Ustilago maydis'in Mısır ve Teosinte Hatlarında Patojenitesini Değerlendirmek İçin Hızlı ve Verimli Bir Yöntem

Özet

Biyotrofik patojen Ustilago maydis ile mısır ve teozinte bitkileri aşılamak için iğne enjeksiyon yönteminin kullanımı açıklanmıştır. İğne enjeksiyonu aşılama yöntemi, mantar patojeninin, patojenin eksrezi oluşumu yoluyla bitkiye girdiği bitki yaprakları arasında kontrollü bir şekilde teslimini kolaylaştırır. Bu yöntem son derece verimlidir, U. maydisile tekrarlanabilir aşılar sağlar.

Özet

Mısır dünya çapında önemli bir tahıl mahsulüdür. Bununla birlikte, biyotrofik patojenlere duyarlılık, verimliliği artırmanın birincil kısıtlamasıdır. U. maydis biyotrofik bir mantar patojenidir ve mısırdaki mısır smutunun nedensel ajanıdır. Bu hastalık, ABD'de yılda yaklaşık 1,0 milyar dolarlık önemli verim kayıplarından sorumludur¹ Şu anda mısır pisliğini kontrol etmek için mahsul rotasyonu, mantar ilacı uygulaması ve tohum tedavileri dahil olmak üzere çeşitli yöntemler^{kullanılmaktadır 2}. Bununla birlikte, konak direnci mısır pisliğini yönetmek için tek pratik yöntemdir. Çeşitli biyotrofik patojenlere dirençli mısır, buğday ve pirinç gibi mahsul bitkilerinin tanımlanması yıllık verim kayıplarını önemli ölçüde azaltmıştır^3-5. Bu nedenle, patojeni bitki yaprakları arasında verimli ve tekrarlanabilir bir şekilde ulaştıran bir patojen aşılama yönteminin kullanılması, U. maydis'edirençli mısır hatlarının hızlı bir şekilde tanımlanmasını kolaylaştıracaktır. U. maydis'e dirençli mısır çizgilerinin girintilenmesine yönelik ilk adım olarak, U. maydis suşu ile mısır, teozinte ve mısır x teosinte içe giriş hatlarını aşılamak ve dirençli bitkileri seçmek için bir iğne enjeksiyonu aşılama yöntemi ve bir direnç reaksiyonu tarama yöntemi kullanılmıştır.

Yaklaşık 700 bitkiden oluşan mısır, teosinte ve mısır x teosinte içe giriş hatları ekildi, U. maydissuşu ile aşılandı ve direnç taraması yapıldı. Aşılama ve tarama yöntemleri, U. maydis'edirençli üç teozinit hattını başarıyla tanımladı. Burada mısır, teozinte ve mısır x teozinte introgression çizgileri için ayrıntılı bir iğne enjeksiyonu aşılama ve direnç reaksiyonu tarama protokolü sunulmuştur. Bu çalışma, iğne enjeksiyonu aşısının tarımda bitki yaprakları arasında U. maydis'i verimli bir şekilde ulaştırabilen paha biçilmez bir araç olduğunu ve artık gelişmiş hastalık direnci için ıslah programlarında birleştirilebilen ve test edilebilen U. maydislere dayanıklı bitki hatları sağladığını göstermektedir.

