Quantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas

Resumo

A aderência de neutrófilos ao endotélio activado em locais de infecção é um componente integral da resposta inflamatória do hospedeiro. Descritos neste relatório é um ensaio de ligação de neutrófilos, que permite a In vitro Quantificação de neutrófilo humano primário de ligação às células endoteliais activadas por mediadores inflamatórios, sob condições estáticas.

Resumo

O endotélio vascular desempenha um papel fundamental na resposta inflamatória. Durante a fase aguda da inflamação, as células endoteliais (ECs) são activados por mediadores hospedeiras ou directamente por componentes microbianos conservados ou moléculas derivadas do hospedeiro de perigo. Activo CEs citocinas, quimiocinas e express de moléculas de adesão que mobilizam, activar e manter leucócitos no local da lesão ou infecção. Os neutrófilos são os primeiros a chegar leucócitos, e aderem ao endotélio através de uma variedade de moléculas de adesão presentes na superfície de ambas as células. As principais funções dos neutrófilos são para eliminar directamente as ameaças microbianas, promover o recrutamento de outros leucócitos através da liberação de fatores adicionais, e iniciar o reparo de feridas. Portanto, o recrutamento e fixação ao endotélio vascular é um passo crítico na iniciação da resposta inflamatória. Neste relatório, nós descrevemos um ensaio de adesão in vitro de neutrófilos utilizandocalceína AM marcada com neutrófilos humanos primários para quantificar a extensão da activação da célula endotelial microvascular sob condições estáticas. Este método tem a vantagem adicional de que as mesmas amostras quantificada por espectrometria de fluorescência também pode ser visualizada directamente através de microscopia de fluorescência para uma avaliação mais qualitativa da ligação de neutrófilos.

Introdução

Desde o endotélio vascular está em contato direto com o sangue circulante, que tem uma localização única para iniciar uma resposta inflamatória rápida durante a infecção ou lesão. As células endoteliais (ECs) de receptores de reconhecimento de padrões express que reconhecem uma variedade de componentes bacterianos conservadas e as moléculas de perigo, e receptores de mediadores inflamatórios hospedeiras, tais como o TNFa. A activação destes receptores induz a ECs para secretar citocinas (por exemplo, IL-6, IL-8, CXCL1 e CCL2), e para sobrerregular moléculas de adesão (por exemplo, E / P-selectina, VCAM-1 e ICAM-1) na sua superfície celular ^{uma , 2.} Estas moléculas de todos facilitar a localização de leucócitos aos locais de infecção e lesão a fim de limpar o exército dos agentes infecciosos e iniciar a reparação tecidual ^3,4. A resposta de neutrófilos para a infecção envolve uma interação bem coordenada entre o endotélio vascular ea resposta neutrófilos. Após a ativação CE, IL-8 é segregada e que forma um gradiente intravascular sobre o endotélio, que permite que a casa de neutrófilos para o local da infecção ou lesão ^5,6. E / P-selectinas mediata captura de neutrófilos e de rolamento através de associações relativamente fracos com glycomolecules na superfície celular de neutrófilos. Estas interacções, juntamente com a ligação de IL-8 aos seus receptores cognatos, facilitar a robusta ligação integrina-mediada e eventual detenção dos neutrófilos sobre a superfície de células endoteliais ^7-10. Depois da prisão, os neutrófilos podem migrar para fora da vasculatura para os locais específicos de infecção para eliminar os patógenos directamente, gerar armadilhas extracelulares de neutrófilos para prevenir a disseminação de agentes patogénicos, e promover a cicatrização de feridas libertam factores adicionais que recrutam leucócitos, tais como monócitos, macrófagos e dendríticas células ^11-17.

