כמותי<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay כדי למדוד הידבקות נויטרופילים לתאים מופעלים עיקריים אדם אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים

Summary

דבקות נויטרופילים לאנדותל מופעל באתרים של זיהום היא מרכיב בלתי נפרד של התגובה הדלקתית של המארח. שתואר בדוח זה הוא assay מחייב נויטרופילים המאפשרים במבחנה Quantitation של נויטרופילים אנושיים ראשוניים מחייב לתאי האנדותל מופעלים על ידי מתווכים דלקתיים בתנאים סטטיים.

Abstract

האנדותל של כלי הדם ממלא חלק בלתי נפרד בתגובה הדלקתית. בשלב החריף של דלקת, תאי האנדותל (ECs) מופעלים על ידי מתווכים מארחים או ישירות על ידי רכיבים נשמרים חיידקים או מולקולות סכנת מארח הנגזרות. ציטוקינים הופעלו ECS Express, כמוקינים ומולקולות הדבקה שיתגייסו, להפעיל ולשמור על כדוריות דם לבנות באתר של זיהום או פציעה. הנויטרופילים הם לויקוציטים הראשון שהגיע, ולדבוק האנדותל באמצעות מגוון רחב של מולקולות הדבקה בהווה על פני השטח של שני התאים. תפקידיה העיקריים של נויטרופילים הם לחסל את החיידקים ישירות איומים, לקדם הגיוס של לויקוציטים אחר דרך שחרורו של גורמים נוספים, וליזום תיקון פצע. לכן, גיוסם וההתקשרות לאנדותל הוא שלב קריטי בייזום של התגובה הדלקתית. בדו"ח זה, אנו מתארים בassay הידבקות נויטרופילים מבחנה באמצעותcalcein AM-שכותרתו נויטרופילים אנושיים עיקריים לכמת את מידת הפעלת תא אנדותל כלי הדם בתנאים סטטיים. לשיטה זו יתרון הנוסף שאותם הדגימות נבדקות ועל ידי ספקטרופוטומטריה הקרינה יכולות גם להיות דמיינו ישירות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי להערכה איכותית יותר של כריכת נויטרופילים.

Introduction

מאז האנדותל של כלי הדם הוא במגע ישיר עם הדם במחזור, הוא ממוקם באופן ייחודי כדי ליזום תגובה דלקתית מהירה במהלך זיהום או פציעה. תאי האנדותל (ECs) הקולטנים דפוס הכרה מפורש שמזהים מגוון רחב של רכיבים נשמרים חיידקים ומולקולות סכנה, וקולטנים למארחות מתווכים דלקתיים כגון TNFα. הפעלה של קולטנים אלה גורמת להפריש ציטוקינים ECs (למשל IL-6, IL-8, CXCL1 וCCL2), וכדי upregulate מולקולות דבק (למשל E / P-selectin, VCAM-1 וICAM-1) בתא השטח שלהם ^{1 , 2.} מולקולות אלה כל להקל על הלוקליזציה של לויקוציטים לאתרים של זיהום ופגיעה במטרה לנקות את המארח של חומרים מזהמים וליזום תיקון רקמות ^3,4. תגובת נויטרופילים לזיהום כרוכה ביחסי גומלין מתואם היטב בין האנדותל של כלי הדם ולהגיב נויטרופילים. עם הפעלת EC, IL-8 מופרש ויוצרים שיפוע intravascular על האנדותל המאפשר לבית נויטרופילים לאתר של זיהום או פגיעה ^5,6. לכידת נויטרופילים E / P-selectins לתווך ומתגלגל באמצעות עמותות חלשות יחסית עם glycomolecules על פני תא נויטרופילים. אינטראקציות אלה, יחד עם IL-8 נקשרים לרצפטורים מאותו המקור שלו, להקל על התקשרות האיתנה, integrin בתיווך וסופו של דבר מעצרו של נויטרופילים על פני התא האנדותל ^7-10. לאחר מעצרו, נויטרופילים יכולים לנדוד אל מחוץ לכלי דם לאתרים הספציפיים של זיהום לחסל פתוגנים ישירות, ליצור מלכודות תאי נויטרופילים כדי למנוע ההתפשטות של פתוגנים, לקדם ריפוי פצע ולשחרר גורמים נוספים שמגייסים לויקוציטים אחר כגון מונוציטים, מקרופאגים ודנדריטים תאי ^11-17.

