量<em在体外</em&gt;激活的主人微血管内皮细胞在静态条件下测量的检测，以中性粒细胞粘附

摘要

中性粒细胞活化的内皮细胞在感染部位是坚持宿主的炎症反应的一个组成部分。本报告中所述的是中性粒细胞的结合测定法，它允许对在体外初级人类嗜中性粒细胞的定量静态条件下的炎症介质激活内皮细胞的结合。

摘要

血管内皮细胞在炎症反应中起一个不可分割的一部分。在炎症的急性期，被激活的内皮细胞（ECs）的主机介质，或直接由保守的微生物成分或宿主来源的危险分子。活化的内皮细胞表达细胞因子，趋化因子和粘附分子，调动，激活和留住白细胞感染或受伤在现场。嗜中性粒细胞是白细胞到达，和坚持的内皮细胞上存在两种细胞表面粘附分子通过各种。嗜中性粒细胞的主要功能是直接消除微生物的威胁，促进招聘其他白细胞通过释放其他因素，并启动修复创面。因此，他们的招聘和附件的内皮细胞，是启动的炎症反应中的关键一步。在这份报告中，我们描述了一个在体外中性粒细胞粘附实验使用钙黄绿素AM标记初级人类嗜中性粒细胞在静态条件下，定量微血管内皮细胞活化的程度。此方法具有附加的优点，荧光分光光度法定量测定同一样品，也可以直接用荧光显微镜定性评估的中性粒细胞结合更可视化。

引言

由于血管内皮细胞在循环血液直接接触，它是唯一位于启动一个快速的在感染或损伤的炎症反应。内皮细胞（EC）表示模式识别受体，可以识别各种保守的细菌成分和危险分子，以及宿主的炎症介质如肿瘤坏死因子受体。这些受体的激活诱导内皮细胞分泌的细胞因子（ 例如 IL-6，IL-8，CXCL1和CCL2），并上调粘附分子（ 例如 E / P-选择素，VCAM-1和ICAM-1）在其细胞表面^{1 ，2。}所有这些分子促进本地化的感染和损伤部位的白细胞，中性粒细胞对感染的反应，以明确的传染性病原体的主机并发起组织修复^3,4涉及协调良好的血管内皮细胞和响应之间的相互作用中性粒细胞。 EC激活后，IL-8分泌，形成血管内梯度上的内皮细胞，使中性粒细胞感染或受伤的^5,6家中到现场。 E / P-选择素介导的中性粒细胞捕获和通过相对较弱协会与glycomolecules中性粒细胞表面滚动。这些相互作用，以及与IL-8其同源受体结合，促进强劲，中性粒细胞在内皮细胞表面^7-10整合素介导的附件，并最终逮捕。被逮捕后，嗜中性粒细胞可以迁移出具体感染部位，直接消除病原体，产生中性粒细胞胞外的陷阱，以防止病原体的传播，促进伤口愈合，并释放出额外的因素，招募其他的白细胞，如单核细胞，巨噬细胞和树突状血管细胞^11-17。

本报告中描述的是一种体外的方法来定量中性粒细胞的粘附，术后1血管性内皮细胞活化后由主机炎症介质TNFα。本试剂盒的目的是评估的激活的内皮细胞，而不是中性粒细胞。初级人类嗜中性粒细胞是首先使用密度梯度分离分离，然后标记的乙酰氧基甲基钙黄绿素（AM）。酯酶的活细胞内水解钙黄绿素AM的高荧光钙黄绿素分子的激发492-495 nm，发射513-516纳米^18。荧光标记的嗜中性粒细胞与EC的单分子膜，然后孵育，其后除去非粘附的中性粒细胞。剩余的，结合的嗜中性粒细胞的荧光，然后使用荧光分光光度计测定，计算作为一百分比的总的嗜中性粒细胞的荧光每孔输入。这种方法有绑定的钙黄绿素标记的嗜中性粒细胞用于分光额外的好处是可以用荧光显微镜直接观察，给予了更多的定性读出EC交流tivati​​on。由于此法是在静态条件下，只有非常初步的事件发生在中性粒细胞粘附级联评审会。这也证实在本报告中，使用E-选择素抗体阻断，表明中性粒细胞粘附的TNFα处理人肺微血管EC（HMVEC龙）单层与E-选择素的相互作用时，大大减少被打乱。

除了对TNFα，我们已经成功地使用这种检测人脐静脉EC（HUVEC）激活Toll样受体1/2激动剂肽相关脂蛋白（PAL），胞壁质脂蛋白（MLP）和Pam3Cys和程度来确定龙HMVEC激活由Pam3Cys ^19,20。此外，我们还成功地使用这种检测激酶抑制剂和RNAi介导的表面和胞质蛋白在HMVEC龙击倒后，表明这种方法是兼容与各种生化和screenin克分析^20。综上所述，这个实验提供了一个易于使用的，重现性好，功能更强大的方式来访问EC活化程度的炎症介质在体外 。