Descritos neste relatório é um método in vitro para quantificar a adesão de neutrófilos para microVascular CEs após a ativação por parte do anfitrião mediador inflamatório TNF. Este ensaio foi concebido para avaliar a ativação de células endoteliais, e não neutrófilos. Neutrófilos humanos primários são primeiro isolados utilizando separação em gradiente de densidade, e depois são marcados com calceína acetoximetilo (AM). Esterases de células vivas no interior da hidrólise calceína AM de calceína a molécula altamente fluorescente com uma excitação de 492-495 nm e emissão de 513-516 nm, ^18. Os neutrófilos marcados com fluorescência são então incubadas com monocamadas de EC, e os neutrófilos não aderentes são subsequentemente removidos. A fluorescência das restantes, neutrófilos ligados é então medido usando um espectrofotómetro de fluorescência, e calculada como uma percentagem de neutrófilos de entrada fluorescência total por poço. Este método tem a vantagem adicional de que os neutrófilos ligados marcados com calceína utilizados em espectrofotometria pode ser directamente visualizada utilizando microscopia de fluorescência para dar uma leitura mais qualitativa de ac CEvação. Uma vez que este ensaio é realizado em condições estáticas, apenas os eventos muito iniciais que ocorrem na cascata de adesão dos neutrófilos serão avaliados. Isto é confirmado no presente relatório usando anticorpos bloqueadores de E-selectina para mostrar que a adesão de neutrófilos a TNFa humano tratado com pulmão microvascular CE (HMVEC-pulmão) monocamadas é drasticamente reduzida quando a interacção com a E-selectina é interrompido.

Além de TNFa, temos utilizado com sucesso este ensaio para determinar a extensão da activação CE veia umbilical humana (HUVEC) pelo receptor Toll-like 1/2 agonistas lipoproteína associada a peptidoglicano (PAL), mureína lipoproteína (MLP) e e Pam3Cys ativação HMVEC-Lung por Pam3Cys ^19,20. Além disso, foram utilizados com êxito este ensaio com os inibidores da quinase e depois knockdown RNAi mediada de superfície e proteínas citoplasmáticas em HMVEC-pulmonar, sugerindo que esta metodologia é compatível com uma variedade de bioquímica e screening ensaios ^20. Em resumo, este ensaio proporciona um fácil de usar, forma reprodutível, mais funcional para aceder ao grau de activação CE por mediadores inflamatórios in vitro.

Protocolo

1. Chapeamento e manutenção das células endoteliais microvasculares

1. Descongelar e crescer suas células endoteliais microvasculares acordo com os fabricantes fornecido instruções. Neste protocolo, as células foram cultivadas em EGM-2 media MV (Lonza), e recomenda-se que todas as experiências são realizadas no prazo de duas semanas de descongelamento para minimizar qualquer variação devido ao número de passagens. As experiências são realizadas com HMVEC-pulmonar entre as passagens 4-9.
2. Dia 1: Quando as células atingem 80-90% de confluência, trypsinize e ressuspender em 120 mil células por ml. Placa de 36.000 células (0,3 ml) por poço em 48 poços, placas de cultura de tecidos de poliestireno (es). Incluir poços de HMVEC que não serão incubadas com os neutrófilos a fim de obter uma leitura de fluorescência de fundo. A menos que usando placas de 48 poços projetados especificamente para ensaios de fluorescência, linhas alternadas ou colunas irá minimizar qualquer contaminação luz de poços vizinhos. NOTA: Wells pode ser pré-revestida com poli-Lysine, colagénio ou fibronectina.
3. Dia 2: Adicionar novas mídias.
4. Dia 3: A microscopia de contraste de fase, confirmar que as células são saudável (isto é, a aparência "Cobblestone" e pouco detritos de células), e eles são 100% confluentes (Figura 1). Se as células não são 100% confluentes, mudar os meios de comunicação a cada dia até que estejam prontos.
5. Uma vez que as monocamadas HMVEC está pronto para o tratamento, lave as células uma vez com solução salina equilibrada de Hank (HBSS) e adicionar 0,3 ml de meio EGM-2 MV frescas ou meios contendo agonista inflamatória aos poços apropriados. Neste protocolo HMVEC-pulmão foram tratadas com TNFa [100 ng / ml] (PeproTech, Nova Jersey), durante 3 horas uma vez que este é um activador bem descrito de ECs ^21. NOTA: Recomenda-se que o tempo a sua experiência para que suas células HMVEC ativadas (Passo 4.1) e Calcein AM neutrófilos marcados (Passo 3.5) está pronto para usar ao mesmo tempo. Ela nos leva aproximadamente 2,5 horas para isolar e rotular neutrophils.

