Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay misurare Adesione neutrofili attivati ​​per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche

Riepilogo

L'adesione dei neutrofili all'endotelio attivato nei siti di infezione è una componente integrale della risposta infiammatoria dell'ospite. Descritto in questo rapporto è un saggio di legame dei neutrofili che permette la In vitro Quantificazione di neutrofilo umana primaria legame alle cellule endoteliali attivate da mediatori infiammatori in condizioni statiche.

Abstract

L'endotelio vascolare svolge un ruolo fondamentale nella risposta infiammatoria. Durante la fase acuta dell'infiammazione, cellule endoteliali (EC) sono attivati ​​da mediatori ospitanti o direttamente da componenti microbici conservati o molecole pericolo ospite-derivati. Attivati ​​ecs esprimere citochine, chemochine e molecole di adesione che mobilitano, attivano e mantengono leucociti nel sito di infezione o lesioni. Neutrofili sono i primi ad arrivare leucociti, e aderire alla endotelio attraverso una varietà di molecole di adesione presenti sulle superfici di entrambe le celle. Le principali funzioni di neutrofili sono eliminare direttamente minacce microbiche, promuovere l'assunzione di altri leucociti attraverso il rilascio di fattori aggiuntivi, e avviare riparazione della ferita. Pertanto, il loro reclutamento e attaccamento alla endotelio è un passaggio fondamentale nell'iniziazione della risposta infiammatoria. In questo rapporto, descriviamo un test di adesione in vitro usando neutrofilicalceina AM-etichettato neutrofili umani primari per quantificare il grado di attivazione delle cellule endoteliali microvascolari in condizioni statiche. Questo metodo ha il vantaggio aggiuntivo che gli stessi campioni quantizzati mediante spettrofotometria a fluorescenza possono anche essere visualizzati direttamente utilizzando la microscopia a fluorescenza per una valutazione più qualitativa di legame neutrofili.

Introduzione

Poiché l'endotelio vascolare è in contatto diretto con il sangue circolante, esso è sitato ad iniziare una risposta infiammatoria rapido durante infezioni o lesioni. Le cellule endoteliali (EC) recettori di pattern recognition espresso che riconoscono una varietà di componenti batteriche conservati e molecole pericolo, e recettori per Host mediatori infiammatori, come TNFa. Attivazione di questi recettori induce EC per secernere citochine (es IL-6, IL-8, CXCL1 e CCL2), e per upregulate molecole di adesione (ad esempio E / P-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) alla loro superficie cellulare ^{1 , 2.} Queste molecole tutto facilitano la localizzazione dei leucociti ai siti di infezione e lesioni per chiarire l'host di agenti infettivi e avviare la riparazione tissutale ^3,4. La risposta dei neutrofili all'infezione comporta un'interazione ben coordinato tra l'endotelio vascolare e la risposta neutrofili. All'attivazione EC, IL-8 è secreto e forma un gradiente intravascolare sull'endotelio che permette di neutrofili casa al sito di infezione o lesioni ^5,6. E / P-selectine mediata neutrofili cattura e rotolare attraverso le associazioni relativamente deboli con glycomolecules sulla superficie cellulare dei neutrofili. Queste interazioni, insieme con IL-8 legame ai suoi recettori cognate, facilitano il robusto, attaccamento integrina-mediata ed eventuale arresto dei neutrofili sulla superficie delle cellule endoteliali ^7-10. Dopo l'arresto, i neutrofili possono migrare fuori della vascolarizzazione ai siti specifici di infezione di eliminare direttamente i patogeni, generare neutrofili trappole extracellulari per prevenire la diffusione di agenti patogeni, promuovere la guarigione delle ferite e rilasciare fattori aggiuntivi che reclutano leucociti altri come monociti, macrofagi e dendritiche cellule ^11-17.

