Cuantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas

Resumen

Adherencia de los neutrófilos al endotelio activado en los sitios de infección es un componente integral de la respuesta inflamatoria del huésped. Se describe en el presente informe es un ensayo de unión de neutrófilos, que permite la In vitro Cuantificación de neutrófilos humana primaria unión a las células endoteliales activadas por los mediadores inflamatorios en condiciones estáticas.

Resumen

El endotelio vascular juega un papel integral en la respuesta inflamatoria. Durante la fase aguda de la inflamación, las células endoteliales (EC) se activan por los mediadores de acogida o directamente por componentes microbianos conservados peligro o moléculas derivadas del huésped. ECs activados expresan citocinas, quimiocinas y moléculas de adhesión que movilizan, activan y retienen los leucocitos en el sitio de la infección o lesión. Los neutrófilos son las primeras en llegar leucocitos, y se adhieren al endotelio a través de una variedad de moléculas de adhesión presentes en las superficies de ambas células. Las principales funciones de los neutrófilos son para eliminar directamente las amenazas microbianas, promover el reclutamiento de otros leucocitos a través de la liberación de factores adicionales, e iniciar la reparación de la herida. Por lo tanto, su reclutamiento y el apego al endotelio es un paso crítico en la iniciación de la respuesta inflamatoria. En este reporte se describe un ensayo in vitro de la adhesión de neutrófilos mediantecalceína AM marcada con neutrófilos humanos primarios para cuantificar el grado de activación de las células endoteliales microvasculares en condiciones estáticas. Este método tiene la ventaja adicional de que las mismas muestras se cuantificaron por espectrofotometría de fluorescencia también se pueden visualizar directamente mediante microscopía de fluorescencia para una evaluación más cualitativa de la unión de neutrófilos.

Introducción

Dado que el endotelio vascular está en contacto directo con la sangre circulante, que tiene una ubicación única para iniciar una respuesta inflamatoria rápida durante la infección o lesión. Las células endoteliales (EC) receptores de reconocimiento de patrones expresas que reconocen una variedad de componentes bacterianos conservados y las moléculas de peligro, y los receptores para sistemas principales mediadores de la inflamación tales como TNFa. La activación de estos receptores induce ECs para secretar citoquinas (por ejemplo, IL-6, IL-8, CXCL1 y CCL2), y para upregulate moléculas de adhesión (por ejemplo, E / P-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) en su superficie celular ^{1 , 2.} Estas moléculas de todo facilitar la localización de los leucocitos a los sitios de infección y la lesión con el fin de despejar el campo de los agentes infecciosos e iniciar la reparación del tejido ^3,4. La respuesta de los neutrófilos a la infección implica una interacción bien coordinada entre el endotelio vascular y la respuesta los neutrófilos. Tras la activación CE, IL-8 se secreta y forma un gradiente intravascular en el endotelio que permite a los neutrófilos a la casa en el sitio de la infección o lesión ^5,6. E / P-selectinas median la captura de neutrófilos y rodando a través de asociaciones relativamente débiles con glycomolecules en la superficie celular de neutrófilos. Estas interacciones, junto con la IL-8 la unión a sus receptores afines, facilitan la robusta, unión mediada por la integrina y la eventual detención de los neutrófilos sobre la superficie de la célula endotelial ^7-10. Después de la detención, los neutrófilos pueden migrar fuera de la vasculatura a los sitios específicos de infección para eliminar directamente los patógenos, generar trampas extracelulares de neutrófilos para prevenir la propagación de los agentes patógenos, promover la cicatrización de heridas y liberar factores adicionales que reclutan otros leucocitos tales como monocitos, macrófagos y dendríticas ^11-17 células.

