئة بواسطة Pam3Cys 19،20. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمنا بنجاح هذا الاختبار مع مثبطات كيناز وبعد ضربة قاضية رني بوساطة من سطح البروتينات وحشوية في HMVEC والرئة، مما يوحي بأن هذه المنهجية هو متوافق مع مجموعة متنوعة من البيوكيميائية وscreeninز المقايسات 20. وباختصار، هذا الاختبار يوفر وسيلة سهلة الاستخدام، واستنساخه الطريقة، أكثر وظيفية للوصول إلى مدى تفعيل EC عن التهابات وسطاء في المختبر.

Protocol

1. الطلاء والصيانة من الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة

  1. ذوبان الجليد وتنمو الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الخاصة بك وفقا لتعليمات الشركات المصنعة الموردة. في هذا البروتوكول، ما نمت الخلايا في EGM-2 وسائل الإعلام MV (ونزا)، ويوصى بأن يتم تنفيذ جميع التجارب في غضون أسبوعين من ذوبان الجليد للحد من أي اختلاف بسبب عدد مرور. يتم تنفيذ تجاربنا مع HMVEC والرئة بين الممرات 4-9.
  2. يوم 1: عندما تصل خلايا 80-90٪ confluency، يعرض للتريبسين و resuspend في 120،000 الخلايا لكل مل. لوحة 36،000 الخلايا (0.3 مل) لكل بئر في 48 جيدا، البوليسترين نسيج لوحة الثقافة (ق). وتشمل الآبار من HMVEC أنه لن يتم تحضين مع العدلات من أجل الحصول على قراءة مضان الخلفية. إلا باستخدام لوحات 48 بئر صممت خصيصا لفحوصات مضان، الصفوف أو الأعمدة بالتناوب سوف لحد من أي تلوث ضوء من الآبار المجاورة. ملاحظة: يمكن أن يكون ويلز قبل المغلفة مع البولي lysiNE، أو الكولاجين فبرونيكتين.
  3. يوم 2: إضافة وسائل الإعلام الجديدة.
  4. يوم 3: بحلول مرحلة المجهر النقيض من ذلك، تأكيد الخلايا سليمة (أي "حصوه" مظهر والحطام الخلية قليلا)، وأنها هي متكدسة 100٪ (الشكل 1). إذا كانت الخلايا لم تكن 100٪ متموجة، تغيير وسائل الإعلام كل يوم حتى تصبح جاهزة.
  5. مرة واحدة في الطبقات الوحيدة HMVEC مستعدون لتلقي العلاج، وغسل خلايا مرة واحدة مع محلول ملحي متوازن هانك (HBSS) وإضافة 0.3 مل من الطازجة وسائل الإعلام MV EGM-2 أو وسائل الإعلام التي تحتوي على ناهض التهابات إلى الآبار المناسب. في هذا البروتوكول تم علاج HMVEC والرئة مع TNFα [100 نانوغرام / مل] (PeproTech، نيو جيرسي) لمدة 3 ساعة منذ هذا هو المنشط وصفها جيدا من ECS 21. ملاحظة: من المستحسن أن لك الوقت تجربتك بحيث الخلايا HMVEC المنشط الخاص بك (الخطوة 4.1) وcalcein AM العدلات المسمى (الخطوة 3.5) جاهزة للاستخدام في نفس الوقت. كان يأخذنا ما يقرب من 2.5 ساعة إلى عزل وتسمية neutrophILS.

