Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

Zusammenfassung

Neutrophile Einhaltung der aktivierten Endothel an den Standorten der Infektion ist ein integraler Bestandteil des Gastgebers Entzündungsreaktion. Beschrieben in diesem Bericht ist ein neutrophilen Bindungs-Assay, die für das erlaubt In vitro Quantifizierung von primären humanen Neutrophilen-Bindung an Endothelzellen durch Entzündungsmediatoren unter statischen Bedingungen aktiviert.

Zusammenfassung

Die vaskuläre Endothel spielt eine wesentliche Rolle bei der entzündlichen Reaktion. In der akuten Phase der Entzündung werden Endothelzellen (ECs) von Host-Vermittler oder direkt durch konservierte mikrobielle Komponenten oder Host-derived Gefahr Moleküle aktiviert. Activated ECs express Zytokine, Chemokine und Adhäsionsmoleküle, mobilisieren, aktivieren und behalten Leukozyten an den Ort der Infektion oder Verletzung. Neutrophile sind die ersten Leukozyten, um anzukommen, und sich an das Endothel durch eine Vielzahl von Adhäsionsmolekülen auf den Oberflächen der beiden Zellen. Die wichtigsten Funktionen von Neutrophilen sind direkt beseitigen mikrobiellen Bedrohungen, die Förderung der Rekrutierung von anderen Leukozyten durch die Freisetzung von zusätzlichen Faktoren, und initiieren Wundheilung. Daher ist die Einstellung und Befestigung des Endothels ein kritischer Schritt in der Einleitung der entzündlichen Reaktion. In diesem Bericht beschreiben wir eine in-vitro-Assay mit neutrophilen AdhäsionCalcein primären humanen Neutrophilen AM-markierten, um das Ausmaß der mikrovaskulären endothelialen Zell-Aktivierung unter statischen Bedingungen zu quantifizieren. Dieses Verfahren hat den zusätzlichen Vorteil, dass die gleichen Proben mittels Fluoreszenz-Spektrophotometrie quantifiziert auch direkt visualisiert werden mittels Fluoreszenzmikroskopie für eine qualitative Bewertung der Neutrophilen-Bindung.

Einleitung

Da das vaskuläre Endothel ist in direktem Kontakt mit dem zirkulierenden Blut wird in ausgezeichneter Lage, eine schnelle Entzündungsreaktion während der Infektion oder Verletzung zu initiieren. Endothelzellen (ECs) express pattern recognition receptors, die eine Vielzahl von konservierten bakteriellen Komponenten und Gefahr Moleküle erkennen und Rezeptoren für Host Entzündungsmediatoren wie TNFa. Die Aktivierung dieser Rezeptoren führt ECs, Zytokine (z. B. IL-6, IL-8, CXCL1 und CCL2) sezernieren, und Adhäsionsmoleküle (zB E / P-Selectin, VCAM-1 und ICAM-1) in ihrer Zelloberfläche ¹ hochreguliert ^{, 2.} Diese Moleküle alle erleichtern die Lokalisierung von Leukozyten an Stellen der Infektion und Verletzungen, um das Heer der Infektionserreger zu löschen und die Reparatur von Gewebe ^3,4 initiieren. Neutrophilen Die Reaktion auf eine Infektion beinhaltet eine gut koordinierte Zusammenspiel zwischen dem vaskulären Endothel und dem antwortenden Neutrophilen. Nach Aktivierung EG, IL-8 abgesondert und bildet einen intravaskulären Gradienten auf das Endothel, die Neutrophilen erlaubt, nach Hause, um den Ort der Infektion oder Verletzung ^5,6. E / P-Selektine vermitteln Neutrophilen-Abscheidung und-rollen durch relativ schwache Assoziationen mit glycomolecules auf der neutrophilen Zelloberfläche. Diese Wechselwirkungen, zusammen mit IL-8-Bindung an seinen verwandten Rezeptoren, erleichtern die robust, Integrin-vermittelte Bindung und eventuellen Verhaftung von Neutrophilen am Endothel Zelloberfläche ^7-10. Nach Verhaftung kann Neutrophile wandern aus dem Gefäßsystem zu den Austragungsorten der Infektion direkt eliminieren Krankheitserreger erzeugen Neutrophilen extrazellulären Fallen, um die Verbreitung von Krankheitserregern zu verhindern, die Wundheilung fördern und lassen weitere Faktoren, die andere Leukozyten wie Monozyten, Makrophagen und dendritischen rekrutieren Zellen ^11-17.