Descritte nella presente relazione è un metodo in vitro per quantificare l'adesione dei neutrofili alle microVascular I CE dopo l'attivazione da parte del mediatore infiammatorio ospite TNFa. Questo test è stato progettato per valutare l'attivazione delle cellule endoteliali, e non neutrofili. Neutrofili umani primari sono stato isolato utilizzando separazione gradiente di densità, e sono quindi etichettati con calceina acetossimetil (AM). Esterasi all'interno delle cellule in diretta idrolizzano calceina AM alla molecola calceina altamente fluorescente con una eccitazione di 492-495 nm ed emissione di 513-516 nm ^18. I neutrofili fluorescenza marcata vengono poi incubate con monostrati CE, e neutrofili non aderenti sono successivamente rimossi. La fluorescenza dei rimanenti, neutrofili legato viene quindi misurata mediante uno spettrofotometro a fluorescenza, e calcolata come percentuale del totale dei neutrofili ingresso fluorescenza per pozzetto. Questo metodo ha il vantaggio aggiuntivo che i neutrofili calceina-etichettati vincolati utilizzati in spettrofotometria possono essere visualizzati direttamente utilizzando la microscopia a fluorescenza per dare una lettura più qualitativa di ac CEtivazione. Dal momento che questo test viene eseguito in condizioni statiche, saranno valutati solo gli eventi molto iniziali che si verificano nella adesione cascata neutrofili. Ciò è confermato in questo rapporto utilizzando anticorpi bloccanti E-selectina per dimostrare che l'adesione dei neutrofili alle TNFa-trattato polmone umano microvascolare CE (HMVEC-Lung) monostrati si riduce drasticamente quando l'interazione con la E-selectina è perturbato.

Oltre a TNFa, abbiamo utilizzato con successo questo test per determinare l'entità della vena ombelicale CE attivazione umana (HUVEC) dal recettore Toll-like mezzo agonisti lipoproteine ​​peptidoglicano-associato (PAL), murein lipoproteina (MLP) e Pam3Cys e attivazione HMVEC-Lung da Pam3Cys ^19,20. Inoltre, abbiamo utilizzato con successo questo test con inibitori delle chinasi e dopo knockdown RNAi-mediata di superficie e proteine ​​citoplasmatiche in HMVEC-Lung, suggerendo che questa metodologia è compatibile con una varietà di biochimica e screening saggi ^20. In sintesi, questo saggio fornisce un facile da usare, modo riproducibile, più funzionale per accedere alla misura dell'attivazione CE da mediatori infiammatori in vitro.

Protocollo

1. Placcatura e manutenzione di microvascolari cellule endoteliali

1. Scongelare e far crescere le cellule endoteliali microvascolari secondo i produttori fornite istruzioni. In questo protocollo, le cellule sono state coltivate in EGM-2 MV multimediale (Lonza), e si raccomanda che tutti gli esperimenti vengono eseguiti entro due settimane lo scongelamento per ridurre al minimo qualsiasi variazione dovuta al numero di passaggio. I nostri esperimenti con HMVEC-Lung vengono eseguiti tra passaggi 4-9.
2. Giorno 1: Quando le cellule raggiungono 80-90% di confluenza, trypsinize e sospendere nuovamente a 120.000 cellule per ml. Piastra 36.000 cellule (0,3 ml) per pozzetto in 48 pozzetti, piastra di coltura tissutale polistirene (s). Includere pozzi di HMVEC che non saranno incubate con neutrofili in modo da ottenere una lettura della fluorescenza di fondo. A meno che utilizzando piastre 48 pozzetti appositamente progettati per le analisi di fluorescenza, alternando righe o colonne ridurrà al minimo la contaminazione leggera da pozzi vicini. NOTA: Wells può essere pre-rivestito con poli-LYSIne, collagene o fibronectina.
3. 2 ° giorno: Aggiungi mezzi freschi.
4. Giorno 3: In contrasto di fase, confermano le cellule sono sane (cioè l'aspetto "acciottolato" e poco detriti cellulari), e sono al 100% confluenti (Figura 1). Se le cellule non sono al 100% confluenti, cambiare i media ogni giorno fino a quando non sono pronti.
5. Una volta che i monostrati HMVEC sono pronti per il trattamento, lavare le cellule una volta con soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) e aggiungere 0,3 ml di fresca EGM-2 supporti MV o supporti contenenti agonisti infiammatoria nei rispettivi pozzetti. In questo protocollo il HMVEC-Lung state trattate con TNFa [100 ng / ml] (Peprotech, New Jersey) per 3 ore poiché questo è un attivatore ben descritto di EC ^21. NOTA: Si raccomanda di tempo l'esperimento in modo che le vostre cellule HMVEC attivati ​​(Passo 4.1) e calceina AM neutrofili etichettati (Passo 3.5) sono pronti per l'uso, allo stesso tempo. Ci vogliono circa 2,5 ore per isolare ed etichettare neutrophils.

