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요약

감염의 사이트에서 활성화 된 내피 세포에 백혈구 준수는 호스트의 염증 반응의 중요한 구성 요소입니다. 수 있습니다 호중구 결합 분석은이 보고서에 설명 체외에서 정량.

초록

혈관 내피 세포는 염증 반응에 중요한 역할을한다. 염증의 급성 단계 동안, 내피 세포 (내피)는 호스트 매개로 직접 보존 미생물 구성 요소 또는 호스트 파생 위험 분자에 의해 활성화됩니다. 활성화 된 내피 표현 사이토 카인, 케모카인 동원과 접착 분자는, 감염이나 부상의 사이트에서 백혈구를 활성화하고 유지합니다. 호중구 도착하는 최초의 백혈구이며, 두 세포의 표면에 존재하는 접착 분자의 다양한 통해 내피을 준수합니다. 호중구의 주요 기능은 직접 미생물의 위협을 제거하는 추가 요인의 출시를 통해 다른 백혈구의 채용을 촉진하고, 상처 복구를 시작하는 것입니다. 따라서 내피 세포에 자신의 모집 및 첨부 염증 반응의 개시에 중요한 단계입니다. 이 보고서에서, 우리는 사용하는 체외 호중구 접착 분석에 대해 설명합니다calcein 정적 조건에서 미세 혈관 내피 세포의 활성화 정도를 정량하는 인간의 기본 호중구 AM-레이블. 이 방법은 형광 분광 광도계로 정량 동일한 샘플을 직접 호중구 바인딩보다 질적 평가를 위해 형광 현미경을 사용하여 시각화 할 수있는 추가적인 장점이 있습니다.

서문

혈관 내피 세포는 혈액 순환과 직접 접촉에 있기 때문에, 그것은 유일하게 감염이나 부상시 신속한 염증 반응을 시작할 수 있습니다. 내피 세포 (내피) 보존 세균의 구성 요소와 위험 분자의 다양성을 인식하고 표현 패턴 인식 수용체, 그리고 TNFα와 같은 호스트에 염증 매개체에 대한 수용체. 이들 수용체의 활성화는 내피는 사이토 카인 (예를 들어, IL-6, IL-8, CXCL1 및 CCL2) 분비하고, 그들의 세포 표면 1에서 부착 분자 (예를 들어, E / P-셀렉틴, VCAM-1, ICAM-1)를 상향 조절을 유도 2. 이 분자는 모든 전염성 에이전트의 호스트를 삭제하고 조직 수선에게 3,4을 시작하기 위해 감염과 부상의 사이트에 백혈구의 국산화를 촉진한다. 감염 호중구 반응은 혈관 내피 세포와 응답 사이의 잘 조율 된 상호 작용을 포함 호중구. EC의 활성화에 따라, IL-8 분비 감염이나 부상 5,6의 사이트에 집으로 호중구 수있는 내피 세포에서 혈관 그라데이션을 형성하고 있습니다. E / P-셀렉틴를 중재 호중구 캡처 및 호중구 세포 표면에 glycomolecules 상대적으로 약한 연결을 통해 압 연입니다. 이러한 상호 작용은 그 동족 수용체 IL-8 바인딩과 함께, 강력한, 인테-매개 부착과 내피 세포 표면 7-10 호중구 결국 체포를 용이하게합니다. 체포 후 호중구가 직접 병원균을 제거 병원균의 확산을 방지하기 위해 호중구 세포 트랩을 생성, 상처 치유를 촉진하고 단핵구, 대 식세포 및 수지상 등의 백혈구를 모집하는 추가 요인을 풀어 감염의 특정 사이트에 혈관 밖으로 마이그레이션 할 수 있습니다 세포 11-17.

microv에 호중구 부착을 정량 할 수있는 체외 방법은이 보고서에 설명ascular는 TNFα 호스트 염증 매개체에 의해 활성화 된 후 ECS. 이 분석은 내피의 활성화, 그리고 호중구을 평가하기 위해 설계되었습니다. 인간의 기본 호중구 먼저 밀도 기울기 분리를 사용하여 격리하고, 다음 calcein 아세 톡시 (AM)로 표시되어 있습니다. 살아있는 세포 가수 분해 calcein에서 에스 테라 제는 492-495 nm의 513-516 nm의 18의 배출 여기에 높은 형광 calcein 분자 오전. 찬란 - 라벨 호중구는 다음 EC 단층으로 배양되고, 비 부착 호중구는 이후에 제거됩니다. 나머지 바운드 호중구의 형광 그 형광 분광 광도계를 사용하여 측정하고, 잘 당 총 호중구 형광 입력의 비율로 계산됩니다. 이 방법은 분광 광도계에 사용되는 바인딩 calcein - 라벨 호중구가 직접 EC의 AC 읽어 더 많은 정성을 제공하는 형광 현미경을 사용하여 시각화 할 수있는 추가적인 장점이 있습니다tivati​​on. 이 분석은 정적 인 조건에서 수행되기 때문에, 호중구 부착 폭포에서 발생 만 매우 초기 이벤트가 부과됩니다. 이 TNFα 처리 인간의 폐 혈관 EC (HMVEC 폐)에 해당 호중구 준수 E-셀렉틴과의 상호 작용이 중단 될 때 단일 층이 대폭 감소를 표시하는 E-셀렉틴 차단 항체를 사용하여이 보고서에서 확인됩니다.