研究方案

1。电镀和维护微血管内皮细胞

1. 解冻和增加你的微血管内皮细胞，根据制造商提供的说明。在这个协议中，细胞生长在EGM-2 MV媒体（龙沙），并建议所有的实验进行两周内解冻，以尽量减少由于通道数量的任何变化。我们的实验与HMVEC龙进行4至9之间的通道。
2. 第1天:当细胞达到80-90％汇合，胰蛋白酶消化，悬浮在120,000细胞每毫升。板36,000细胞（0.3毫升），每孔48孔，聚苯乙烯组织培养板（S）。包括HMVEC井， 不会与嗜中性粒细胞进行培养，以获得背景荧光读数。除非使用专门设计的荧光的检测方法，交替的行或列的48孔板，将最大限度地减少任何光线从邻近井的污染。注:井可以是预先涂有聚LYSINE，胶原蛋白或纤维连接蛋白。
3. 第2天:加入新鲜的培养基。
4. 第3天:相衬显微镜，确认细胞是健康的（ 即 "鹅卵石"外观和小细胞碎片），他们是100％的融合（ 图1）。如果细胞是不是100％融合，改变媒体的每一天，直到他们准备好了。
5. 一旦HMVEC单层准备治疗，洗一次细胞与汉克的平衡盐溶液（HBSS），加0.3毫升新鲜EGM-2 MV的媒体或媒体到合适的井含炎症激动剂。在这个协议中的HMVEC龙治疗与TNFα[100毫微克/毫升（PeproTech公司，新泽西州）3小时，因为这是一个很好的描述激活ECS ^21。注:建议您的时间让您的活化HMVEC细胞（步骤4.1）和钙黄绿素AM实验标记的嗜中性粒细胞（步骤3.5），同时准备使用。我们需要约2.5小时到隔离和标签neutroph的ILS。

2。使用Polymorphprep的中性粒细胞隔离

1. 隔离如前所述^22，中性粒细胞，或用一个现成的密度梯度溶液从全血中分离中性粒细胞。用人Polymorphprep协议由Nuzzi 等人 2007年业绩的收益率约为2-3×10 ⁶中性粒细胞每毫升全血^23。注:为了避免过多的红细胞裂解，葡聚糖沉淀去除红血细胞之前，可以进行密度梯度离心^24。
2. 带来Polymorphprep密度梯度溶液RT。
3. 收集30毫升的全血中的存在下，从健康人志愿者的抗凝血剂如肝素，柠檬酸盐或乙二胺四乙酸。的血应该在2个小时之内使用，并保持在18-22℃。
4. 层5毫升的全血在5毫升15毫升锥形管中的密度梯度溶液（图2A）。避免改变血液体积和密度梯度溶液，因为这可能会改变后续的离心条件。
5. 离心450×g离心30分钟，在18-22℃。确保慢慢加快离心机（ 即关闭离心机制动），以及平衡管，以防止振动，以帮助减少嗜中性粒细胞的激活，并防止层的混合。停止离心时间或更高的离心力将导致在较低的白细胞层，其中包含嗜中性粒细胞，，进一步迁移下来，对颗粒的红血细胞。
6. 吸出血浆和上部含白细胞频带的外周血单个核细胞层含有嗜中性粒细胞（ 图2B），以防止污染。
7. 使用1-2毫升血清吸管，删除含有嗜中性粒细胞的白细胞较低层。结合嗜中性粒细胞层成30毫升的PBS（不含Ca ^{2 +}和Mg ^{2 +）}在50毫升锥形管。
8. 使体积至50ml，用PBS（不含Ca ^{2 +}和Mg ^{2 +），}以450×g离心10分钟，在18-22℃。

注:2.9和2.10步是可选的，但强烈推荐。

9. 吸出上清液。中性粒细胞在8毫升无菌水重悬，持续30秒，以裂解红血细胞，立即加入2ml的5倍的PBS（不含Ca ^{2 +}和Mg ^{2 +），}用手轻轻混匀。 请勿培养细胞中的细胞悬液，以水时间超过30秒，因为显着的中性粒细胞可发生死亡。
10. 在250 XG离心5分钟，在18-22°C。
11. 液洗涤细胞一次，用10毫升的PBS（不含Ca ^{2 +}和Mg ^{2 +）}和在250×g离心5分钟，在18-22℃下
12. 重悬在10ml的RPMI-1640（不含酚红）的嗜中性粒细胞，并使用台盼蓝计数活细胞染色排除法。大于5×10 ⁶个每毫升的细胞密度，避免长时间，因为这可能会导致嗜中性粒细胞的激活。