2. Isolamento dei neutrofili utilizzando Polymorphprep

1. Isolare i neutrofili come descritto in precedenza ^22, o con una soluzione pronta gradiente di densità di isolare granulociti polimorfonucleati dal sangue intero. Impiegando Polymorphprep seguendo il protocollo di Nuzzi et.al. risultati 2007 dei rendimenti di circa 2-3 x 10 ⁶ neutrofili per ml di sangue intero ^23. NOTA: per evitare un eccessivo lisi degli eritrociti, una sedimentazione destrano per rimuovere i globuli rossi possono essere svolte prima di centrifugazione in gradiente di densità ^24.
2. Portare la soluzione gradiente di densità Polymorphprep a RT.
3. Raccogliere 30 ml di sangue intero da un volontario umano sano in presenza di un anticoagulante come l'eparina, citrato o EDTA. Il sangue deve essere utilizzato entro 2 ore, e mantenuta tra 18-22 ° C.
4. Strato 5 ml di sangue intero in 5 ml della soluzione di gradiente di densità in un tubo da 15 ml (Figura 2A). Evitare di alterare i volumi di sangue e la soluzione gradiente di densità in quanto ciò potrebbe cambiare le successive condizioni di centrifugazione.
5. Centrifugare a 450 xg per 30 minuti a 18-22 ° C. Assicurati di accelerare lentamente su e giù per la centrifuga (cioè spegnere il freno centrifuga), e bilanciare i tubi bene per evitare che le vibrazioni per contribuire a ridurre l'attivazione dei neutrofili e prevenire la miscelazione di strati. Tempi più lunghi di centrifugazione o di forza centrifuga maggiore si tradurrà nello strato leucocitaria inferiore, che contiene i neutrofili, a migrare più in basso verso i globuli rossi pellet.
6. Aspirare il plasma e leucociti banda superiore contenente PBMC di impedire la contaminazione dello strato contenente neutrofili (Figura 2B).
7. Utilizzare un 1-2 ml pipetta sierologica per rimuovere lo strato inferiore contenente leucociti neutrofili. Unire i livelli di neutrofili in 30 ml di PBS (senza Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +)} in 50 mltubo conico.
8. Portare il volume a 50 ml con PBS (senza Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +)} e centrifugare a 450 xg per 10 minuti a 18-22 ° C.

Nota: I punti 2.9 e 2.10 sono opzionali, ma altamente raccomandato.

9. Aspirare il surnatante. Risospendere i neutrofili in 8 ml di acqua sterile per 30 sec per la lisi dei globuli rossi, aggiungere immediatamente la sospensione di cellule per 2 ml di PBS 5x (senza Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +)} e mescolare delicatamente con le mani. Non incubare le cellule in acqua per più di 30 secondi dal momento significativo morte neutrofili può verificarsi.
10. Centrifugare a 250 xg per 5 minuti a 18-22 ° C.
11. Lavare le cellule una volta con 10 ml di PBS (senza Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +)} e centrifugare nuovamente a 250 xg per 5 minuti a 18-22 ° C.
12. Risospendere i neutrofili in 10 ml di RPMI-1640 (senza rosso fenolo) e contare le cellule vive usando il blu tripanotingere metodo di esclusione. Evitare periodi prolungati di densità cellulari maggiori di 5 x 10 ⁶ per ml poiché questo può causare l'attivazione dei neutrofili.

3. Neutrofili Etichettatura con Calcein AM

1. 6 x 10 ⁵ neutrofili sono utilizzati per pozzetto di una piastra a 48 pozzetti.
2. Dopo il conteggio, trasferire le cellule risospese ad una provetta da 50 ml e diluire i neutrofili a 2-4 x 10 ⁶ cellule per ml con fenolo aneritro RPMI-1640.
3. Aggiungi calceina AM soluzione madre di 3 micron (cioè 2,98 ml di calceina AM madre (1 mg / ml) per ml di media) e mescolare bene muovendo delicatamente il tubo. Superiore a 5 micron calceina AM si tradurrà in perdite dai neutrofili. Nota: non fluorescente calceina AM viene scissa nelle cellule dalle esterasi endogene per produrre la molecola altamente fluorescente calceina (vale a dire le cellule morte non fluorescenza).
4. Coprire il tubo con un foglio di alluminio e incubare for 30 min a 37 ° C al buio. Nota: i tempi di incubazione più lunghi possono tradursi in maggiore calceina essere liberata dai neutrofili nel corso del saggio di adesione.
5. Centrifugare a 450 xg per 5 minuti a 18-22 ° C, e lavare i neutrofili 2x con 10 ml di RPMI-1640 (senza rosso fenolo; pre-riscaldato a 37 ° C). Dopo risospendere le cellule per il secondo lavaggio, prima passare i neutrofili con un filtro sterile 40 pM per eliminare grumi e quindi si centrifuga di nuovo a 450 xg per 5 minuti a 18-22 ° C.
6. Risospendere i neutrofili in RPMI 1640 (senza rosso fenolo; pre-riscaldato a 37 ° C) a 2 x 10 ⁶ neutrofili per ml.