Beschrieben in diesem Bericht ist ein in vitro-Methode, um die Einhaltung der neutrophilen MicroV quantifizierenascular ECs nach Aktivierung durch den Host Entzündungsmediatoren TNF. Dieser Test wurde entwickelt, um die Aktivierung von Endothelzellen und nicht für Neutrophile zu bewerten. Primäre humane Neutrophile sind zunächst getrennt mit Dichtegradiententrennung, und werden dann mit Calcein acetoxymethyl (AM) markiert. Esterasen innerhalb der lebenden Zellen hydrolysieren Calcein AM zu stark fluoreszierenden Calcein Molekül mit einer Anregung von 492-495 nm und die Emission von 513-516 nm ^18. Die Fluoreszenz-markierten Neutrophilen werden dann mit EC Monoschichten inkubiert und nicht-adhärente Neutrophile werden anschließend entfernt. Die Fluoreszenz der verbleibenden gebundenen Neutrophilen wird dann unter Verwendung eines Fluoreszenz-Spektralphotometer, berechnet und als Prozentsatz der gesamten Neutrophilen Fluoreszenz Eingang pro Vertiefung. Dieses Verfahren hat den zusätzlichen Vorteil, dass die gebundenen Calcein-markierten Neutrophilen in Spektrofotometrie direkt verwendet werden kann, visualisiert mittels Fluoreszenzmikroskopie, um eine qualitative aus EG ac lesen gebenMotivation. Da dieser Test unter statischen Bedingungen durchgeführt wird, werden nur die ersten Ereignisse, die sehr in der neutrophilen Adhäsionskaskade auftreten beurteilt werden. Dies wird in diesem Bericht mit E-Selektin blockierende Antikörper gegen diese Neutrophilen Einhaltung TNF-behandelten menschlichen Lunge mikrovaskulären EC (HMVEC-Lung) Monoschichten wird drastisch reduziert, wenn die Interaktion mit E-Selektin gestört zeigen bestätigt.

Neben TNF, haben wir erfolgreich diesen Test verwendet werden, um das Ausmaß der menschlichen Nabelschnur-EC (HUVEC) Aktivierung durch den Toll-like-Rezeptor-1/2-Agonisten peptidoglycan Lipoprotein-assoziierte (PAL), Murein-Lipoprotein (MLP) und Pam3Cys und bestimmen HMVEC-Lung Aktivierung durch Pam3Cys ^19,20. Darüber hinaus haben wir erfolgreich verwendet diesen Test mit Kinase-Inhibitoren und nach RNAi-vermittelter Knockdown von Oberfläche und zytoplasmatische Proteine ​​in HMVEC-Lung, was darauf hindeutet, dass diese Methode kompatibel mit einer Vielzahl von biochemischen und ist screening Assays ^20. Zusammenfassend stellt dieser Test ein leicht, reproduzierbar, funktioneller Weise zu verwenden, um das Ausmaß der EG-Aktivierung durch Entzündungsmediatoren in vitro zu übersetzen.