TNFα에 더하여, 우리는 성공적으로 수신자 같은 수용체 1 / 2 작용제 펩티도 글리 칸과 연관된 지단백 (PAL), murein 지방 단백질 (MLP)와 Pam3Cys에 의해 인간 제대 정맥 EC (HUVEC) 활성화의 범위를 결정하기 위해이 분석을 사용했습니다 Pam3Cys 19,20으로 HMVEC 폐 활성화. 또한, 우리는 성공적으로이 방법론의 다양한 호환되는 제안, 키나제 억제제와 HMVEC 폐의 표면과 세포질 단백질의 RNAi를 매개 최저 한 후이 분석을 사용 생화학 screeninG의 분석 20. 요약하면,이 분석은 체외에서 염증 매개 물질에 의해 EC 활성화의 범위를 액세스 할 재현성, 더 많은 기능을 방법을 사용하기 쉽게 제공합니다.

프로토콜

1. 도금 및 미세 혈관 내피 세포의 유지 보수

  1. 해동 및 제조 업체에 따라 혈관 내피 세포 성장 지침을 제공. 이 프로토콜에서는, 세포는 EGM-2 MV 미디어 (론자)에서 재배되었고, 그것은 모든 실험은 통과 번호로 인한 변형을 최소화하기 위해 해동 후 2 주 내에서 수행하는 것이 좋습니다. HMVEC 폐를 가진 우리의 실험은 9-4 구절 사이에 수행됩니다.
  2. 1 일 : 세포가 80 % ~ 90 % confluency에 도달하면 trypsinize 및 ML 당 120,000 세포에 resuspend을. 48도, 폴리스티렌 조직 배양 플레이트 (들)에 플레이트 잘 당 36,000 세포 (0.3 mL를). 배경 형광 판독 값을 얻기 위해 백혈구와 함께 배양되지 않습니다 HMVEC의 우물이 (가) 있습니다. 특히 형광 분석, 교대 행 또는 열을 위해 디자인 된 48 - 웰 플레이트를 사용하지 않는 이웃 우물에서 어떤 빛 ​​오염을 최소화 할 수 있습니다. 참고 : 웰스 폴리 라이시로 사전 코팅 할 수 있습니다NE, 콜라겐이나 fibronectin의.
  3. 주 2 : 신선한 매체를 추가합니다.
  4. 3 일 : 위상차 현미경으로 세포가 (즉, "조약돌"외관과 작은 세포 파편) 건강한 확인하고, 그들은 100 % 합류 (그림 1)입니다. 세포가 100 % 합류하지 않은 경우 그들은 준비가 될 때까지 매일 미디어를 변경합니다.
  5. HMVEC 단층 치료 준비가되면, 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 한 번 세포를 세척하고 적절한 우물에 염증 작용제를 포함하는 신선한 EGM-2 MV 미디어 또는 미디어 0.3 ML를 추가합니다. 이 프로토콜에 HMVEC 폐는 TNFα 처리 하였다 3 시간 동안 [100 NG / ML] (PeproTech, 뉴저지)이 EC에 21 잘 설명 활성제이기 때문에. 주 : 당신의 활성화 HMVEC 세포 (단계 4.1)와 calcein 레이블이 호중구 (단계 3.5) 오전 그래서 당신은 시간 실험을하는 것은 동시에 사용할 준비가 권장됩니다. 그것은 neutroph를 분리하고 라벨을 우리에게 약 2.5 시간 소요ILS.