3。中性粒细胞贴标钙黄绿素AM

1. 6×10 ⁵个中性粒细胞的48孔板每孔使用。
2. 计数后，转移到50毫升锥形管，将重新悬浮的细胞和嗜中性粒细胞稀释至2-4×10 ⁶细胞每毫升用无酚红的RPMI-1640。
3. 添加钙黄绿素AM到3微米（ 即 2.98微升钙黄绿素AM股票（1毫克/毫升），每毫升媒体）原液，轻弹管拌匀。大于5μM钙黄绿素AM将导致泄漏由嗜中性粒细胞。 注意:非荧光钙黄绿素AM被裂解的细胞内的内源性酯酶产生高荧光分子的钙黄绿素（ 即死亡的细胞，因此无法荧光）。
4. 用铝箔和孵化FO量管R 30分钟，在37℃下在黑暗中。 注:较长的孵育时间可能导致更多的钙黄绿素从嗜中性粒细胞的粘附实验的过程中解放出来。
5. 在450×g离心5分钟，在18-22℃下离心，洗涤用10毫升的RPMI-1640（不含酚红;预温至37℃）的嗜中性粒细胞2倍。第二次洗涤后，重悬细胞，首先通过嗜中性粒细胞，但40微米的无菌过滤器，以去除团块，然后一次以450×g离心5分钟，在18-22℃。
6. 重悬中性粒细胞在RPMI 1640（不含酚红;预热至37℃）在2×10 ⁶嗜中性粒细胞每毫升。

4。中性粒细胞结合分析

1. 洗净HMVEC单分子膜，用含3％BSA以每孔0.5ml的过滤灭菌（0.22微米）的RPMI 1640（不含酚红）的3倍。
2. 吸媒体，并添加6×10 ⁵钙黄绿素标记的嗜中性粒细胞（0.3 ml的细胞悬液），或0.3毫升的RPMI 1640（不含酚红）无中性粒细胞，在合适的孔48孔板注意:这是一个相当于8×10 ⁵个每1cm ²的中性粒细胞。
3. 孵育20分钟，在37℃，5％CO ₂培养箱_中 。
4. 共有中性粒细胞的荧光（PRE洗涤）:测量各孔的荧光强度为485 nm的激发波长和发射波长为520nm（荧光集）滤波器在FLUOstar或等效，分光光度计。只执行该步骤之前，的孵化终点。 注意:在这个协议中，所发出的光的钙黄绿素的激发和检测进行从露天井的顶部，但是，两者也可以从孔的底部进行。
5. 洗净的孔中HMVEC单层和的5倍的嗜中性粒细胞用0.5毫升每孔的PBS（瓦特/的Ca ^{2 +}和Mg ^{2 +）。}卸下介质和清洗由反相板，并轻轻拍打到纸巾上，除去残留的液体。
6. 添加0.3毫升的RPMI 1640（不含酚红）每口井。
7. 贴壁的中性粒细胞的荧光（柱洗）:在步骤4.4中，测量各孔的荧光强度。
8. 确定的百分比的坚持和相对坚持每口井:

注意:在这个阶段，可以通过以下方式获得的钙黄绿素标记的嗜中性粒细胞的图像，通过使用荧光显微镜能够配备标准的荧光过滤器。 图4中的图像上得到了奥林巴斯IX51倒置显微镜配备一个的Retiga 2000R相机（Q成像）使用Q-捕捉PRO7软件（Q成像）。

结果

为了获得可靠的，可再现的结果，使用中性粒细胞的结合测定，它是必不可少的健康和微血管内皮细胞的汇合天的测定是最优的HMVEC隆在图1中，如图所示。此外，它必须用于低通道数微血管内皮细胞（ 即小于9代），因此，我们建议所有的实验进行两周内解冻。嗜中性粒细胞的健康也是非常重要的，特别是因为钙黄绿素AM将不被代谢，如果细胞以某种方式由荧光钙黄绿素分子。?...

讨论

对于一个成功的嗜中性粒细胞/微血管内皮细胞粘附试验的最重要的步骤是:1）使用低传代次数（<9），健康的内皮细胞; 2）维护分离出的嗜中性粒细胞的低密度（ 即 <5×10 ⁶个细胞钙黄绿素AM标记的嗜中性粒细胞/毫升），并利用他们的隔离在两小时内，3）苛养洗涤，并使用钙黄绿素AM标记的嗜中性粒细胞中及时，以尽量减少EC从嗜中性粒细胞的钙黄绿素的污染和损失。分别。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
HMVEC-Lung	Lonza	CC-2527
EGM-2 MV	Lonza	CC-3202
HBSS	Life Technologies	14175-095	Can be substituted with any vendor
48-well Tissue Culture Plates	BD Falcon	353078
PBS (without phenol red)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL001	Can be substituted with any vendor
D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL003	Can be substituted with any vendor
RPMI-1640 (without phenol red)	Life Technologies	11835-030
Polymorphprep	Axis-Shield	1114683
calcein AM	Life Technologies	C3099	(0.995 mM) stock soln
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154
40 μM filters	VWR	21008-949	Can be substituted with any vendor
FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer	BMG LABTECH	-