שתוארה בדוח זה הוא שיטה במבחנה לכמת דבקות נויטרופילים לmicrovascular ECS לאחר הפעלה על ידי מארח המתווך הדלקתי TNFα. assay זה נועד להעריך את ההפעלה של ECS, ולא נויטרופילים. נויטרופילים אנושיים עיקריים הם ראשון מבודדים באמצעות הפרדת שיפוע צפיפות, ולאחר מכן, שכותרתו עם calcein acetoxymethyl (PM). Esterases בתוך התאים החי Hydrolyze calcein בבוקר ועד מולקולת calcein ניאון מאוד עם עירור של 492-495 ננומטר ופליטות של 513-516 ננומטר ^18. את הנויטרופילים fluorescently שהכותרת מודגרת מכן עם monolayers EC, ונויטרופילים שאינם חסיד הם הוסרו לאחר מכן. הקרינה של נויטרופילים הנותרים, כבול לאחר מכן נמדד בעזרת ספקטרופוטומטר הקרינה, ומחושבת כאחוז מקלט הקרינה נויטרופילים המוחלט בכל טוב. לשיטה זו יתרון הנוסף שנויטרופילים הכפותים calcein שכותרתו משמשים בספקטרופוטומטריה ניתן ישירות דמיינו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לתת איכותי יותר לקרוא מתוך EC ACtivation. מאז assay זה מתבצע בתנאים סטטיים, רק את האירועים מאוד ראשוניים המתרחשים במפל הידבקות נויטרופילים ייבחנו. זה אושר בדוח זה באמצעות נוגדנים החוסמים דואר selectin להראות כי דבקות נויטרופילים לריאות אנושית TNFα שטופל כלי הדם EC (HMVEC-ריאות) monolayers מצטמצמת באופן דרסטי כשמופרת האינטראקציה עם E-selectin.

בנוסף לTNFα, השתמשו בהצלחה assay זה כדי לקבוע את מידת הפעלת EC וריד טבור האנושית (HUVEC) על ידי הקולטן חיוג כמו אגוניסטים 1/2 ליפופרוטאין peptidoglycan קשורה (PAL), ליפופרוטאין murein (MLP) וPam3Cys ו הפעלת HMVEC-ריאות על ידי Pam3Cys ^19,20. בנוסף, השתמשנו בהצלחה assay זה במעכבי קינאז, ולאחר מציאה RNAi בתיווך של פני השטח וחלבוני cytoplasmic בHMVEC-ריאות, מה שמרמז כי מתודולוגיה זו תואמת עם מגוון רחב של יוכימי וscreening מבחני ^20. לסיכום, assay זה מספק דרך קלה לשימוש לשחזור, יותר פונקציונלית, כדי לגשת למידה של הפעלת EC ידי מתווכים דלקתיים במבחנה.