2. Polymorphprep를 사용하여 호중구의 분리

  1. 이전 22 설명 된 호중구를 분리, 또는 전체 혈액에서 다형 과립구를 분리하는 기성품 밀도 기울기 솔루션. Nuzzi, 외 의해 프로토콜에 따라 Polymorphprep을 채용. 전체 혈액의 23 ML 당 약 2-3 X 10 6 호중구의 생산량 2007 결과. 참고 : 적혈구를 제거하기 위해 과도한 적혈구 용해, 덱스 트란 침강을 방지하려면이 밀도 기울기 원심 분리 24 이전에 수행 할 수 있습니다.
  2. RT에 Polymorphprep 밀도 기울기 솔루션을 가지고.
  3. 의 면전에서 건강한 인간 자원에서 전체 혈액의 30 ML를 수집 헤파린, 구연산 또는 EDTA로 항 응고. 혈액은 2 시간 이내에 사용하고, 18-22 ° C. 사이에서 유지되어야한다
  4. 15 ML 원뿔 튜브의 밀도 기울기 용액 (5 ㎖를 통해 전체 혈액의 5 층 ML 그림 2A). 이 다음 원심 분리 조건을 변경할 수 있으므로 혈액의 볼륨과 밀도 기울기 솔루션을 변경하지 마십시오.
  5. 18-22시 30 분 450 XG에 원심 분리기 ° C. 천천히 속도를 아래로 원심 분리기 (즉, 원심 브레이크를 해제) 및 호중구의 활성화를 줄이고 레이어의 혼합을 방지하기 위해 진동을 방지하기 위해 잘 튜브의 균형을해야합니다. 이상 원심 분리 시간 이상 원심력 펠렛 적혈구쪽으로 더 아래로 마이그레이션하는 호중구를 포함하는 낮은 백혈구 층에서 발생합니다.
  6. 호중구 (그림 2B)를 포함하는 레이어의 오염을 방지하기 위해 말초 혈액을 포함하는 플라즈마 상 백혈구 밴드를 대기음.
  7. 호중구를 포함하는 낮은 백혈구 층을 제거하는 1-2 ML 혈청 피펫을 사용합니다. PBS의 30 ML에 호중구 층을 결합 50ml에 (칼슘없이 + 및 마그네슘 2 +)원뿔 튜브.
  8. PBS 50 ML (칼슘없이 + 및 마그네슘 2 +) 18-22시 10 분 450 XG에 원심 분리기 ° C.에 볼륨을 가지고

참고 : 단계 2.9 및 2.10은 선택 사항이지만 매우 좋습니다.

  1. 뜨는을 대기음. 적혈구를 용해하기 위해 30 초 동안 멸균 물 8 ㎖에 호중구를 resuspend을 즉시 배 PBS 2 ML (칼슘없이 + 및 마그네슘 2 +) 부드럽게 손으로 혼합이.에서 세포를 배양하지 마십시오에 세포 현탁액을 추가 이상 30 초 동안 물 상당한 호중구 죽음이 발생할 수 있기 때문이다.
  2. 18-22에서 5 분 250 XG에 원심 분리기 ° C.
  3. PBS의 10 ML (칼슘없이 + 및 마그네슘 2 +)과 18-22에서 5 분 250 XG에서 다시 원심 분리기 ° C. 한 번 세포를 씻으
  4. RPMI-1640 10 ㎖에 호중구를 resuspend을 (페놀 레드없이) 트리 판 블루를 사용하여 살아있는 세포를 계산E 염색 제외 방법. 이 호중구의 활성화가 발생할 수 있으므로 ML 당 5 × 10 6보다 큰 세포 밀도의 연장 기간을 피하십시오.

3. Calcein AM와 호중구 레이블

  1. 6 × 10 5 호중구는 48 - 웰 플레이트 잘 당 사용됩니다.
  2. 계산 후, 50 ML 원뿔 튜브에 재 부유 세포를 전송하고 2-4 페놀 레드 무료 RPMI-1640 ML 당 X 10 6 세포 호중구를 희석.
  3. calcein 3 μM (calcein AM 품절 즉, 2.98 μL (1 MG / ML) 당 ML 미디어)의 주식 솔루션 AM 추가하고 부드럽게 튜브를 가볍게 치면 잘 섞는다. 이상 5 μM는 calcein 호중구에서 누수가 발생합니다 오전. 주 : 비 형광 calcein AM이 높은 형광 분자 calcein (즉, 죽은 세포가 형광을하지 않을 것이다) 생산 내생 에스 테라 제에 의해 세포 내에서 쪼개 있습니다.
  4. 알루미늄 호일로 튜브를 커버와 f를 품다또는 37 30 분 ° 어둠 주에 C :. 긴 배양 시간은 접착 분석의 과정을 통해 호중구에서 해방되고 더 calcein이 발생할 수 있습니다.
  5. 18-22 ° C에서 5 분 450 XG에 원심 분리기 및 RPMI-1640 10 ㎖ (페놀 레드 않고, 37 미리 예열 ° C)의 2 배 호중구을 씻는다. 40 μM 살균 필터가 18-22에서 덩어리를 제거하고 5 분 450 XG에 한 번 더 원심 분리 할 수​​ 있지만 두 번째 세척에 대한 세포를 현탁 한 후, 최초의 호중구를 통과 ° C.
  6. ML 당 2 × 10 6 호중구에서. (37 ° C로 예열없이 페놀 레드) RPMI 1640 호중구를 resuspend을