2. عزل العدلة باستخدام Polymorphprep

  1. عزل العدلات كما هو موضح سابقا 22، أو مع كثافة حل التدرج الجاهزة لعزل المحببة النوى من الدم الكامل. توظيف Polymorphprep بعد بروتوكول من قبل Nuzzi، وآخرون 2007 النتائج في غلة حوالي 2-3 × 10 6 العدلات لكل مل من الدم الكامل 23. ملاحظة: لتجنب الإفراط في تحلل كرات الدم الحمراء، والترسيب ديكستران لإزالة خلايا الدم الحمراء يمكن أداؤها قبل التدرج الكثافة الطرد المركزي 24.
  2. جلب كثافة حل التدرج Polymorphprep إلى RT.
  3. جمع 30 مل من الدم الكامل من متطوعين من البشر صحي في وجود مضاد للتخثر مثل هيبارين، سيترات أو EDTA. يجب أن يتم استخدام الدم في غضون 2 ساعة، وأبقى بين 18-22 درجة مئوية.
  4. طبقة 5 مل من الدم الكامل أكثر من 5 مل من محلول التدرج الكثافة في أنبوب 15 مل المخروطية ( الشكل 2A). تجنب تغيير حجم الدم والحل التدرج الكثافة لأن ذلك قد تتغير الظروف الطرد المركزي لاحقة.
  5. الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 30 دقيقة في 18-22 درجة مئوية. تأكد لتسريع ببطء صعودا وهبوطا في أجهزة الطرد المركزي (أي إيقاف الفرامل أجهزة الطرد المركزي)، وتحقيق التوازن بين أنابيب جيدا لمنع الاهتزازات للمساعدة في خفض تفعيل العدلات ومنع اختلاط طبقات. سوف مرات الطرد المركزي لفترة أطول أو قوة الطرد المركزي العالي يؤدي إلى طبقة الكريات البيض أقل من ذلك، والذي يحتوي على العدلات، إلى الهجرة إلى مزيد من الانخفاض نحو لخلايا الدم الحمراء مكعبات.
  6. نضح في البلازما والكريات البيض الفرقة العلوية التي تحتوي على PBMCs لمنع التلوث من الطبقة التي تحتوي العدلات (الشكل 2B).
  7. استخدام الماصة المصلية 1-2 مل لإزالة الطبقة السفلى تحتوي على الكريات البيض العدلات. الجمع بين طبقات العدلة في 30 مل من برنامج تلفزيوني (من دون كا 2 + والمغنيسيوم 2 +) في 50 ملأنبوب مخروطي الشكل.
  8. تبرزي حجم ما يصل الى 50 مل مع برنامج تلفزيوني (بدون كا 2 + والمغنيسيوم 2 +) وأجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في 18-22 درجة مئوية.

ملاحظة: الخطوات 2.9 و 2.10 اختيارية ولكن يوصى بشدة.

  1. نضح طاف. Resuspend والعدلات في 8 مل من الماء المعقم لمدة 30 ثانية إلى ليز خلايا الدم الحمراء، إضافة تعليق الخلية على الفور إلى 2 مل من برنامج تلفزيوني 5X (دون كا 2 + والمغنيسيوم 2 +) وتخلط بلطف باليد. لا احتضان الخلايا في المياه لمدة أطول من 30 ثانية منذ يمكن أن يحدث الموت كبيرة العدلة.
  2. الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق عند 18-22 درجة مئوية.
  3. غسل خلايا مرة واحدة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني (بدون كا 2 + والمغنيسيوم 2 +) وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 250 x ج لمدة 5 دقائق عند 18-22 درجة مئوية.
  4. Resuspend والعدلات في 10 مل من RPMI-1640 (بدون أحمر الفينول) وعدد الخلايا الحية باستخدام التريبان بلوه صبغ طريقة الاستبعاد. تجنب فترات طويلة من كثافة الخلية أكبر من 5 × 10 6 لكل مل لأن هذا قد يؤدي إلى تفعيل العدلات.