Protokoll

1. Plating und Wartung von mikrovaskulären Endothelzellen

1. Auftauen und das Wachstum Ihres mikrovaskulären Endothelzellen nach den Herstellern mitgelieferten Anleitung. In diesem Protokoll wurden die Zellen in EGM-2 MV Medien (Lonza) gewachsen, und es wird empfohlen, dass alle Versuche innerhalb von zwei Wochen nach dem Auftauen eine Variation aufgrund Durchgang Nummer minimieren durchgeführt werden. Unsere Experimente mit HMVEC-Lung zwischen Passagen 4 bis 9 durchgeführt.
2. Tag 1: Wenn die Zellen 80-90% Konfluenz erreichen, trypsinize und resuspendieren bei 120.000 Zellen pro ml. Teller 36.000 Zellen (0,3 ml) pro Well in 48-Well-, Polystyrol Gewebekulturplatte (n). Fügen Vertiefungen HMVEC die nicht mit Neutrophilen inkubiert werden, um eine Ablesung zu erhalten Hintergrundfluoreszenz. Es sei denn, bei der 48-Well-Platten speziell für Fluoreszenz-Assays, alternierenden Reihen oder Spalten entworfen wird minimieren Licht Kontamination von benachbarten Brunnen. HINWEIS: Wells kann vorher mit Poly-Lysine, Kollagen oder Fibronektin.
3. Tag 2: In frischem Medium.
4. 3. Tag: Nach Phasenkontrast-Mikroskopie, bestätigen die Zellen gesund sind (dh "Kopfsteinpflaster" Aussehen und wenig Zelltrümmer), und sie sind zu 100% konfluent (Abbildung 1). Wenn die Zellen nicht zu 100% konfluent, verändern die Medien jeden Tag, bis sie bereit sind.
5. Sobald die HMVEC Monoschichten bereit für die Behandlung sind, waschen Sie die Zellen einmal mit ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) und fügen Sie 0,3 ml frisches EGM-2 MV Medien oder Medien, die entzündliche Agonisten in die entsprechenden Vertiefungen. In diesem Protokoll die HMVEC-Lung wurden mit TNF behandelt [100 ng / ml] (PeproTech, New Jersey) für 3 Stunden, da dies eine gut beschriebene Aktivator des ECs ^21. HINWEIS: Es wird empfohlen, dass Sie Zeit Ihres Experiments, so dass Ihre aktivierten HMVEC Zellen (Schritt 4.1) und Calcein markierten Neutrophilen (Schritt 3.5) Uhr bereit sind, in der gleichen Zeit zu verwenden. Es führt uns ca. 2,5 Stunden zu isolieren und zu beschriften neutrophils.

2. Neutrophile Isolation mit Polymorphprep

1. Isolieren Neutrophilen, wie zuvor beschrieben ^22, oder mit einem ready-made Dichtegradientenlösung zu polymorphkernigen Granulozyten aus Vollblut zu isolieren. Der Einsatz Polymorphprep nach dem Protokoll von Nuzzi ea 2007 Ergebnisse in Ausbeuten von ca. 2-3 x 10 ⁶ Neutrophile pro ml Vollblut ^23. Hinweis: Um eine übermäßige Erythrozyten-Lyse, ein Dextran Sedimentation zu vermeiden, um rote Blutkörperchen zu entfernen, kann vor Dichtegradientenzentrifugation ²⁴ durchgeführt werden.
2. Bringen Sie die Polymorphprep Dichtegradientenlösung auf RT.
3. Sammeln 30 ml Vollblut eines gesunden menschlichen Freiwilligen in Gegenwart eines Antikoagulans wie Heparin, Citrat oder EDTA. Das Blut sollte innerhalb von 2 Stunden verwendet werden, und hielt zwischen 18-22 ° C.
4. Schicht 5 ml Vollblut in 5 ml der Dichtegradient-Lösung in einem 15 ml konischen Röhrchen (Abbildung 2A). Vermeiden Änderung Volumina von Blut und die Dichtegradientenlösung da dies die anschließende Zentrifugation Bedingungen ändern kann.
5. Zentrifugation bei 450 × g für 30 min bei 18-22 ° C. Vergewissern Sie sich, langsam zu beschleunigen und auf der Zentrifuge (dh schalten Sie die Zentrifuge Bremse), und das Gleichgewicht der Rohre gut um Vibrationen zu vermeiden zu helfen, reduzieren die Aktivierung der Neutrophilen und verhindern, dass die Vermischung der Schichten. Längere Zentrifugationszeiten oder höher Zentrifugalkraft wird in der unteren Schicht Leukozyten, die neutrophilen Granulozyten enthält führen, um weiter nach unten wandern in Richtung zu den pelletierten roten Blutkörperchen.
6. Absaugen des Plasmas und oberen Leukozyten enthaltende Bande PBMCs die Kontamination der Schicht, die Neutrophilen (2B) zu verhindern.
7. Verwenden Sie einen 1-2 ml serologische Pipette, um die untere Schicht, die Neutrophile Leukozyten zu entfernen. Kombinieren der Neutrophilen-Schichten in 30 ml PBS (ohne Ca ^{2 +} und Mg ^{2 +)} in einem 50 mlkonischen Rohr.
8. Bringen Sie die Lautstärke von bis zu 50 ml mit PBS (ohne Ca ^{2 +} und Mg ^{2 +)} und Zentrifuge bei 450 g für 10 min bei 18-22 ° C.