Protocol

1. ציפוי ותחזוקה של תאי אנדותל כלי הדם

1. הפשירי ולגדל תאי אנדותל כלי הדם שלך בהתאם להוראות היצרנים סיפקה. בפרוטוקול זה, תאים גדלו בתקשורת MV EGM-2 (Lonza), ומומלץ כי כל הניסויים מבוצעים תוך שבועיים מהפשרה כדי למזער את כל וריאציה בשל מספר מעבר. הניסויים שלנו עם HMVEC-ריאה מבוצעים בין קטעים 4 עד 9.
2. יום 1: כאשר תאים מגיעים 80-90% confluency, trypsinize וresuspend ב120,000 תאים למ"ל. צלחת 36,000 תאים (0.3 מ"ל) לכל טוב ל48 היטב, צלחת קלקר תרבית רקמה (ים). כולל בארות של HMVEC שלא יהיה מודגרות עם נויטרופילים על מנת לקבל קריאת הקרינה רקע. אלא אם כן משתמש בצלחות של 48 מתוכננות היטב במיוחד עבור מבחני הקרינה, שורות לסירוגין או עמודות תהיה למזער את זיהום אור מבארות שכנות. הערה: ולס יכול להיות מצופה מראש עם פולי-lysiנה, קולגן או פיברונקטין.
3. יום 2: הוסף מדיה טריות.
4. יום 3: על ידי מיקרוסקופ לעומת השלב, לאשר את התאים בריאים (כלומר הופעה "מרוצפת" ופסולת תא קטנה), והם מחוברות 100% (איור 1). אם התאים אינם 100% ומחוברות, לשנות את התקשורת בכל יום עד שהם מוכנים.
5. ברגע שmonolayers HMVEC מוכנה לטיפול, לשטוף את תאי פעם עם תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) ולהוסיף 0.3 מ"ל של תקשורת טרי EGM-2 MV או מדיה המכיל אגוניסט הדלקתי לבארות המתאימות. בפרוטוקול זה טופלו HMVEC-הריאות עם TNFα [100 ng / ml] (PeproTech, ניו ג'רזי) עבור 3 שעות שכן מדובר במפעיל תאר היטב של ECs ^21. הערה: מומלץ שזמן הניסוי שלך, כך שהתאים שלך הופעל HMVEC (שלב 4.1) וCalcein AM נויטרופילים שכותרתו (שלב 3.5) יהיו מוכנים להשתמש בו בזמן. לוקח לנו כ 2.5 שעות לבודד ולתייג neutrophש"ח.

2. בידוד נויטרופילים באמצעות Polymorphprep

1. לבודד נויטרופילים כפי שתואר קודם לכן ^22, או עם פתרון צפיפות שיפוע מוכן לבודד גרנולוציטים polymorphonuclear מכל דם. העסקת Polymorphprep בעקבות הפרוטוקול על ידי Nuzzi, et al. 2007 תוצאות בתשואות של כ 2-3 x 10 ⁶ נויטרופילים לכל מ"ל של דם מלא ^23. הערה: כדי למנוע תמוגה הכדורית האדומה מוגזמת, שקיעת dextran להסיר תאי דם אדומים עשויה להתבצע לפני צנטריפוגה שיפוע צפיפות ^24.
2. להביא את פתרון שיפוע צפיפות Polymorphprep RT.
3. אסוף 30 מ"ל של דם מלא מהתנדבות של אדם בריא בנוכחות נוגדת קרישה כגון הפרין, ציטרט או EDTA. הדם יש להשתמש תוך שעה 2, והמשיך בין 18-22 ° C.
4. שכבה 5 מ"ל של דם מלא מעל 5 מ"ל של פתרון שיפוע הצפיפות בצינור חרוטי 15 מ"ל ( איור 2 א). הימנע משינוי כרכים של דם ופתרון שיפוע הצפיפות כמו זו עלולה לשנות את תנאי צנטריפוגה שלאחר מכן.
5. צנטריפוגה ב XG 450 עבור 30 דקות ב 18-22 ° C. ודא כדי להאיץ לאט למעלה ולמטה צנטריפוגות (כלומר לכבות את בלם צנטריפוגה), ולאזן את הצינורות היטב כדי למנוע תנודות כדי לעזור להפחית את ההפעלה של נויטרופילים ולמנוע הערבוב של שכבות. פעמים צנטריפוגה ארוכות יותר או כוח הצנטריפוגלי גבוה יותר יגרמו לשכבת יקוציט התחתונה, המכילה נויטרופילים, כדי להעביר עוד יותר מטה לכיוון לתאי הדם האדום pelleted.
6. לשאוב את הפלזמה ולהקת יקוציט עליונה המכילה PBMCs כדי למנוע הזיהום של השכבה המכילה נויטרופילים (איור 2).
7. השתמש pipet סרולוגיות מיליליטר 1-2 כדי להסיר את השכבה התחתונה המכילה יקוציט נויטרופילים. לשלב את שכבות נויטרופילים לתוך 30 מ"ל של PBS (ללא Ca ^{2 +} ו ^{2 +} Mg) ב50 מ"לצינור חרוטי.
8. תביא את הנפח של עד 50 מ"ל עם PBS (ללא Ca ^{2 +} ו ^{2 +} Mg) ו צנטריפוגות ב XG 450 עבור 10 דקות ב 18-22 ° C.