3. العدلة وصفها مع Calcein AM

  1. وتستخدم 6 × 10 5 العدلات لكل بئر من لوحة 48 أيضا.
  2. بعد العد، ونقل الخلايا معلق إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل ويخفف من العدلات إلى 2-4 × 10 6 خلية لكل مل مع الفينول الحمراء الخالية RPMI-1640.
  3. إضافة calcein AM محلول المخزون إلى 3 ميكرومتر (أي 2.98 ميكرولتر من calcein AM الأوراق المالية (1 ملغ / مل) لكل مل من وسائل الإعلام)، ومزيج جيد من قبل بلطف عبها الأنبوب. أكبر من 5 ميكرومتر AM calcein سوف يؤدي إلى التسرب من العدلات ملاحظة: هو المشقوق غير الفلورسنت calcein AM داخل الخلايا عن طريق الاسترات الذاتية لإنتاج جزيء calcein نيون للغاية (وأي خلايا ميتة لا يتألق).
  4. تغطية الأنبوب بورق الألمنيوم واحتضان جمعةأو 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام ملاحظة: قد يؤدي مرات حضانة أطول في أكثر calcein كونها تحررت من العدلات على مدى مقايسة التصاق.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 5 دقائق عند 18-22 درجة مئوية، وغسل العدلات 2X مع 10 مل من RPMI-1640 (بدون الفينول الأحمر؛ قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية). بعد إعادة التعليق على خلايا لغسل الثاني، يمر أولا العدلات على الرغم من تصفية العقيمة 40 ميكرومتر لإزالة كتل ثم الطرد المركزي مرة أخرى في 450 x ج لمدة 5 دقائق عند 18-22 درجة مئوية.
  6. Resuspend والعدلات في المتوسط ​​1640 (بدون الفينول الأحمر؛ قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية) في 2 × 10 6 العدلات لكل مل.

4. مقايسة الربط العدلة

  1. غسل الطبقات الوحيدة HMVEC 3x مع 0.5 مل من فلتر تعقيم (0.22 ميكرون) المتوسط ​​1640 (بدون أحمر الفينول) التي تحتوي على 3٪ BSA لكل بئر.
  2. نضح في وسائل الاعلام وإضافة 6 × 10 5 العدلات calcein المسمى (0.3 مل من خلية suspensioن)، أو 0.3 مل من المتوسط ​​1640 (بدون أحمر الفينول) دون العدلات، إلى الآبار المناسب من 48 لوحة جيدا ملاحظة: هذا هو ما يعادل 8 × 10 5 العدلات لكل سم 2.
  3. احتضان لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 الحاضنة.
  4. مجموع العدلات الإسفار (PRE غسل): قياس كثافة مضان من كل بئر مع الطول الموجي من 485 نانومتر الإثارة والطول الموجي الانبعاثات من 520 نانومتر (فلوريسئين مجموعة فلتر) في FLUOstar، أو ما يعادلها، مقياس الطيف الضوئي. تنفيذ هذه الخطوة قبل فقط إلى نقطة نهاية الحضانة ملاحظة: في هذا البروتوكول، وأجريت calcein الإثارة والكشف عن الضوء المنبعث من الجزء العلوي من الآبار المكشوفة، ولكن على حد سواء ويمكن أيضا أن يؤديها من الجزء السفلي من الآبار.
  5. غسل الآبار التي تحتوي على الطبقات الوحيدة HMVEC والعدلات 5X مع 0.5 مل لكل بئر من برنامج تلفزيوني (ث / كا 2 + والمغنيسيوم 2 +). إزالة وسائل الإعلام ويغسلبواسطة قلب اللوحة، والربت برفق على مناشف ورقية لإزالة السائل المتبقي.
  6. أضف إلى الوراء 0.3 مل من المتوسط ​​1640 (بدون أحمر الفينول) لكل بئر.
  7. تمسكا العدلات الإسفار (POST غسل): قياس كثافة مضان من كل بئر كما في الخطوة 4.4.
  8. تحديد الالتزام والتقيد في المئة النسبية لكل بئر:

ملاحظة: في هذه المرحلة، والصور من العدلات calcein المسمى يمكن الحصول عليها باستخدام المجهر مضان قادرة مزودة بمرشحات فلوريسئين القياسية. تم الحصول على الصور في الشكل 4 على أوليمبوس IX51 مجهر مقلوب مجهزة 2000R كاميرا Retiga (Q التصوير) باستخدام Q-التقاط Pro7 البرمجيات (Q التصوير).

النتائج

من أجل الحصول على موثوقة، والنتائج استنساخه باستخدام مقايسة ملزمة العدلة، فمن الضروري أن صحة وconfluency من الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة هي الأمثل في يوم الفحص، كما هو موضح مع HMVEC والرئة في الشكل 1. وبالإضافة إلى ذلك، لا بد من أن انخفاض مرور عدد الاوع?...