Giriş

Bitkilerin mantar hastalıkları tarım için en önemli tehditlerden birini temsil eder. Artan dünya nüfusunun gıda ihtiyacı nedeniyle hastalık direnci gelişmiş ürünler geliştirme ihtiyacı artmaktadır. Bitki patojenleri doğal olarak tarladaki mahsul bitkilerini enfekte eder ve mahsul verimini olumsuz etkileyen hastalıklara neden olur⁶. Dirençli bitkilerin belirlenmesi ve kullanılmasının direnci artırabileceği ve verim kaybını azaltabileceği gösterilmiştir. Mısır, buğday, pirinç ve sorgum dahil olmak üzere birçok bitki türünde bitkilerin bir bitki patojeni ile aşılanması ve dirençli çizgilerin seçilmesi ile dirençli kültivatörler tanımlanmıştır^7. Bu nedenle, verimli bir aşılama yönteminin geliştirilmesi ve kullanılması, birçok bitkinin aşılanmasına ve direnç taramasına izin verecektir. Daldırma aşılama, patojen hücre süspansiyon kültürünü bitkinin girdarına pipetleme ve iğne enjeksiyonu aşılama^8-11dahil olmak üzere çeşitli aşılama yöntemleri kullanılmıştır. Her yöntemde, patojen gelişimini ve bitki enfeksiyonunu sağlamak için patojenin ekresoria oluşumu yoluyla bitkiye girdiği bitki yaprakları arasında güvenilir bir şekilde patojen tanıtılmalıdır^12,13.

Daldırma aşılama yöntemi, bir bitki fidesinin patojen hücre süspansiyon kültürüne batırıltırken, pipetleme yöntemi patojen hücre süspansiyon kültürünün bitki fidesinin girdılmasına yerleştirilmesini gerektirir. Ancak, her iki yöntemle ilgili sorunlar vardır. İlk olarak, her iki yöntem de patojenin yaprak yüzeyinden son derece değişken olan bitki dokusuna doğal hareketine bağlıdır. Patojenlerin çoğu doğal olarak bitki yaprağı yüzeyindeki stomatal açıklıklar veya yaralardan bitkiye girer. Bununla birlikte, patojenlerin bitki yaprağı yüzeyine stomata ve/ veya yaprak yüzeyindeki yaralardan nüfuz etme yeteneğinde önemli bir değişkenlik vardır. Bu nedenle, patojen penetrasyonu, potansiyel olarak tutarsız verilerle sonuçlanan aşılama yöntemi ile kontrol edilemez. İkincisi, çok sayıda bitkiyi tadırken, fideleri patojen hücre süspansiyon kültürüne batırılması zaman alabilir ve taranabilecek bitki sayısını sınırlayabilir. Tersine, burada açıklanan iğne enjeksiyonu aşılama protokolü, bitki yaprakları arasında appressoria oluşumunu kolaylaştıran patojen hücre süspansiyon kültürünü sağlar¹⁴. Patojen daha sonra patojen penetrasyon sorununu ortadan kaldırarak bitkiye girmek için yeni geliştirilen appressoriayı kullanır. Ek olarak, iğne enjeksiyonu aşılama protokolü, U. maydis ile aşılanmış ve iyi enfeksiyon gösteren mısır ve teozinit bitkileri için bir dizi fenotip sağlar. Fenotipler, patojen hücre süspansiyon kültürü için en iyi konsantrasyonu belirlemek için bir işaretleyici olarak kullanılabilir ve bu da farklı deneyler içinde ve arasında tutarlı bitki fenotipleri ile sonuçlanır.

Patojen hücre süspansiyon kültürüne sahip bitki aşılamasını takiben, bitkiler tipik olarak dirençli veya hassas bir fenotip^8-11,15tespit etmek için taranır. Hastalık derecelendirme ölçekleri bitki fenotiplerini taramak ve sınıflandırmak için yoğun olarak kullanılırken, derecelendirme ölçekleri analiz edilen patojene bağlı olarak farklılık gösterir. Bu nedenle, benzer mantar patojenleri için U. maydis ve mısır etkileşimleri için bir hastalık derecelendirme ölçeği protokolü kurulması¹⁶.

Mevcut protokoller serisi, U. maydis hücre süspansiyon kültürü ile iğne enjeksiyonu aşısını ve mısır, teozinte ve mısır x teosinte introgression çizgilerinin hastalık direnci reaksiyonu taramasını detaylandırır. Mevcut protokoller U. maydis'in mısır bitkilerine iğne enjeksiyonu aşısı ile sınırlı değildir, ancak nispeten herhangi bir mantar patojeni ve bitki türü için kullanılabilir. Bu nedenle, her iki yöntemin ayrıntılarının aynı protokole dahil edilmesini sağlamak, araştırmacıların aşı ve tarama protokollerini doğrudan kullanmalarını veya orijinal protokolleri ilgi çekici patojen ve bitki türlerine daha iyi uyacak şekilde manipüle etmelerini sağlayacaktır.