Hinweis: Die Schritte 2.9 und 2.10 sind optional, aber sehr zu empfehlen.

9. Saugen Sie den Überstand. Resuspendieren der Neutrophilen in 8 ml sterilem Wasser für 30 Sekunden, um rote Blutkörperchen zu lysieren, sofort fügen Sie die Zellsuspension in 2 ml 5x PBS (ohne Ca ^{2 +} und Mg ^{2 +)} und vorsichtig von Hand mischen. NICHT inkubieren Zellen in Wasser für mehr als 30 Sekunden da erhebliche Neutrophilen Tod auftreten können.
10. Zentrifugation bei 250 × g für 5 min bei 18-22 ° C.
11. Die Zellen werden einmal mit 10 ml PBS (ohne Ca ^{2 +} und Mg ^{2 +)} und erneut zentrifugiert bei 250 × g für 5 min bei 18-22 ° C.
12. Resuspendieren der Neutrophilen in 10 ml RPMI-1640 (ohne Phenolrot) und zählen die lebenden Zellen unter Verwendung des TrypanblauFärbeausschlussverfahren Verfahren. Vermeiden längere Zelldichten größer als 5 x 10 ⁶ pro ml, da dies zu einer Aktivierung der Neutrophilen führen kann.

3. Neutrophile Labeling mit Calcein AM

1. 6 x 10 ⁵ Neutrophilen pro Vertiefung einer 48-Well-Platte verwendet.
2. Nach dem Zählen, übertragen Sie die resuspendierten Zellen in eine 50 ml konischen Röhrchen und verdünnen die Neutrophilen auf 2-4 x 10 ⁶ Zellen pro ml mit Phenolrot-freiem RPMI-1640.
3. In Calcein AM Stammlösung bis 3 um (dh 2,98 ul Calcein AM stock (1 mg / ml) pro ml Medium) und gut mischen durch leichtes schnippen die Röhre. Mehr als 5 um Calcein AM wird in Leck aus den Neutrophilen führen. Hinweis: Non-fluoreszierendem Calcein AM wird innerhalb der Zellen durch endogene Esterasen gespalten, um das stark fluoreszierende Molekül Calcein (dh tote Zellen nicht fluoreszieren) zu produzieren.
4. Decken Sie die Röhrchen mit Alufolie und Inkubation for 30 min bei 37 ° C im Dunkeln. Hinweis: Längere Inkubationszeiten in mehr Calcein führen freigesetzt aus den Neutrophilen im Laufe der Adhäsionsassay.
5. Zentrifugation bei 450 × g für 5 min bei 18-22 ° C und wäscht die Neutrophilen 2x mit 10 ml RPMI-1640 (ohne Phenolrot, vorgewärmt auf 37 ° C). Nach Resuspendieren der Zellen für die zweite waschen, zuerst über die Neutrophilen obwohl eine 40 uM Sterilfilter Klumpen zu entfernen und dann zentrifugiert erneut bei 450 xg für 5 min bei 18-22 ° C.
6. Resuspendieren der Neutrophilen in RPMI 1640 (ohne Phenolrot, vorgewärmt auf 37 ° C) mit 2 x 10 ⁶ pro ml Neutrophilen.

4. Neutrophile Binding Assay

1. Waschen Sie die HMVEC Monoschichten 3x mit 0,5 ml steril filtriert (0,22 um) RPMI 1640 (ohne Phenolrot) mit 3% BSA pro Well.
2. Saugen Sie die Medien, und fügen Sie 6 x 10 ⁵ Calcein-markierten Neutrophilen (0,3 ml Zellsuspension) Oder 0,3 ml RPMI 1640 (ohne Phenolrot) ohne Neutrophilen, in die entsprechenden Vertiefungen der 48-Well-Platte. Hinweis: Dies ist das Äquivalent von 8 x 10 ⁵ Neutrophilen pro cm ^2.
3. Inkubation für 20 min bei 37 ° C, 5% CO _2-Inkubator.
4. Insgesamt Neutrophile Fluoreszenz (Vorwäsche): Messen Sie die Fluoreszenzintensität jeder Vertiefung mit einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 520 nm (Fluoresceinfilter set) in einem FLUOstar, oder gleichwertig, Spektralphotometer. Diesen Schritt unmittelbar vor der Inkubation Endpunkt Anmerkung: In diesem Protokoll Calcein Anregung und Detektion des emittierten Lichts wurden von der Oberseite der nicht abgedeckten Vertiefungen durchgeführt, aber beide können auch aus dem Boden der Vertiefungen vorgenommen werden..
5. Waschen der Vertiefungen mit HMVEC Monoschichten und Neutrophilen 5x mit 0,5 ml pro Vertiefung von PBS (w / Ca ^{2 +} und Mg ^{2 +).} Entfernen Sie die Medien und Waschungendurch Umdrehen der Platte, und klopfte sanft auf Küchenpapier entfernen Sie die restliche Flüssigkeit.
6. In wieder 0,3 ml RPMI 1640 (ohne Phenolrot) pro Vertiefung.
7. Adherent Neutrophile Fluoreszenz (POST wash): Messen Sie die Fluoreszenzintensität jedes gut wie in Schritt 4.4.
8. Bestimmen Sie die Einhaltung Prozent und relative Einhaltung pro Well:

Hinweis: In diesem Stadium, Bilder der Calcein-markierten Neutrophilen kann unter Verwendung eines Fluoreszenz-Mikroskop mit Standard-fähig Fluorescein Filtern ausgestattet, erhalten werden. Die Bilder in Abbildung 4 wurden an einem Olympus IX51 inversen Mikroskop mit einer Kamera Retiga 2000R (Q Imaging) mit Q-Capture-Software Pro7 (Q Imaging) ausgestattet erhalten.

Ergebnisse

Um eine zuverlässige, reproduzierbare Ergebnisse mit einem Neutrophilen Bindungs-Assay erhalten, ist es wichtig, dass die Gesundheit und das Konfluenz der mikrovaskulären Endothelzellen optimal am Tag des Tests sind, wie bei HMVEC-Lung in Abbildung 1 dargestellt. Darüber hinaus ist es unerlässlich, dass niedrige Durchgang Nummer mikrovaskulären ECs verwendet werden (dh weniger als 9 Stellen), und entsprechend, empfehlen wir die Durchführung aller Experimente innerhalb von zwei Wochen nach...

Diskussion

Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Neutrophilen / Mikrogefäßendothelzellen Zelladhäsionsassay sind: 1) der niedrigen Passage-Nummer (<9), gesunde Endothelzellen Verwenden; 2) Pflege der isolierten Neutrophilen bei einer geringen Dichte (dh <5 x 10 ⁶ Zellen / ml) und mit ihnen innerhalb von zwei Stunden der Isolation, und 3) Fastidious Waschen der Calcein AM-markierten Neutrophilen und die Nutzung der Calcein AM-markierten Neutrophilen rechtzeitig EG Verschmutzung und Verlust von...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
HMVEC-Lung	Lonza	CC-2527
EGM-2 MV	Lonza	CC-3202
HBSS	Life Technologies	14175-095	Can be substituted with any vendor
48-well Tissue Culture Plates	BD Falcon	353078
PBS (without phenol red)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL001	Can be substituted with any vendor
D-PBS (without Ca2+ and Mg2+ and phenol red)	UCSF Cell Culture Facility	CCFAL003	Can be substituted with any vendor
RPMI-1640 (without phenol red)	Life Technologies	11835-030
Polymorphprep	Axis-Shield	1114683
calcein AM	Life Technologies	C3099	(0.995 mM) stock soln
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154
40 μM filters	VWR	21008-949	Can be substituted with any vendor
FLUOstar OPTIMA Spectrophotometer	BMG LABTECH	-