Une méthode rapide et efficace pour évaluer la pathogénicité d’Ustilago maydis sur les lignées de maïs et de téosinte

Résumé

L’utilisation d’une méthode d’injection d’aiguille pour inoculer le maïs et les plantes de teosinte avec l’agent pathogène biotrophic Ustilago maydis est décrite. La méthode d’inoculation par injection d’aiguille facilite l’administration contrôlée de l’agent pathogène fongique entre les feuilles de la plante où l’agent pathogène pénètre dans la plante par la formation d’apprésoria. Cette méthode est très efficace, permettant des inoculations reproductibles avec U. maydis.

Résumé

Le maïs est l’une des principales cultures céréalières dans le monde. Cependant, la sensibilité aux agents pathogènes biotrophiques est le principal obstacle à l’augmentation de la productivité. U. maydis est un champignon pathogène biotrophique et l’agent causal du charbon de maïs sur le maïs. Cette maladie est responsable d’importantes pertes de rendement d’environ 1,0 milliard de dollars par an aux États-Unis¹ Plusieurs méthodes, y compris la rotation des cultures, l’application de fongicides et les traitements des semences, sont actuellement utilisées pour contrôler le charbon du maïs^2. Cependant, la résistance de l’hôte est la seule méthode pratique pour gérer le charbon de maïs. L’identification des plantes cultivées, y compris le maïs, le blé et le riz, qui sont résistantes à divers agents pathogènes biotrophiques a considérablement réduit les pertes de rendement annuelles^{de 3}à 5 . Par conséquent, l’utilisation d’une méthode d’inoculation d’agents pathogènes qui délivre efficacement et de manière reproductible l’agent pathogène entre les feuilles des plantes faciliterait l’identification rapide des lignées de maïs résistantes à U. maydis. Comme, une première étape vers l’identification des lignées de maïs qui sont résistantes à U. maydis, une méthode d’inoculation par injection d’aiguille et une méthode de criblage de réaction de résistance ont été utilisées pour inoculer des lignées d’introgression de maïs, de téosinte et de maïs x teosinte avec une souche d’U. maydis et pour sélectionner des plantes résistantes.

Des lignées d’introgression de maïs, de téosinte et de maïs x teosinte, composées d’environ 700 plantes, ont été plantées, inoculées avec une souche d’U. maydiset examinées pour la résistance. Les méthodes d’inoculation et de dépistage ont permis d’identifier trois lignées de téosinte résistantes à U. maydis. Ici, un protocole détaillé d’inoculation par injection d’aiguille et de criblage de réaction de résistance pour les lignées d’introgression du maïs, de la téosinte et du maïs x teosinte est présenté. Cette étude démontre que l’inoculation par injection d’aiguilles est un outil précieux en agriculture qui peut fournir efficacement U. maydis entre les feuilles de la plante et a fourni des lignées végétales résistantes à U. maydis qui peuvent maintenant être combinées et testées dans des programmes de sélection pour améliorer la résistance aux maladies.

Introduction

Les maladies fongiques des plantes représentent l’une des menaces les plus éminentes pour l’agriculture. La nécessité de développer des cultures présentant une meilleure résistance aux maladies augmente en raison des besoins alimentaires d’une population mondiale croissante. Les agents pathogènes des plantes infectent naturellement les plantes cultivées dans le champ, provoquant des maladies qui ont un impact négatif sur le rendement des cultures⁶. Il a été démontré que l’identification et l’utilisation de plantes résistantes peuvent améliorer la résistance et diminuer la perte de rendement. Des cultivars résistants ont été identifiés chez de nombreuses espèces végétales, y compris le maïs, le blé, le riz et le sorgho, en inoculant les plantes avec un phytopathogène et en sélectionnant pour les lignées résistantes^7. Par conséquent, la mise au point et l’utilisation d’une méthode d’inoculation efficace permettraient à de nombreuses plantes d’être inoculées et de faire l’objet d’un dépistage de résistance. Diverses méthodes d’inoculation ont été utilisées, y compris l’inoculation par immersion, la canalisation de la culture de suspension cellulaire pathogène dans le tourbillon de la plante et l’inoculation par injection d’aiguille^8-11. Avec chaque méthode, l’agent pathogène doit être introduit de manière fiable entre les feuilles de la plante où l’agent pathogène pénètre dans la plante par la formation d’apprésoria pour assurer le développement de l’agent pathogène et l’infection des plantes^12,13.