Se describe en el presente informe es un método in vitro para cuantificar la adhesión de neutrófilos a microVascular ECs después de la activación por el mediador inflamatorio TNF anfitrión. Este ensayo está diseñado para evaluar la activación de EC, y no los neutrófilos. Los neutrófilos humanos primarios son primero aislados utilizando separación por gradiente de densidad, y luego se marcan con calceína acetoximetilo (AM). Esterasas dentro de las células en vivo hidrolizan calceína AM a la molécula calceına altamente fluorescente con una excitación de 492-495 nm y de emisión de 513-516 nm ^18. Los neutrófilos marcados con fluorescencia se incuban a continuación con monocapas CE, y los neutrófilos no adherentes se eliminan posteriormente. La fluorescencia de las restantes, neutrófilos enlazados a continuación, se mide utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia, y se calcula como un porcentaje del total de entrada de la fluorescencia de neutrófilos por pocillo. Este método tiene la ventaja adicional de que los neutrófilos calceína-marcado unido utilizados en espectrofotometría se pueden visualizar directamente mediante microscopía de fluorescencia para dar una más cualitativa lectura de CE de corriente alternavación. Puesto que este ensayo se lleva a cabo bajo condiciones estáticas, únicamente los eventos muy iniciales que se producen en la cascada de adhesión de neutrófilos serán evaluados. Esto se confirma en el informe utilizando anticuerpos bloqueantes E-selectina para mostrar que la adhesión de neutrófilos al pulmón humano TNF-tratada microvascular CE (HMVEC-pulmón) monocapas se reduce drásticamente cuando se interrumpe la interacción con E-selectina.

Además de TNFa, hemos utilizado con éxito este ensayo para determinar la extensión de la vena activación CE umbilical humana (HUVEC) por el receptor de tipo Toll medio agonistas lipoproteína asociada a peptidoglicano (PAL), mureína lipoproteína (MLP) y Pam3Cys y activación HMVEC-Pulmón por Pam3Cys ^19,20. Además, hemos utilizado con éxito este ensayo con inhibidores de la quinasa y después de RNAi mediada desmontables de superficie y proteínas citoplasmáticas en HMVEC-pulmón, lo que sugiere que esta metodología es compatible con una variedad de bioquímica y screeninensayos de ²⁰ g. En resumen, este ensayo proporciona una fácil de usar, forma reproducible, más funcional para acceder a la medida de la activación de CE por mediadores inflamatorios in vitro.

Protocolo

1. Revestimiento y mantenimiento de las células endoteliales microvasculares

1. Descongele y hacer crecer las células endoteliales microvasculares de acuerdo a los fabricantes suministran instrucciones. En este protocolo, las células fueron cultivadas en medio EGM-2 MV (Lonza), y se recomienda que todos los experimentos se llevan a cabo dentro de dos semanas de descongelación para minimizar cualquier variación debida al número de pases. Nuestros experimentos con HMVEC-pulmón se llevan a cabo entre los pasos 4 a 9.
2. Día 1: Cuando las células alcanzan 80-90% de confluencia, trypsinize y resuspender en 120.000 células por ml. Placa de 36.000 células (0,3 ml) por pocillo en 48 pocillos, placa de cultivo tisular de poliestireno (s). Incluir pozos de HMVEC que no se incubaron con neutrófilos con el fin de obtener una lectura de fluorescencia de fondo. A menos que el uso de placas de 48 pocillos diseñadas específicamente para ensayos de fluorescencia, filas o columnas alternas será minimizar cualquier contaminación lumínica de los pozos vecinos. NOTA: Los pozos pueden ser pre-recubiertas con poli-Lysine, colágeno o fibronectina.
3. Día 2: Agregar medio fresco.
4. Día 3: Por microscopía de contraste de fase, confirman las células están sanos (es decir, la apariencia "adoquines" y poco restos de células), y son 100% confluentes (Figura 1). Si las células no son 100% confluentes, cambiar los medios de comunicación todos los días hasta que estén listos.
5. Una vez que las monocapas HMVEC están listos para el tratamiento, lavar las células una vez con solución salina equilibrada de Hank (HBSS) y añadir 0,3 ml de EGM-2 MV medios frescos o medios que contienen agonista inflamatoria a los pocillos apropiados. En este protocolo la HMVEC-pulmón fueron tratados con TNF [100 ng / ml] (PeproTech, Nueva Jersey) durante 3 horas ya que este es un activador bien descrito de ECs ^21. NOTA: Se recomienda que el tiempo de su experimento para que sus células HMVEC activados (Paso 4.1) y calceína AM neutrófilos marcados (Paso 3.5) están listos para su uso al mismo tiempo. Nos lleva aproximadamente 2,5 horas para aislar y etiquetar neutrophils.