2. Isolamento de neutrófilos utilizando Polymorphprep

1. Isolar neutrófilos, como descrito anteriormente ^22, ou com uma solução de gradiente de densidade pronta para isolar granulócitos polimorfonucleares de sangue total. Empregando Polymorphprep seguindo o protocolo de Nuzzi, et ai. 2,007 resulta em rendimentos de cerca de 2-3 x 10 neutrófilos por ^seis ml de sangue total ^23. NOTA: Para evitar a lise dos eritrócitos e excessivo, uma sedimentação de dextrano para remover os glóbulos vermelhos podem ser efectuadas antes da centrifugação em gradiente de densidade ^24.
2. Levar a solução do gradiente de densidade Polymorphprep à TA.
3. Recolha de 30 ml de sangue total de um voluntário humano saudável, na presença de um anti-coagulante, como a heparina, citrato ou EDTA. O sangue deve ser usado dentro de 2 horas, e mantida entre 18-22 ° C.
4. Camada 5 ml de sangue total ao longo de 5 ml da solução de gradiente de densidade num tubo cónico de 15 ml ( Figura 2A). Evite alterar volumes de sangue ea solução gradiente de densidade, pois isso pode alterar as condições de centrifugação subseqüentes.
5. Centrifugar a 450 g durante 30 min a 18-22 ° C. Certifique-se de acelerar lentamente para cima e para baixo da centrífuga (ou seja, desligar o freio centrífuga), e equilibrar os tubos bem para evitar vibrações para ajudar a reduzir a ativação dos neutrófilos e evitar a mistura de camadas. Tempos de centrifugação mais longos ou força centrífuga maior irá resultar na camada inferior de leucócitos, que contém os neutrófilos, que migram mais para baixo em direcção às células vermelhas do sangue peletizadas.
6. Aspirar o plasma e leucócitos banda superior contendo PBMC para evitar a contaminação da camada contendo neutrófilos (Figura 2B).
7. Usar uma pipeta serológica 1-2 ml para eliminar a camada inferior contendo leucócitos neutrófilos. Combinar as camadas de neutrófilos em 30 ml de PBS (sem Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +),} de 50 mltubo cónico.
8. Levar o volume até 50 ml com PBS (sem Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +),} e centrifugar a 450 xg durante 10 min a 18-22 ° C.

Nota: Os passos 2.9 e 2.10 são opcionais, mas altamente recomendado.

9. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender as neutrófilos em 8 ml de água estéril durante 30 segundos para lisar os glóbulos vermelhos, imediatamente adicionar a suspensão de células de 2 ml de 5x em PBS (sem Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +),} e misturar suavemente à mão. NÃO incubar células água por mais de 30 segundos desde a morte de neutrófilos significativa pode ocorrer.
10. Centrifugar a 250 xg durante 5 min a 18-22 ° C.
11. Lave as células uma vez com 10 ml de PBS (sem Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +)} e centrifugar novamente a 250 xg durante 5 min a 18-22 ° C.
12. Ressuspender as neutrófilos em 10 ml de meio RPMI-1640 (sem vermelho de fenol), e contar as células vivas utilizando o azul de tripanométodo de exclusão de corante e. Evitar períodos prolongados de densidades celulares superiores a 5 x 10 ⁶ por ml uma vez que este pode resultar na activação dos neutrófilos.

3. Neutrófilos Labeling com Calcein AM

1. 6 x 10 ⁵ neutrófilos são utilizados por poço de uma placa de 48 poços.
2. Após a contagem, a transferência das células ressuspensas para um tubo de 50 ml e dilui-cónica os neutrófilos a 2-4 x 10 ⁶ culas por ml com vermelho fenol livre de RPMI-1640.
3. Adicionar solução de calceína AM de 3 uM (ou seja, 2,98 ul de calceína AM Estoque (1 mg / ml) por ml de meio) e misture bem sacudindo suavemente o tubo. Superior a 5 microns de calceína AM resultará no vazamento dos neutrófilos Nota:. Não-fluorescente calceína AM é clivada no interior das células por esterases endógenas para produzir a molécula altamente fluorescente calceína (isto é, as células mortas não ficam fluorescentes).
4. Tapar o tubo com folha de alumínio e incubar fou 30 min a 37 ° C no escuro Nota:. tempos de incubação mais longo pode resultar em mais calceína ser libertado a partir dos neutrófilos ao longo do ensaio de adesão.
5. Centrifugar a 450 xg durante 5 min a 18-22 ° C, e lavar os neutrófilos 2x com 10 ml de RPMI-1640 (sem vermelho de fenol; pré-aquecido a 37 ° C). Após a ressuspensão das células para a segunda lavagem, passar primeiro os neutrófilos com um filtro estéril de 40 uM para remover aglomerados, e depois centrifugar mais uma vez a 450 xg durante 5 min a 18-22 ° C.
6. Ressuspender as neutrófilos em meio RPMI 1640 (sem vermelho de fenol; pré-aquecido a 37 ° C) a 2 x 10 ⁶ por ml neutrófilos.