Protokol

1. Bitki Materyalinin Büyümesi

1. Aşılama ve eleme için tesis hatlarını seçin. Bu çalışma için U. maydis'e karşı karakteristik olmayan direnci olan iki mısır çizgisi, beş teosinte hattı ve kırk mısır x teosinte hattı kullanılmıştır (Tablo 1).
2. Deneysel(U. maydis enjeksiyonu) ve kontrol (su enjeksiyonu) iğne enjeksiyonu aşı deneyleri için bitki tohumları. Bunu her bitki hattı için yapın.
3. Tohumları parmakla toprağa yaklaşık 1/2 inç iterek ve toprakla hafifçe kaplayarak küçük düzlüklerde her bitki hattı için dört tohum (çoğalır) ekin (Şekil 1A ve 1B). Toprağı tohumun üzerine paketlemeyin. Tohumu daha derine dikmek veya toprağı tohumun üzerine paketlemek fidenin ortaya çıkmasıyla ilgili sorunlara neden olabilir.
4. Tohumları toprağa sulayın. Toprağın ıslatılmasından ve tohumların sulamadan sonra toprağın altında kaldığından emin olun.
5. Sulamadan sonra, bitkileri sırasıyla 28/20 °C sıcaklık ve 14/10 saat fotoperiyod ve gölgeliklerin üst kısmında yaklaşık 500 μmol/ m²   sn fotosetik olarak aktif radyasyon içeren bir büyüme odasına yerleştirin. Gündüz ve gece bağıl nemi sırasıyla yaklaşık% 70 ve% 90'da koruyun.
6. Deney boyunca uyumlu bir büyüme ortamını korumak için tüm bitkileri aynı büyüme odasında tutun.
7. 10 gün sonra, bitkileri büyüme odasından çıkarın ve iğne enjeksiyonu aşılama yöntemi kullanarak bitkileri U. maydis hücre süspansiyon kültürü ile aşılayın. Not: Mısır bitkileri ekimden 7 gün sonra^8-10aşılanabilir. Bununla birlikte, teosinte bitkileri 7 gün sonra çok küçüktür. Bu nedenle, deney içinde tutarlılık için ekimden 10 gün sonra hem mısır hem de teosinte bitkilerini aşılayın (bkz. adım 2.12).

2. İğne Enjeksiyonu Aşısı

1. Tüm işleri laminer akış başlığında yapın. U. maydis gliserol stoklarını dondurucu deposundan çıkarın. Patates dekstroz agar (PDA) plakalarına U. maydis vahşi tip suşları 1/2 (çiftleşme tipi a1b1) ve 2/9 (çiftleşme tipi a2b2, izojenik ila 1/2) arasında steril bir döngü ve çizgi gliserol stokları kullanın. Suşları ayrı ayrı koruyun.
2. PDA plakalarını iki gün boyunca 30 °C inkübatörde U. maydis ile çizgili yerleştirin. Farklı bir biyotrofik patojen kullanıyorsanız uygun suş, ortam ve büyüme koşullarını kullanın. U. maydis suşunun iyi büyüdüğünden emin olmak için patojenin iki günlük dönemde büyümesini izleyin.
3. PDA plakalarını iki gün sonra inkübatörden çıkarın. Plakalar iyi patojen büyümesine sahip olmalı ve tek koloniler içermelidir (Şekil 2A). Tek koloniler elde etmek önemlidir. Tek koloniler mevcut değilse, plakaları daha düşük bir konsantrasyonda dinlendirin.
4. Tüm işi laminer akış başlığında yapın. PDA plakalarından her suş için tek bir koloni seçmek için steril bir kürdan kullanın. Tek bir koloni içeren kürdanı 3 ml patates dekstroz suyuna (PDB) yerleştirin. 2-3 kültüre sahip olması önerilir.
5. 3 ml PDB kültürlerini 200 rpm'de iki gün boyunca 30 °C inkübatöre/çalkalayıcıya yerleştirin. Kültürün büyümesini sağlamak için iki günlük dönemde kültürün büyümesini izleyin. Kültür çok bulutlu görünmelidir.
6. Sıvı kültürlerini inkübatörden/çalkalayıcıdan çıkarın ve hücrelerin_{1,0 (~1 x 10} ⁷ hücre/ml)¹⁷OD'ye yetiştirilmesini sağlamak için OD 600'deki konsantrasyonu ölçün.
7. U. maydis hücre süspansiyon kültürlerini, son 30 ml kültür hacminde su kullanarak 1 x^{10 6} hücre/ ml'lik son konsantrasyona getirin. Bu konsantrasyon sürekli olarak patojen hücre süspansiyon kültürü ile bitkilerin iyi enfeksiyonu ile sonuçlanır. ¹⁷