Discussion

أهم الخطوات الحاسمة لنجاح العدلة / الاوعية الدموية الدقيقة البطانية خلية مقايسة التصاق هي: 1) استخدام منخفض عدد مرور (<9)، والخلايا البطانية صحية؛ 2) الحفاظ على العدلات معزولة في مناطق ذات كثافة منخفضة (أي <5 × 10 6 خلايا / مل)، واستخدامها في غضون ساعتين من الع?...

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل وزارة UCSF الرعاية تخدير والمحيطة بالجراحة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
HMVEC-LungLonzaCC-2527
EGM-2 MVLonzaCC-3202
HBSSLife Technologies14175-095Can be substituted with any vendor
48-well Tissue Culture PlatesBD Falcon353078
PBS (without phenol red)UCSF Cell Culture FacilityCCFAL001Can be substituted with any vendor
D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red)UCSF Cell Culture FacilityCCFAL003Can be substituted with any vendor
RPMI-1640 (without phenol red)Life Technologies11835-030
PolymorphprepAxis-Shield1114683
calcein AMLife TechnologiesC3099(0.995 mM) stock soln
Trypan Blue SolutionSigma-AldrichT8154
40 μM filtersVWR21008-949Can be substituted with any vendor
FLUOstar OPTIMA SpectrophotometerBMG LABTECH-