4. 호중구 바인딩 분석

  1. 필터 소독 (0.22 μm의) RPMI 1640 0.5 ML (페놀 레드없이) 잘 당 3 % BSA를 포함하는와 배 HMVEC 단일 층을 씻으십시오.
  2. 미디어를 대기음 6 × 10 5 calcein - 라벨 호중구 (셀 suspensio의 0.3 ML를 추가. 48 - 웰 플레이트주의의 적절한 우물에 호중구가없는 RPMI 1640 N), 0.3 ML은 (페놀 레드없이) : 이것은 cm 2 당 8 × 10 5 호중구에 해당합니다.
  3. 37 ° C에서 20 분, 5 % CO 2 배양기에 대해 품어.
  4. 총 호중구 형광 (PRE 세척) : 485 ㎚의 여기 파장과 FLUOstar, 또는 이와 동등한 분광 광도계 520 nm의 (형광 필터 세트)의 발광 파장 각 우물의 형광 강도를 측정한다. . 직전에 배양 엔드 포인트에 참고이 단계를 수행하십시오 :이 프로토콜에서는, calcein의 여기 및 방출되는 빛의 검출이 밝혀 우물의 상단에서 수행되었다, 그러나 모두는 우물의 바닥에서 수행 할 수 있습니다.
  5. PBS의 잘 당 0.5 mL로 배 HMVEC 단층 및 호중구가 포함 된 우물 세척 (W / CA 2 + 및 마그네슘 2 +). 미디어 및 세척을 제거반전 플레이트 및 종이 타월로 가볍게 두드려하면 남아있는 액체를 제거합니다.
  6. 다시 잘 당 RPMI 1640 0.3 mL를 (페놀 레드없이)을 추가합니다.
  7. 자기편 호중구 형광 (POST 세척) 단계 4.4에서뿐만 아니라 각각의 형광 강도를 측정한다.
  8. 퍼센트 준수하고 잘 당 기준 준수를 확인합니다 :

참고 :이 단계에서, calcein - 라벨 호중구의 이미지가 표준 형광 필터 장착 된 형광 현미경 능력을 사용하여 얻을 수 있습니다. 그림 4의 이미지는 Pro7 소프트웨어 (Q 이미징) Q는 캡처를 사용 Retiga 2000R 카메라 (Q 영상)를 탑재 올림푸스 IX51 도립 현미경 하였다.

결과

호중구 바인딩 분석을 사용하여 신뢰성, 재현성 결과를 얻기 위해서는 그림 1 HMVEC 폐에 그림과 같이 건강과 미세 혈관 내피 세포의 confluency에이 분석의 날에 최적이다하는 것이 필수적이다. 또한, 낮은 통로 번호 혈관 내피는 (이하 9 구절 즉,)를 사용하는 것이 필수적이며, 따라서, 우리는 해동 2 주 이내에 모든 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 호중구의 건강은 세포가 어떤 방?...

토론

성공적으로 호중구 / 미세 혈관 내피 세포 접착 분석을위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 : 1) 낮은 통로 번호 (<10), 건강한 내피 세포의 사용, 낮은 밀도 (즉, <5 × 10 6 세포에서 분리 된 호중구를 유지 2) / ㎖) 및 분리 2 시간 이내에 그들을 사용하여, 각각 3) 까다로운 calcein AM-라벨 호중구의 세척 및 호중구에서 calcein의 EC 오염과 손실을 최소화하기 위해 적시에 calcein AM-라?...

공개

저자는 공개 아무것도 없어.

감사의 말

이 작품은 마취와 수술 전후 관리의 UCSF 부에 의해 지원되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
HMVEC-LungLonzaCC-2527
EGM-2 MVLonzaCC-3202
HBSSLife Technologies14175-095Can be substituted with any vendor
48-well Tissue Culture PlatesBD Falcon353078
PBS (without phenol red)UCSF Cell Culture FacilityCCFAL001Can be substituted with any vendor
D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red)UCSF Cell Culture FacilityCCFAL003Can be substituted with any vendor
RPMI-1640 (without phenol red)Life Technologies11835-030
PolymorphprepAxis-Shield1114683
calcein AMLife TechnologiesC3099(0.995 mM) stock soln
Trypan Blue SolutionSigma-AldrichT8154
40 μM filtersVWR21008-949Can be substituted with any vendor
FLUOstar OPTIMA SpectrophotometerBMG LABTECH-

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