2. Aislamiento de neutrófilos mediante Polymorphprep

1. Aislar los neutrófilos como se ha descrito previamente ^22, o con una solución de gradiente de densidad confeccionada para aislar los granulocitos polimorfonucleares de la sangre entera. El empleo de Polymorphprep siguiendo el protocolo por Nuzzi et.al. 2007 resultados de los rendimientos de aproximadamente 2-3 x 10 ⁶ neutrófilos por ml de sangre entera ^23. NOTA: Para evitar la lisis de los eritrocitos excesiva, una sedimentación de dextrano para eliminar las células rojas de la sangre puede llevar a cabo antes de la centrifugación en gradiente de densidad ^24.
2. Poner la solución en gradiente de densidad Polymorphprep a RT.
3. Recoger 30 ml de sangre completa de un voluntario humano sano en presencia de un anticoagulante tal como heparina, citrato o EDTA. La sangre se debe utilizar dentro de 2 horas, y se mantiene entre los 18-22 ° C.
4. Capa 5 ml de sangre entera sobre 5 ml de la solución de gradiente de densidad en un tubo cónico de 15 ml (Figura 2A). Evite alterar volúmenes de sangre y la solución de gradiente de densidad, ya que podría cambiar las condiciones de centrifugación posteriores.
5. Centrifugar a 450 xg durante 30 min a 18-22 ° C. Asegúrese de que para acelerar lentamente arriba y abajo de la centrífuga (es decir, desactivar el freno de centrífuga), y el equilibrio de los tubos así para evitar vibraciones para ayudar a reducir la activación de los neutrófilos y evitar la mezcla de las capas. Tiempos de centrifugación más largos o más alta fuerza centrífuga se traducirá en la capa de leucocitos inferior, que contiene los neutrófilos, a migrar más abajo hacia a las células rojas de la sangre sedimentadas.
6. Aspirar el plasma y la banda de leucocitos superior que contiene las PBMC para evitar la contaminación de la capa que contiene los neutrófilos (Figura 2B).
7. Con una pipeta serológica 1-2 ml para eliminar la capa inferior que contiene los leucocitos neutrófilos. Se combinan las capas de neutrófilos en 30 ml de PBS (sin Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +)} en un 50 mltubo cónico.
8. Llevar el volumen hasta 50 ml con PBS (sin Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +)} y se centrifuga a 450 g durante 10 min a 18-22 ° C.

Nota: Los pasos 2.9 y 2.10 son opcionales, pero altamente recomendable.

9. Aspirar el sobrenadante. Resuspender los neutrófilos en 8 ml de agua estéril durante 30 segundos para lisar las células rojas de la sangre, añadir inmediatamente la suspensión de células a 2 ml de 5x PBS (sin Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +)} y mezclar suavemente con la mano. No incubar las células en agua durante más de 30 segundos desde la muerte de neutrófilos significativa puede ocurrir.
10. Centrifugar a 250 xg durante 5 min a 18-22 ° C.
11. Se lavan las células una vez con 10 ml de PBS (sin Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +)} y centrifuga de nuevo a 250 xg durante 5 min a 18-22 ° C.
12. Resuspender los neutrófilos en 10 ml de medio RPMI-1640 (sin rojo fenol) y contar las células vivas utilizando el azul de tripanoteñir método de exclusión. Evitar períodos prolongados de densidades celulares superiores a 5 x 10 ⁶ por ml ya que esto puede resultar en la activación de los neutrófilos.

3. Neutrófilos Etiquetado con calceína AM

1. 6 x 10 ⁵ neutrófilos se utilizan por pocillo de una placa de 48 pocillos.
2. Después de contar, transferir las células resuspendidas a un tubo cónico de 50 ml y diluir los neutrófilos a 2-4 x 10 ⁶ células por ml con rojo fenol libre de RPMI-1640.
3. Añadir calceína AM solución madre de 3 m (es decir 2,98 l de calceína AM stock (1 mg / ml) por ml de medio) y mezclar bien accionando suavemente el tubo. Mayor que 5 mM calceína AM dará lugar a fugas de los neutrófilos Nota:. No fluorescente calceína AM se escinde dentro de las células por las esterasas endógenas para producir la molécula altamente fluorescente calceína (es decir, las células muertas no fluorescencia).
4. Cubra el tubo con papel de aluminio e incubar for 30 min a 37 ° C en la oscuridad Nota:. tiempos de incubación más largos puede resultar en más calceína ser liberado de los neutrófilos en el transcurso del ensayo de adhesión.
5. Centrifugar a 450 xg durante 5 min a 18-22 ° C, y lavar los neutrófilos 2x con 10 ml de medio RPMI-1640 (sin rojo de fenol; pre-calentado a 37 ° C). Después de resuspender las células para el segundo lavado, primero pasar a los neutrófilos a través de un filtro estéril 40 mM para eliminar grumos y, a continuación centrifugar una vez más a 450 xg durante 5 min a 18-22 ° C.
6. Resuspender los neutrófilos en medio RPMI 1640 (sin rojo de fenol; pre-calentado a 37 ° C) a 2 x 10 ⁶ neutrófilos por ml.