4. Ensaio de ligação de neutrófilos

1. Lavar as monocamadas HMVEC 3x com 0,5 ml de filtro esterilizado (0,22 um) meio RPMI 1640 (sem vermelho de fenol), contendo 3% de BSA por poço.
2. Aspirar a mídia e adicione 6 x 10 ⁵ neutrófilos calceína-rotulados (0,3 ml de células suspension), ou 0,3 ml de meio RPMI 1640 (sem vermelho de fenol) sem neutrófilos, aos poços apropriados da placa de 48 poços Nota:. Isto é o equivalente de 8 x 10 ⁵ por cm ² de neutrófilos.
3. Incubar durante 20 min no banho a 37 ° C, 5% CO ₂ incubadora.
4. Fluorescência de neutrófilos totais (pré-lavagem) a medição da intensidade de fluorescência de cada poço com um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 520 nm (conjunto de filtros de fluoresceína) num Fluostar, ou equivalente, com um espectrofotómetro. Executar esta etapa pouco antes do ponto final de incubação Nota: Neste protocolo, calceína excitação e a detecção da luz emitida foram realizadas a partir do topo dos poços a descoberto, no entanto, ambos também pode ser realizada a partir do fundo dos poços..
5. Lavar os poços contendo monocamadas HMVEC e neutrófilos 5x com 0,5 ml por poço de PBS (w / Ca ^{2 +} e Mg ^{2 +).} Remova a mídia e lavagensinvertendo a placa e batendo suavemente sobre toalhas de papel para retirar o líquido restante.
6. Adicionar 0,3 ml de volta de RPMI 1640 (sem vermelho de fenol) por poço.
7. Aderente a fluorescência de Neutrófilos (lavagem POST): medir a intensidade de fluorescência de cada poço como na etapa 4.4.
8. Determinar a aderência e a adesão relativa cento por poço:

Nota: Nesta fase, as imagens dos neutrófilos marcados com calceína podem ser obtidas usando um microscópio de fluorescência equipado com capazes filtros de fluoresceína padrão. As imagens na Figura 4 foram obtidas em um microscópio invertido Olympus IX51 equipado com uma câmera 2000R Retiga (Q Imaging) utilizando Q-Captura software Pro7 (Q Imaging).

Resultados

A fim de obter resultados fiáveis ​​e reprodutíveis usando um ensaio de ligação de neutrófilos, é essencial que a saúde e a confluência das células endoteliais microvasculares são óptimas no dia do ensaio, como se ilustra com HMVEC-pulmão na Figura 1. Além disso, é imperativo que o número baixo passagem microvascular ECs são utilizados (ou seja, menos de 9 passagens) e, consequentemente, recomendamos realizar todos os experimentos dentro de duas semanas de descongelamento. A...

Discussão

Os passos mais críticos para uma bem-sucedida de neutrófilos / ensaio de adesão da célula endotelial microvascular são: 1) O uso do baixo número passagem (<9), células endoteliais saudáveis; 2) Manter os neutrófilos isolados com uma densidade baixa (ou seja, <5 x 10 ⁶ células / ml) e usá-los dentro de duas horas de isolamento, e 3) lavagem Fastidious dos neutrófilos calceína AM-rotulados e uso dos neutrófilos calceína AM-rotulados em tempo hábil para minimizar a contaminação C...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
HMVEC-Lung	Lonza	CC-2527
EGM-2 MV	Lonza	CC-3202
HBSS	Life Technologies	14175-095	Can be substituted with any vendor
48-well Tissue Culture Plates	BD Falcon	353078
PBS (without phenol red)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL001	Can be substituted with any vendor
D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL003	Can be substituted with any vendor
RPMI-1640 (without phenol red)	Life Technologies	11835-030
Polymorphprep	Axis-Shield	1114683
calcein AM	Life Technologies	C3099	(0.995 mM) stock soln
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154
40 μM filters	VWR	21008-949	Can be substituted with any vendor
FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer	BMG LABTECH	-