הערה: צעדים 2.9 ו 2.10 הם אופציונלי, אך מומלץ ביותר.

9. לשאוב supernatant. Resuspend את הנויטרופילים ב8 מ"ל של מים סטריליים למשך 30 שניות לlyse תאי דם אדומים, מוסיף את ההשעיה התא באופן מיידי ל2 מ"ל של PBS 5x (ללא Ca ^{2 +} ו Mg ^{2 +)} ולערבב בעדינות ביד. אל דגירה תאים ב מים למשך זמן ארוך יותר מ -30 שניות מאז מות נויטרופילים משמעותיים יכול להתרחש.
10. צנטריפוגה ב XG 250 במשך 5 דקות ב18-22 ° C.
11. לשטוף את תאי פעם אחת עם 10 מ"ל של PBS (ללא Ca ^{2 +} ו Mg ^{2 +)} ו צנטריפוגות שוב ב 250 XG במשך 5 דקות ב18-22 ° C.
12. Resuspend את הנויטרופילים ב 10 מ"ל של RPMI-1640 (ללא פנול האדום) ולספור את תאי החיים באמצעות Blu trypanשיטת הדרה לצבוע דואר. הימנע מתקופות ממושכות של תאי צפיפות גדולה מ 5 x 10 ⁶ למ"ל שכן דבר עלול לגרום להפעלה של נויטרופילים.

3. נויטרופילים תיוג עם Calcein בוקר

1. 6 10 ⁵ נויטרופילים x משמשים לכל גם צלחת 48 היטב.
2. לאחר הספירה, להעביר את תאי resuspended לצינור חרוטי 50 מ"ל ולדלל את הנויטרופילים ל2-4 x 10 ⁶ תאים לכל מ"ל עם פנול RPMI-1640 ללא אדום.
3. הוסף calcein AM פתרון מניות עד 3 מיקרומטר (כלומר μl 2.98 בבוקר של calcein מניית (1 מ"ג / מ"ל) לכל מ"ל של תקשורת) ומערבבים היטב בעדינות על ידי מצליף את הצינורית. גדול מ 5 מיקרומטר AM calcein יגרום לדליפה מנויטרופילים. הערה: לא פלורסנט calcein בבוקר הוא ביקע בתוך התאים על ידי esterases אנדוגניים לייצר מולקולת calcein הניאון ביותר (תאים מתים כלומר לא לזרוח).
4. לכסות את הצינור עם רדיד אלומיניום ודגירת Fאו 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בהערה הכהה:. פעמים דגירה ארוכות יותר עלולות לגרום ליותר calcein להיות משוחרר מנויטרופילים במהלך assay ההידבקות.
5. צנטריפוגה ב XG 450 במשך 5 דקות ב18-22 מעלות צלזיוס, ולשטוף את הנויטרופילים 2x עם 10 מ"ל של RPMI-1640 (ללא פנול אדום; מחוממת מראש ל -37 מעלות צלזיוס). לאחר resuspending התאים ללשטוף את השני, ראשון לעבור את הנויטרופילים למרות סינון סטרילי 40 מיקרומטר כדי להסיר גושים ולאחר מכן פעם נוספת בצנטריפוגות XG 450 במשך 5 דקות ב18-22 ° C.
6. Resuspend את הנויטרופילים בRPMI 1640 (ללא פנול אדום; מראש חימם עד 37 מעלות צלזיוס) בשעה 2 x 10 ⁶ נויטרופילים למ"ל.