4. Ensayo de unión de neutrófilos

1. Se lavan las monocapas HMVEC 3x con 0,5 ml de esterilizada por filtración (0,22 micras) RPMI 1640 (sin rojo fenol) que contiene 3% de BSA por pocillo.
2. Aspirar los medios de comunicación y añadir 6 x 10 ⁵ neutrófilos marcados con calceína-(0,3 ml de suspensión de células), O 0,3 ml de medio RPMI 1640 (sin rojo fenol) sin neutrófilos, a los pocillos apropiados de la placa de 48 pocillos Nota:. Este es el equivalente de 8 x 10 ⁵ neutrófilos por cm ^2.
3. Incubar durante 20 min en un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora.
4. Total de neutrófilos fluorescencia (PRE lavado): Mide la intensidad de fluorescencia de cada pocillo con una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm (filtro establecido fluoresceína) en una FLUOstar, o equivalente, espectrofotómetro. Realice este paso justo antes del punto final de incubación Nota: En este protocolo, calceína de excitación y detección de la luz emitida se realizaron a partir de la parte superior de los pozos no cubierto, sin embargo, ambos también se puede realizar desde el fondo de los pocillos..
5. Lave los pocillos que contienen monocapas HMVEC y neutrófilos 5x con 0,5 ml por pocillo de PBS (w / Ca ^{2 +} y Mg ^{2 +).} Retire el papel y lavadosinvirtiendo la placa, y palmaditas suavemente sobre toallas de papel para eliminar el líquido restante.
6. Añadir nuevo 0,3 ml de RPMI 1640 (sin rojo fenol) por pocillo.
7. Adherente de neutrófilos fluorescencia (POST lavado): Medir la intensidad de fluorescencia de cada pocillo como en el paso 4.4.
8. Determinar el porcentaje de cumplimiento y la adherencia relativa por así:

Nota: En esta etapa, las imágenes de los neutrófilos marcados con calceína se puede conseguir mediante el uso de un microscopio capaz de fluorescencia equipado con filtros de fluoresceína estándar. Las imágenes en la Figura 4 se obtuvieron en una Olympus IX51 microscopio invertido equipado con una cámara 2000R Retiga (Q Imaging) utilizando Q-Capture Pro7 software (Q Imaging).

Resultados

Con el fin de obtener resultados fiables, reproducibles utilizando un ensayo de unión de neutrófilos, es esencial que la salud y la confluencia de las células endoteliales microvasculares son óptimas en el día del ensayo, como se ilustra con HMVEC-pulmón en la Figura 1. Además, es imperativo que el número de pase bajo microvascular AE se utiliza (es decir, menos de 9 pasajes), y, en consecuencia, se recomienda llevar a cabo todos los experimentos en las dos semanas siguientes a la desco...

Discusión

Los pasos más importantes para el éxito de neutrófilos / ensayo de adhesión celular endotelial microvascular son los siguientes: 1) El uso del número de paso bajo (<9), células endoteliales sanas, 2) El mantenimiento de los neutrófilos aislados con una densidad baja (es decir, células <5 x 10 ⁶ / ml) y el uso de ellos en las dos horas de aislamiento, y 3) el lavado Fastidious de los neutrófilos calceína AM-etiquetados y el uso de los neutrófilos calceína AM-etiquetados de manera opo...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
HMVEC-Lung	Lonza	CC-2527
EGM-2 MV	Lonza	CC-3202
HBSS	Life Technologies	14175-095	Can be substituted with any vendor
48-well Tissue Culture Plates	BD Falcon	353078
PBS (without phenol red)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL001	Can be substituted with any vendor
D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL003	Can be substituted with any vendor
RPMI-1640 (without phenol red)	Life Technologies	11835-030
Polymorphprep	Axis-Shield	1114683
calcein AM	Life Technologies	C3099	(0.995 mM) stock soln
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154
40 μM filters	VWR	21008-949	Can be substituted with any vendor
FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer	BMG LABTECH	-