4. Neutrofili Binding Assay

1. Lavare i monostrati HMVEC 3x con 0,5 ml di sterilizzata per filtrazione (0,22 micron) RPMI 1640 (senza rosso fenolo) contenente il 3% di BSA per pozzetto.
2. Aspirare i media e aggiungere 6 x 10 ⁵ neutrofili calceina-etichettati (0,3 ml di sospensione cellulare), Oppure 0,3 ml di RPMI 1640 (senza rosso fenolo) senza neutrofili, nei rispettivi pozzetti della 48 pozzetti. Nota: Questo è l'equivalente di 8 x 10 ⁵ neutrofili per cm ^2.
3. Incubare per 20 min a 37 ° C, 5% CO ₂ incubatore.
4. Totale dei neutrofili Fluorescenza (PRE lavaggio): Misurare l'intensità di fluorescenza di ciascun bene con una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di 520 nm (fluoresceina filtro impostato) in una FLUOstar, o equivalente, spettrofotometro di emissione. Eseguire questo passaggio appena prima del punto finale incubazione Nota: In questo protocollo, calceina eccitazione e rilevamento della luce emessa state eseguite dalla sommità dei pozzi scoperti, tuttavia, entrambi possono essere eseguite anche dal fondo dei pozzetti..
5. Lavare i pozzetti contenenti monostrati HMVEC e neutrofili 5x con 0,5 ml per pozzetto di PBS (w / Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +).} Rimuovere il supporto e lavaggiinvertendo la piastra, e picchiettando delicatamente su carta assorbente per eliminare il liquido rimasto.
6. Aggiungi posteriore 0,3 ml di RPMI 1640 (senza rosso fenolo) per pozzetto.
7. Aderente neutrofili Fluorescenza POST (lavaggio): Misurare l'intensità di fluorescenza di ogni nonché al punto 4.4.
8. Determinare l'aderenza per cento e l'adesione relativa per bene:

Nota: In questa fase, le immagini dei neutrofili calceina-etichettati possono essere ottenuti utilizzando un microscopio capace fluorescenza dotato di filtri fluoresceina standard. Le immagini in figura 4 sono stati ottenuti su una Olympus IX51 microscopio invertito dotato di una fotocamera 2000R Retiga (Q Imaging) con Q-Capture Software Pro7 (Q Imaging).

Risultati

Per ottenere risultati affidabili e riproducibili usando un saggio di legame neutrofili, è essenziale che la salute e la confluenza delle cellule endoteliali microvascolari sono ottimali nel giorno del saggio, come illustrato con HMVEC-Lung in Figura 1. Inoltre, è indispensabile che passaggio basso numero microvascolare EC vengono utilizzati (cioè meno di 9 brani), e di conseguenza, si consiglia di eseguire tutti gli esperimenti entro due settimane di scongelamento. La salute dei neutrofili ...

Discussione

Le fasi più critiche per una neutrofili di successo / endoteliale microvascolare saggio di adesione cellulare sono: 1) Uso di basso numero di passaggio (<9), cellule endoteliali sane; 2) Il mantenimento dei neutrofili isolati a bassa densità (cioè <5 x 10 ⁶ cellule / ml) e il loro utilizzo in due ore di isolamento, e 3) il lavaggio Fastidious dei neutrofili calceina AM-etichettati e l'uso dei neutrofili calceina AM-etichettati in modo tempestivo per ridurre al minimo la contaminazione CE...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
HMVEC-Lung	Lonza	CC-2527
EGM-2 MV	Lonza	CC-3202
HBSS	Life Technologies	14175-095	Can be substituted with any vendor
48-well Tissue Culture Plates	BD Falcon	353078
PBS (without phenol red)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL001	Can be substituted with any vendor
D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL003	Can be substituted with any vendor
RPMI-1640 (without phenol red)	Life Technologies	11835-030
Polymorphprep	Axis-Shield	1114683
calcein AM	Life Technologies	C3099	(0.995 mM) stock soln
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154
40 μM filters	VWR	21008-949	Can be substituted with any vendor
FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer	BMG LABTECH	-