References

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
  2. Collins, T., et al. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-kappa B and cytokine-inducible enhancers. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 9, 899-909 (1995).
  3. Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
  4. Chen, G. Y., Nunez, G. Sterile inflammation: sensing and reacting to damage. Nat. Rev. Immunol. 10, 826-837 (2010).
  5. Middleton, J., et al. Transcytosis and surface presentation of IL-8 by venular endothelial cells. Cell. 91, 385-395 (1997).
  6. Rot, A. Endothelial cell binding of NAP-1/IL-8: role in neutrophil emigration. Immunol. Today. 13, 291-294 (1992).
  7. Detmers, P. A., et al. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the binding activity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. J. Exp. Med. 171, 1155-1162 (1990).
  8. Laudanna, C., Kim, J. Y., Constantin, G., Butcher, E. Rapid leukocyte integrin activation by chemokines. Immunol. Rev. 186, 37-46 (2002).
  9. Simon, S. I., Hu, Y., Vestweber, D., Smith, C. W. Neutrophil tethering on E-selectin activates beta 2 integrin binding to ICAM-1 through a mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J. Immunol. 164, 4348-4358 (2000).
  10. Zarbock, A., Ley, K. Mechanisms and consequences of neutrophil interaction with the endothelium. The American Journal of Pathology. 172, 1-7 (2008).
  11. Muller, W. A. Mechanisms of leukocyte transendothelial migration. Annu. Rev. Pathol. 6, 323-344 (2011).
  12. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  13. Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. International Immunopharmacology. 10, 1325-1334 (2010).
  14. McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
  15. Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
  16. Soehnlein, O., Lindbom, L., Weber, C. Mechanisms underlying neutrophil-mediated monocyte recruitment. Blood. 114, 4613-4623 (2009).
  17. Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Prakash, A., Xu, F., Hellman, J. Activation of endothelial TLR2 by bacterial lipoprotein upregulates proteins specific for the neutrophil response. Innate Immun. 18, 602-616 (2012).
  18. Haugland, R. P., Johnson, I. D., Basey, A. . The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labelling Technologies. , (2005).
  19. Shin, H. S., et al. Bacterial lipoprotein TLR2 agonists broadly modulate endothelial function and coagulation pathways in vitro and in vivo. J. Immunol. 186, 1119-1130 (2011).
  20. Wilhelmsen, K., Mesa, K. R., Lucero, J., Xu, F., Hellman, J. ERK5 protein promotes, whereas MEK1 protein differentially regulates, the Toll-like receptor 2 protein-dependent activation of human endothelial cells and monocytes. J. Biol. Chem. 287, 26478-26494 (2012).
  21. Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat. Rev. Immunol. 7, 803-815 (2007).
  22. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp. (17), e745 (2008).
  23. Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol. Biol. 370, 23-36 (2007).
  24. Garcia-Garcia, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J. Vis. Exp. (74), e50410 (2013).
  25. Kuma, Y., et al. BIRB796 inhibits all p38 MAPK isoforms in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 280, 19472-19479 (2005).
  26. Westra, J., Kuldo, J. M., van Rijswijk, M. H., Molema, G., Limburg, P. C. Chemokine production and E-selectin expression in activated endothelial cells are inhibited by p38 MAPK (mitogen activated protein kinase) inhibitor RWJ 67657. International Immunopharmacology. 5, 1259-1269 (2005).
  27. Leeuwenberg, J. F., Jeunhomme, G. M., Buurman, W. A. Adhesion of polymorphonuclear cells to human endothelial cells. Adhesion-molecule-dependent, and Fc receptor-mediated adhesion-molecule-independent mechanisms. Clinical and Experimental Immunology. 81, 496-500 (1990).
  28. Akeson, A. L., Woods, C. W. A fluorometric assay for the quantitation of cell adherence to endothelial cells. Journal of Immunological Methods. 163, 181-185 (1993).
  29. Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion. Journal of Immunological Methods. 159, 93-100 (1993).
  30. De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Mertens, A. M., Moens, M. M., Stevens, W. J. Use of fluorescent dyes in the determination of adherence of human leucocytes to endothelial cells and the effect of fluorochromes on cellular function. Journal of Immunological Methods. 172, 115-124 (1994).
  31. Bevilacqua, M. P., Pober, J. S., Wheeler, M. E., Cotran, R. S., Gimbrone, M. A. Interleukin 1 acts on cultured human vascular endothelium to increase the adhesion of polymorphonuclear leukocytes, monocytes, and related leukocyte cell lines. The Journal of Clinical Investigation. 76, (1985).
  32. Schleimer, R. P., Rutledge, B. K. Cultured human vascular endothelial cells acquire adhesiveness for neutrophils after stimulation with interleukin 1, endotoxin, and tumor-promoting phorbol diesters. J. Immunol. 136, 649-654 (1986).
  33. Gamble, J. R., Harlan, J. M., Klebanoff, S. J., Vadas, M. A. Stimulation of the adherence of neutrophils to umbilical vein endothelium by human recombinant tumor necrosis factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82, 8667-8671 (1985).
  34. Braut-Boucher, F., et al. A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes. Journal of Immunological Methods. 178, 41-51 (1995).
  35. Ait-Oufella, H., Maury, E., Lehoux, S., Guidet, B., Offenstadt, G. The endothelium: physiological functions and role in microcirculatory failure during severe sepsis. Intensive Care Medicine. 36, 1286-1298 (2010).
  36. Andonegui, G., et al. Endothelium-derived Toll-like receptor-4 is the key molecule in LPS-induced neutrophil sequestration into lungs. The Journal of Clinical Investigation. 111, 1011-1020 (2003).
  37. Sharma, J., et al. Lung endothelial cell platelet-activating factor production and inflammatory cell adherence are increased in response to cigarette smoke component exposure. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302, L47-L55 (2012).
  38. Deban, L., Correale, C., Vetrano, S., Malesci, A., Danese, S. Multiple pathogenic roles of microvasculature in inflammatory bowel disease: a Jack of all trades. The American Journal of Pathology. 172, 1457-1466 (2008).
  39. Gross, W. L., Trabandt, A., Csernok, E. Pathogenesis of Wegener's granulomatosis. Annales de Medecine Interne. 149, 280-286 (1998).
  40. Chen, Y., et al. Evidence of inflammatory cell involvement in brain arteriovenous malformations. Neurosurgery. 62, 1340-1349 (2008).
  41. Martens, C. L., et al. Peptides which bind to E-selectin and block neutrophil adhesion. J. Biol. Chem. 270, 21129-21136 (1995).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

78

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved