طريقة سريعة وفعالة لتقييم الإمراض في أوستيلاغو مايديس على خطوط الذرة والتيوسينت

Summary

يوصف استخدام طريقة حقن الإبر لتطعيم الذرة ونباتات التيوسينت مع مسببات الأمراض النيروبية الحيوية أوستيلاغو مايديس. تسهل طريقة تلقيح حقن الإبر التسليم المراقب لمسببات الأمراض الفطرية بين أوراق النبات حيث يدخل الممرض النبات من خلال تشكيل الأبريسوريا. هذه الطريقة هي فعالة للغاية، وتمكين التلقيح القابلة للاستنساخ مع U. maydis.

Abstract

الذرة هي محصول الحبوب الرئيسية في جميع أنحاء العالم. ومع ذلك، فإن التعرض لمسببات الأمراض الضوئية هو العائق الرئيسي أمام زيادة الإنتاجية. U. maydis هو مسببات الأمراض الفطرية التروفية الحيوية والعامل السببي لبذاءة الذرة على الذرة. هذا المرض هو المسؤول عن خسائر كبيرة في الغلة من حوالي 1.0 مليار دولار سنويا في الولايات المتحدة¹ العديد من الطرق بما في ذلك تناوب المحاصيل، وتطبيق مبيد الفطريات وعلاجات البذور تستخدم حاليا للسيطرة على الذرة smut². ومع ذلك ، فإن مقاومة المضيف هي الطريقة العملية الوحيدة لإدارة بذيء الذرة. وقد أدى تحديد النباتات المحصولية بما في ذلك الذرة والقمح والأرز المقاومة لمختلف مسببات الأمراض الحيوية إلى انخفاض كبير في خسائر الغلة سنويا^{بنسبة 3-5.} ولذلك، فإن استخدام طريقة التطعيم الممرض الذي يسلم بكفاءة واستنساخ الممرض بين أوراق النبات، من شأنه أن يسهل التحديد السريع لخطوط الذرة التي تقاوم ال MAYDIS U. كما, تم استخدام خطوة أولى نحو المسافة البادئة خطوط الذرة التي تقاوم مايديس U., طريقة حقن إبرة التلقيح وطريقة فحص رد فعل المقاومة لتطعيم الذرة, teosinte, والذرة x خطوط الاستبطان teosinte مع سلالة مايوديس U. واختيار النباتات المقاومة.

الذرة، التيوسينتي والذرة x خطوط الاستبطان التيوسينتي، التي تتكون من حوالي 700 نبات، زرعت، تلقيح مع سلالة من المايديس U.، وفحصها للمقاومة. طرق التلقيح والفحص حددت بنجاح ثلاثة خطوط teosinte مقاومة لU. maydis. هنا يتم تقديم حقن إبرة مفصلة بروتوكول فحص رد فعل المقاومة والذرة، التيوسينتي، والذرة x خطوط الاستبطان teosinte. توضح هذه الدراسة أن تلقيح حقن الإبر هو أداة لا تقدر بثمن في الزراعة التي يمكن أن توفر بكفاءة U. maydis بين أوراق النبات وقدمت خطوط نباتية مقاومة لل maydis U. التي يمكن دمجها واختبارها الآن في برامج التربية لتحسين مقاومة الأمراض.

Introduction

الأمراض الفطرية للنباتات تمثل واحدة من أبرز التهديدات للزراعة. وتتزايد الحاجة إلى تطوير محاصيل ذات مقاومة محسنة للأمراض بسبب الاحتياجات الغذائية لسكان العالم المتزايدين. مسببات الأمراض النباتية تصيب بشكل طبيعي النباتات الزراعية في الميدان مما تسبب في الأمراض التي تؤثر سلبا على غلة المحاصيل^6. وقد ثبت أن تحديد واستخدام النباتات المقاومة يمكن أن يحسن المقاومة ويقلل من فقدان الغلة. وقد تم تحديد أصناف مقاومة في العديد من الأنواع النباتية بما في ذلك الذرة والقمح والأرز والذرة الرفيعة عن طريق تلقيح النباتات بمسببات الأمراض النباتية واختيار خطوط مقاومة⁷. ولذلك، فإن تطوير واستخدام طريقة تطعيم فعالة من شأنه أن يسمح بتطعيم العديد من النباتات وفحصها بحثا عن المقاومة. وقد استخدمت أساليب التلقيح المختلفة بما في ذلك انخفاض التطعيم، pipetting ثقافة تعليق الخلية الممرضة في دوامة النبات، والتلقيح حقن إبرة^8-11. مع كل طريقة ، يجب إدخال الممرض بشكل موثوق بين أوراق النبات حيث يدخل الممرض النبات من خلال تشكيل appresoria لضمان تطور مسببات الأمراض والعدوى النباتية^12،13.

تتضمن طريقة تلقيح الانخفاض غمر شتلة نباتية في ثقافة تعليق الخلايا المسببة للأمراض ، في حين أن طريقة الأنابيب تتطلب وضع ثقافة تعليق الخلية المسببة للأمراض في دوامة شتلة النبات. ومع ذلك، هناك مشاكل مع كلا الأسلوبين. أولا ، تعتمد كلتا الطريقتين على الحركة الطبيعية للمسبب الممرض من سطح الورق إلى الأنسجة النباتية التي هي متغيرة للغاية. معظم مسببات الأمراض تدخل بشكل طبيعي النبات من خلال فتحات الفم أو الجروح على سطح ورقة النبات. ومع ذلك ، هناك تباين كبير في قدرة مسببات الأمراض على اختراق سطح ورقة النبات من خلال stomata و / أو الجروح على سطح الورقة. لذلك، لا يمكن التحكم في اختراق مسببات الأمراض مع أي من طريقتي التطعيم التي يحتمل أن تؤدي إلى بيانات غير متسقة. ثانيا، عند فحص عدد كبير من النباتات، يمكن أن يكون غمر الشتلات في ثقافة تعليق الخلايا المسببة للأمراض مضيعة للوقت وقد يحد من عدد النباتات التي يمكن فحصها. على العكس من ذلك ، فإن بروتوكول حقن الإبر الموصوفة هنا يسلم ثقافة تعليق الخلية المسببة للأمراض بين أوراق النبات التي تسهل تشكيل appressoria¹⁴. ثم يستخدم العامل الممرض appressoria المطورة حديثا لدخول المصنع القضاء على مسألة اختراق مسببات الأمراض. بالإضافة إلى ذلك، يوفر بروتوكول تلقيح حقن الإبر مجموعة من الأنماط الظاهرية لنباتات الذرة والتيوسينت التي تم تلقيحها مع المايديس U. وإظهار عدوى جيدة. يمكن استخدام الأنماط الظاهرية كعلامة لتحديد أفضل تركيز لثقافة تعليق الخلايا المسببة للأمراض مما يؤدي إلى أنماط ظاهرة نباتية متسقة داخل التجارب المختلفة وفيما بينها.

بعد تلقيح النبات مع ثقافة تعليق الخلايا المسببة للأمراض ، يتم فحص النباتات عادة للكشف عن النمط الظاهري المقاوم أو المعرض^{للإصابة 8-11،15}. في حين أن مقاييس تصنيف الأمراض قد استخدمت على نطاق واسع لفحص وتصنيف الأنماط الظاهرية النباتية، تختلف مقاييس التصنيف اعتمادا على العامل الممرض الذي يتم تحليله. لذلك ، يمكن استخدام إنشاء بروتوكول مقياس تصنيف المرض لتفاعلات المايديس والذرة في الكائنات الفطرية المماثلة^16.

السلسلة الحالية من البروتوكولات تفاصيل حقن الإبرة التطعيم مع U. maydis تعليق الخلية الثقافة ومقاومة المرض فحص رد فعل الذرة، التيوسينتي، والذرة x خطوط الاستبطان teosinte. ولا تقتصر البروتوكولات الحالية على تلقيح حقن الإبر من المايديس U. في نباتات الذرة ولكن يمكن استخدامها لأي مسببات أمراض فطرية نسبيا والأنواع النباتية. ولذلك، فإن إدراج تفاصيل كلا الأسلوبين في البروتوكول نفسه سيمكن الباحثين من الاستفادة المباشرة من البروتوكولات للتلقيح والفحص أو التلاعب بالبروتوكولات الأصلية لتناسب بشكل أفضل الأنواع الممرضة والنباتية ذات الاهتمام.

Protocol

1. نمو المواد النباتية

1. حدد خطوط النبات للتلقيح والفحص. وقد استخدم في هذا العمل خطان للذرة وخمسة خطوط تيوسينتي وأربعين خطا من خطوط الذرة x التيوسينتية ذات المقاومة غير المنقرة ل U. maydis (الجدول 1).
2. بذور النبات للتجارب(U. maydis الحقن) والسيطرة (حقن المياه) حقن إبرة التجارب. القيام بذلك لكل خط النبات.
3. زرع أربعة بذور (replicates) لكل خط النبات في شقق صغيرة عن طريق دفع البذور حوالي 1/2 بوصة في التربة مع الاصبع وتغطي مع التربة طفيفة (الشكلان 1A و 1B). لا تحزم التربة فوق البذور. زرع البذور أعمق أو التعبئة التربة على البذور قد يسبب مشاكل مع ظهور الشتلات.
4. المياه البذور في التربة. تأكد من أن التربة غارقة والبذور تبقى تحت التربة بعد سقي.
5. بعد الري، ضع النباتات في غرفة النمو مع بيئات نهارية وليل من درجة حرارة 28/20 درجة مئوية و14/10 ساعة من الفوتوبيريود، على التوالي وحوالي 500 ميكرومول/م²   ثانية إشعاعات نشطة ضوئيا في الجزء العلوي من المظلة. الحفاظ على الرطوبة النسبية خلال النهار والليل في حوالي 70٪ و 90٪، على التوالي.
6. الحفاظ على جميع النباتات في غرفة النمو نفسها للحفاظ على بيئة النمو التي هي متطابقة عبر التجربة.
7. بعد 10 أيام، وإزالة النباتات من غرفة النمو وتطعيم النباتات مع ثقافة تعليق الخلية U. maydis باستخدام طريقة حقن إبرة التطعيم. ملاحظة: يمكن تلقيح نباتات الذرة بعد 7 أيام من^{الزراعة 8-10.} ومع ذلك ، فإن النباتات التيوسينت صغيرة جدا بعد 7 أيام. ولذلك، تلقيح كل من الذرة والنباتات التيوسينتي بعد 10 أيام من الزراعة من أجل الاتساق داخل التجربة (انظر الخطوة 2-12).

2. حقن الإبرة تلقيح

1. القيام بكل عمل في غطاء محرك السيارة تدفق صفح. إزالة مخزونات الجلسرين U. maydis من تخزين الفريزر. استخدام حلقة معقمة ومخزونات الجليسيرول المتتالية من سلالات U. maydis البرية من النوع 1/2 (نوع التزاوج a1b1) و 2/9 (نوع التزاوج a2b2، بالقرب من متساوي المنشأ إلى 1/2) على لوحات البطاطا dextrose أجار (المساعد الشخصي الرقمي). الحفاظ على سلالات بشكل منفصل.
2. ضع لوحات المساعد الشخصي الرقمي مع maydis U. في حاضنة 30 درجة مئوية لمدة يومين. إذا كان استخدام مسببات الأمراض الكائنات الحية مختلفة استخدام سلالة المناسبة، وسائل الإعلام وظروف النمو. رصد نمو الممرض على مدى فترة يومين لضمان أن سلالة مايديس U. ينمو بشكل جيد.
3. إزالة لوحات المساعد الشخصي الرقمي من الحاضنة بعد يومين. يجب أن يكون للوحات نمو ممرض جيد وتحتوي على مستعمرات واحدة (الشكل 2A). من المهم الحصول على مستعمرات واحدة. إذا كانت المستعمرات واحدة ليست موجودة rereak لوحات في تركيز أقل.
4. القيام بكل العمل في غطاء محرك السيارة تدفق صفح. استخدام مسواك معقمة لتحديد مستعمرة واحدة لكل سلالة من لوحات المساعد الشخصي الرقمي. ضع المسواك التي تحتوي على مستعمرة واحدة في مرق ديكستروز بطاطا 3 مل (PDB). ينصح أن يكون 2-3 الثقافات.
5. ضع 3 مل PDB الثقافات في حاضنة 30 درجة مئوية / شاكر لمدة يومين في 200 دورة في الدقيقة. رصد نمو الثقافة على مدى يومين لضمان نمو الثقافة. يجب أن تبدو الثقافة غائمة للغاية.
6. إزالة الثقافات السائلة من الحاضنة / شاكر وقياس التركيز في OD₆₀₀ لضمان أن نمت الخلايا إلى OD من 1.0 (~ 1 × 10⁷ خلايا / مل)¹⁷.
7. جلب الثقافات تعليق الخلية مايديس U. إلى تركيز النهائي من 1 × 10⁶ خلايا / مل، وذلك باستخدام الماء في حجم 30 مل النهائي الثقافة. هذا التركيز يؤدي باستمرار إلى عدوى جيدة من النباتات مع ثقافة تعليق الخلية الممرضة. ¹⁷

ملاحظة: يجب اختبار تركيزات تعليق الخلايا المختلفة عند استخدام سلالات مسببات الأمراض المختلفة لتحديد تأليه الخلية المناسبة اللازمة للتلقيح^18،19. يمكن استخدام التركيز النهائي المعطى لثقافة تعليق الخلية كنقطة انطلاق للترتزاز. وينبغي التحقق من التركيز المناسب لثقافة تعليق الخلية الممرضة من خلال تصور الأنماط الظاهرية النباتية مع عدوى جيدة(الأرقام 3A-E).

8. مزيج كميات متساوية من اثنين من سلالات مايديس U. قبل التطعيم. إذا كان استخدام سلالة واحدة من مسببات الأمراض المضي قدما إلى الخطوة 2.9. إعداد ثقافات تعليق الخلايا الجديدة في U. maydis لكل تجربة تلقيح وتجاهل ثقافات تعليق الخلايا بعد يومين.
9. للتلقيح حقن إبرة التجريبية, ملء حقنة 3 مل مع U. مايديس تعليق الخلية الثقافة عن طريق رسم ثقافة تعليق الخلية في الحقنة.
10. للتلقيح حقن إبرة التحكم، وملء حقنة 3 مل بالماء¹⁷. استخدم نفس الإجراء للتلقيح التجريبي لحقن الإبر.
11. إرفاق إبرة تحت الجلد 0.457 مم × 1.3 سم إلى نهاية كل حقنة 3 مل. حجم الإبرة المحددة سوف يسلم ثقافة تعليق الخلية بين أوراق النبات مع الحد الأدنى من الضرر للأنسجة النباتية.
12. إزالة النباتات التجريبية والسيطرة من غرفة النمو بعد 10 أيام من زرع استعدادا للتلقيح حقن الإبر (الشكل 2B) (انظر الخطوة 1.7).
13. أدخل بعناية إبرة تحت الجلد التي تحتوي على ثقافة تعليق الخلية U. maydis في جذع نبات تجريبي بزاوية 90 درجة فوق خط التربة مباشرة. أدخل الإبرة حتى تكون في منتصف الساق. لا تدفع الإبرة من خلال الجذعية (الشكل 2C).
14. حقن النبات التجريبي مع حوالي 100 ميكرولتر من U. مايديس تعليق الخلية الثقافة^18,19. وهذا سوف تختلف قليلا اعتمادا على ارتفاع الشتلات. سوف تدفع ثقافة تعليق الخلية من خلال الجذعية والانتقال إلى دوامة النبات. وسوف تكون ثقافة تعليق الخلية مرئية في دوامة النبات. استمر في حقن 100 ميكرولتر من ثقافة تعليق الخلية في كل نبات على حدة حتى تصبح الحقنة 3 مل فارغة.
15. بعد الحقن، وإزالة الإبرة بعناية من جذع النبات. إزالة الإبرة من حقنة فارغة الآن 3 مل وملء بالماء. قم بإرفاق الإبرة مرة أخرى بالمحاقنة وادفع الماء عبر الإبرة لإزالة أي نسيج نباتي قد يتم التقاطه في طرف الإبرة.
16. كرر الخطوات 2.9-2.15 لكل مصنع تجريبي. اتبع نفس البروتوكول لمحطات التحكم عن طريق حقن المياه.
17. ضع النباتات التجريبية والتحكمية الملقح مرة أخرى في غرفة النمو. المياه النباتات يوميا عن طريق التبول التربة وليس الأنسجة النباتية.
18. تحقق من النباتات يوميا للكشف عن تطور مسببات الأمراض وتفاعلات مقاومة النبات.

3. المقاومة رد فعل الفرز

1. تسجيل وتسجيل ردود فعل المقاومة لكل نبات 7 و 10 و 14 و 21 يوما بعد التطعيم (نقطة في البوصة) باستخدام مقياس تقييم رد فعل المقاومة من 1 إلى 5. تزداد شدة المرض مع زيادة القيم العددية على مقياس التصنيف(الجدول 2). A 1C (ليف الكلوروسيس), 1A (ليف إنتاج الأنثوسيانين), أو 2 (أوراق صغيرة غال) رد فعل المقاومة يشير إلى المقاومة. A 3 (الجذعية غال)، 4 (غال القاعدية)، أو 5 (موت النبات) رد فعل المقاومة يشير إلى قابلية(الشكلين 3A-E والجدول 2)^18،19.
2. تسجيل كل من النباتات التجريبية والسيطرة وتسجيل تقييمات رد فعل المقاومة.
3. قارن ردود فعل المقاومة للنباتات التجريبية والسيطرة. حدد النباتات التجريبية مع 1C، 1A، أو 2 مقاومة رد فعل التقييم. وتعتبر هذه النباتات لتكون مقاومة لU. maydis^18,19.
4. كرر التجربة بأكملها للتحقق من الأنماط الظاهرية النباتية.

النتائج

يمكن تحديد تلقيح حقن الإبر الناجح من خلال تصور النمط الظاهري للنباتات التي تم تلقيحها ب U. maydis (تجريبي). وكانت غالبية النباتات التجريبية عرضة للعدوى مايوديس U. وأظهرت النباتات المعرضة للإصابة تطور مرض شديد جدا يتضح من تشكيل الجذعية والغال القاعدية مع teliospores السوداء (الشكلين 3D <...

Discussion

في هذه الدراسة كانت طريقة حقن الإبر المستخدمة لتوصيل سلالة من المايديس U. في جذع 700 نبات الذرة والتيوسينت ناجحة. وبالإضافة إلى ذلك، استخدم مقياس منقح لتصنيف مقاومة الأمراض لفحص النباتات والكشف عن تطور مسببات الأمراض. ونتيجة لاستخدام كلتا الطريقتين، تم تحديد خطوط نباتية مقاومة للما?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seed for plants			Collected from original crosses
Growth chamber	Conviron	PGR14 REACH-IN
Planting flats	Hummert International	14-3385-2
Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite)	Hummert International	10-1059-2
Laminar flow hood	Lab Conoco	70875372
Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest			Stocks were grown from original culture
Sterile loop	Fisher Scientific	S17356A
Potato dextrose agar (PDA) plates	Fisher Scientific	R454311
Incubator set to 30 °C	Fisher Scientific	11-690-650F
Sterile toothpicks	Walmart		Purchased from Walmart and sterilized by autoclave
Potato dextrose broth (PDB)	Fisher Scientific	ICN1008617
Incubator-shaker set to 30 °C	New Brunswick	14-278-179
Spectrophotometer	Fisher Scientific	4001000
U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml)			Grown from glycerol stock as described in the methods
3 ml Syringes	Becton Dickinson	309606
.457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles	Kendall Brands	8881250321