4. Assay מחייב נויטרופילים

1. שטוף את monolayers HMVEC 3x עם 0.5 מ"ל של המסנן מעוקר RPMI (0.22 מיקרומטר) 1640 (ללא פנול אדום) המכיל 3% BSA בכל טוב.
2. לשאוב את התקשורת ולהוסיף 6 x 10 ⁵ נויטרופילים calcein שכותרתו (0.3 מ"ל של התא suspension מ"ל), או 0.3 של RPMI 1640 (ללא פנול האדום) ללא נויטרופילים, לבארות המתאימות צלחת הערה 48 היטב:. זו מקבילה של 8 10 ⁵ נויטרופילים x לסנטימטר ^2.
3. דגירה במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באינקובטור.
4. סה"כ נויטרופילים הקרינה (PRE לשטוף): מדוד את עוצמת הקרינה של כל אחד גם עם גל עירור של 485 ננומטר ואורך גל פליטה של 520 ננומטר (מערכת סינון והעמסת) בFLUOstar, או שווה ערך, ספקטרופוטומטר. לבצע שלב זה רק לקראת נקודת סיום הדגירה הערה: בפרוטוקול זה, עירור והגילוי של האור הנפלט calcein בוצעו מהחלק העליון של הבארות שנחשפו, עם זאת, הן יכולות גם להתבצע מהחלק התחתון של הבארות..
5. שטוף את הבארות המכילות monolayers HMVEC ונויטרופילים 5x עם 0.5 מ"ל לכל טוב של PBS (w / Ca ^{2 +} ו Mg ^{2 +).} הסר את המדיה ושטיפותעל ידי היפוך לצלחת, וטופח בעדינות על מגבות נייר כדי להסיר את הנוזל שנותר.
6. הוסף חזרה 0.3 מ"ל של RPMI 1640 (ללא פנול אדום) בכל טוב.
7. חסיד נויטרופילים הקרינה (POST לשטוף): מדוד את עוצמת הקרינה של כל אחד וגם בשלב 4.4.
8. לקבוע את הדבקות והעמידה אחוזים ביחס לכל גם:

הערה: בשלב זה, ניתן לקבל תמונות של נויטרופילים calcein שכותרתו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד ביכולת העמסת מסננים סטנדרטיים. את התמונות באיור 4 התקבלו במיקרוסקופ אולימפוס IX51 הפוך מצוידים Retiga 2000R מצלמה (ש הדמיה) באמצעות Q-Capture Pro7 תוכנה (Q הדמיה).

תוצאות

על מנת לקבל תוצאות אמינות, לשחזור באמצעות assay מחייב נויטרופילים, זה חיוני כי הבריאות וconfluency של תאי אנדותל כלי הדם הם אופטימלית ביום של assay, כפי שמודגם בHMVEC-ריאות באיור 1. בנוסף, זוהי חובתו של כלי הדם מספר המעבר הנמוך ECs משמש (כלומר פחות מ 9 קטעים), ובהתאם לכך, ?...

Discussion

השלבים הקריטיים ביותר לנויטרופילים מוצלחים / assay הידבקות תא אנדותל כלי הדם הם: 1) שימוש במספר נמוך מעבר (<9), תאי האנדותל בריאים: 2) שמירה על נויטרופילים הבודדים בצפיפות נמוכה (כלומר <5 x 10 ⁶ תאים כביסה ו3) השקדנית של נויטרופילים AM-שכותרתו Calcein ולהשתמש של נויטרו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HMVEC-Lung	Lonza	CC-2527
EGM-2 MV	Lonza	CC-3202
HBSS	Life Technologies	14175-095	Can be substituted with any vendor
48-well Tissue Culture Plates	BD Falcon	353078
PBS (without phenol red)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL001	Can be substituted with any vendor
D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL003	Can be substituted with any vendor
RPMI-1640 (without phenol red)	Life Technologies	11835-030
Polymorphprep	Axis-Shield	1114683
calcein AM	Life Technologies	C3099	(0.995 mM) stock soln
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154
40 μM filters	VWR	21008-949	Can be substituted with any vendor
FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer	BMG LABTECH	-