Not: Aşılama için gerekli uygun hücre titresini belirlemek için farklı patojen suşları kullanırken çeşitli hücre süspansiyon konsantrasyonları test edilmelidir^18,19. Hücre süspansiyon kültürü için verilen son konsantrasyon, titterleme için bir başlangıç noktası olarak kullanılabilir. Patojen hücre süspansiyon kültürünün uygun konsantrasyonu, iyi enfeksiyonlu bitki fenotipleri görselleştirilerek doğrulanmalıdır (Şekil 3A-E).

8. Aşılamadan önce iki U. maydis suşunun eşit hacimlerini karıştırın. Bir patojen suşu kullanıyorsanız, 2.9 adımına geçin. Her aşılama deneyi için taze U. maydis hücre süspansiyon kültürleri hazırlayın ve iki gün sonra hücre süspansiyon kültürlerini atın.
9. Deneysel iğne enjeksiyonu aşısı için, hücre süspansiyon kültürünü şırıngaya çekerek 3 ml'lik bir şırıngayı U. maydis hücre süspansiyon kültürü ile doldurun.
10. Kontrol iğne enjeksiyonu aşısı için, 3 ml'lik bir şırıngayı su ile doldurun¹⁷. Deneysel iğne enjeksiyonu aşısı için de aynı prosedürü kullanın.
11. Her 3 ml şırınganın ucuna 0,457 mm x 1,3 cm hipodermik iğne takın. Seçilen iğne boyutu, bitki yaprakları arasındaki hücre süspansiyon kültürünü bitki dokusuna en az hasarla ulaştıracaktır.
12. Deney ve kontrol tesislerini iğne enjeksiyonu aşılarına hazırlık için ekimden 10 gün sonra büyüme odasından çıkarın (Şekil 2B) (bkz. adım 1.7).
13. U. maydis hücre süspansiyon kültürünü içeren hipodermik iğneyi, toprak çizgisinin hemen üzerinde 90° açıyla deneysel bir bitkinin gövdesine dikkatlice yerleştirin. İğneyi sapın ortasına gelene kadar yerleştirin. İğneyi gövdeden itmeyin (Şekil 2C).
14. Deneysel bitkiye yaklaşık 100 μl U. maydis hücre süspansiyon kültürü^18,19enjekte edin. Bu, fidenin yüksekliğine bağlı olarak biraz değişecektir. Hücre süspansiyon kültürü gövdeden geçecek ve bitkinin girdabına doğru hareket edecektir. Hücre süspansiyon kültürü bitkinin girdabında görülebilecektir. 3 ml şırınna boşalana kadar her bir bitkiye 100 μl hücre süspansiyon kültürü enjekte etmeyi sürdürün.
15. Enjeksiyondan sonra, iğneyi bitki sapından dikkatlice çıkarın. İğneyi şimdi boş olan 3 ml şırıngadan çıkarın ve suyla doldurun. İğneyi şırıngaya geri takın ve iğne ucuna takılabilecek bitki dokusunu çıkarmak için suyu iğneden geçirin.
16. Her deneysel bitki için 2.9-2.15 adımlarını tekrarlayın. Su enjekte ederek kontrol tesisleri için aynı protokolü izleyin.
17. Aşılanmış deneysel ve kontrol tesislerini tekrar büyüme odasına yerleştirin. Bitki dokusunu değil toprağı ıslatarak bitkileri günlük olarak sulayın.
18. Patojen gelişimi ve bitki direnci reaksiyonlarını tespit etmek için bitkileri günlük olarak kontrol edin.

3. Direnç Reaksiyonu Taraması

1. 1 ila 5 direnç reaksiyonu derecelendirme ölçeği kullanarak her bitki 7, 10, 14 ve 21 gün sonrası aşılama (dpi) için direnç reaksiyonlarını puanlayın ve kaydedin. Derecelendirme ölçeğindeki sayısal değerler arttıkça hastalık şiddeti artar (Tablo 2). 1C (Yaprak kloroz), 1A (Yaprak antosiyanin üretimi) veya 2 (küçük yaprak safra) direnç reaksiyonu direnci gösterir. A 3 (kök safra), 4 (bazal safra) veya 5 (bitki ölümü) direnç reaksiyonu duyarlılığı gösterir (Şekil 3A-E ve Tablo 2)^18,19.
2. Hem deneysel hem de kontrol tesislerini puanlayın ve direnç reaksiyonu derecelendirmelerini kaydedin.
3. Deneysel ve kontrol tesislerinin direnç reaksiyonlarını karşılaştırın. 1C, 1A veya 2 direnç reaksiyon derecesine sahip deneysel bitkileri seçin. Bu bitkilerin U. maydis^18,19'adayanıklı olduğu düşünülmektedir.
4. Bitki fenotiplerini doğrulamak için tüm deneyi tekrarlayın.

Sonuçlar

Başarılı bir iğne enjeksiyonu inokülasyonu, U. maydis (deneysel) ile aşılanmış bitkilerin fenotipinin görselleştirilmesiyle belirlenebilir. Deneysel bitkilerin çoğu U. maydis enfeksiyonuna karşı hassastı. Duyarlı bitkiler siyah teliospores ile kök ve bazal safra oluşumu ile gösterilen çok şiddetli hastalık gelişimi göstermiştir (Şekil 3D ve 3E, Tablo 2). Hastalığın şiddeti nedeniyle aşılamadan sonra birkaç bitki öldü....

Tartışmalar

Bu çalışmada 700 mısır ve teozinte bitkisinin gövdesine U. maydis suşunu ulaştırmak için kullanılan iğne enjeksiyonu aşılama yöntemi başarılı oldu. Ayrıca, bitkileri taramak ve patojen gelişimini tespit etmek için revize edilmiş bir hastalık direnci derecelendirme ölçeği kullanılmıştır. Her iki yöntemin de kullanılması sonucunda, U. maydis'e dirençli bitki hatları, artık hastalık direncinin iyileştirilmesi için ıslah programlarında birleştirilebilen ve test edil...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seed for plants			Collected from original crosses
Growth chamber	Conviron	PGR14 REACH-IN
Planting flats	Hummert International	14-3385-2
Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite)	Hummert International	10-1059-2
Laminar flow hood	Lab Conoco	70875372
Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest			Stocks were grown from original culture
Sterile loop	Fisher Scientific	S17356A
Potato dextrose agar (PDA) plates	Fisher Scientific	R454311
Incubator set to 30 °C	Fisher Scientific	11-690-650F
Sterile toothpicks	Walmart		Purchased from Walmart and sterilized by autoclave
Potato dextrose broth (PDB)	Fisher Scientific	ICN1008617
Incubator-shaker set to 30 °C	New Brunswick	14-278-179
Spectrophotometer	Fisher Scientific	4001000
U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml)			Grown from glycerol stock as described in the methods
3 ml Syringes	Becton Dickinson	309606
.457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles	Kendall Brands	8881250321