La méthode d’inoculation par immersion consiste à plonger un semis de plante dans une culture en suspension cellulaire d’agent pathogène, tandis que la méthode de pipetage nécessite de placer la culture de suspension cellulaire pathogène dans le tourbillon du semis de plante. Toutefois, il existe des problèmes avec les deux méthodes. Premièrement, les deux méthodes dépendent du mouvement naturel de l’agent pathogène de la surface des feuilles dans le tissu végétal, qui est très variable. La plupart des agents pathogènes pénètrent naturellement dans la plante par des ouvertures stomatiques ou des plaies à la surface des feuilles de la plante. Cependant, il existe une variabilité importante dans la capacité des agents pathogènes à pénétrer à la surface des feuilles de la plante à travers les stomates et/ou les plaies à la surface des feuilles. Par conséquent, la pénétration des agents pathogènes ne peut pas être contrôlée par l’une ou l’autre des méthodes d’inoculation, ce qui pourrait entraîner des données incohérentes. Deuxièmement, lors du criblage d’un grand nombre de plantes, la fusion des semis dans une culture en suspension cellulaire d’agents pathogènes peut prendre beaucoup de temps et peut limiter le nombre de plantes qui peuvent être examinées. A l’inverse, le protocole d’inoculation par injection d’aiguille décrit ici délivre la culture de suspension cellulaire pathogène entre les feuilles de la plante facilitant la formation de l’appressoria^14. L’agent pathogène utilise ensuite l’appressoria nouvellement développé pour entrer dans la plante en éliminant le problème de pénétration de l’agent pathogène. De plus, le protocole d’inoculation par injection d’aiguille fournit une gamme de phénotypes pour les plants de maïs et de téosinte qui ont été inoculés avec U. maydis et qui démontrent une bonne infection. Les phénotypes peuvent être utilisés comme marqueur pour déterminer la meilleure concentration pour la culture de suspension cellulaire pathogène, ce qui donne des phénotypes végétaux cohérents dans et entre différentes expériences.

Après l’inoculation des plantes avec une culture en suspension cellulaire pathogène, les plantes sont généralement examinées pour détecter un phénotype^8-11,15résistant ou sensible. Bien que les échelles d’évaluation des maladies aient été largement utilisées pour dépister et classer les phénotypes des plantes, les échelles d’évaluation diffèrent selon l’agent pathogène analysé. Par conséquent, un protocole d’évaluation des maladies pour les interactions entre U. maydis et le maïs peut être utilisé pour des agents pathogènes fongiques similaires¹⁶.

La présente série de protocoles détaille l’inoculation par injection d’aiguille avec une culture de suspension cellulaire d’U. maydis et un criblage de réaction de résistance aux maladies des lignées d’introgression du maïs, de la téosinte et de la teosinte de maïs x. Les protocoles actuels ne se limitent pas à l’injection à l’aiguille d’U. maydis dans les plants de maïs, mais peuvent être utilisés pour relativement n’importe quel agent pathogène fongique et espèce végétale. Par conséquent, l’inclusion des détails des deux méthodes dans le même protocole permettra aux chercheurs d’utiliser directement les protocoles d’inoculation et de dépistage ou de manipuler les protocoles originaux pour mieux s’adapter à l’agent pathogène et aux espèces végétales d’intérêt.

Protocole

1. Croissance du matériel végétal

1. Sélectionner les lignées végétales pour l’inoculation et le dépistage. Deux lignées de maïs, cinq lignées de téosinte et quarante lignées de maïs x téosinte présentant une résistance non caractéristique à U. maydis ont été utilisées pour ces travaux(tableau 1).
2. Plantez des graines pour des expériences expérimentales(injection d’U. maydis) et de contrôle (injection d’eau) d’injection d’aiguille. Faites-le pour chaque lignée de plantes.
3. Plantez quatre graines (répliques) pour chaque lignée végétale dans de petits appartements en poussant les graines d’environ 1/2 pouce dans le sol avec le doigt et en les recouvrant légèrement de terre(figures 1A et 1B). N’emballez pas le sol sur la graine. Planter la graine plus profondément ou emballer le sol sur la graine peut causer des problèmes de levée des semis.
4. Arrosez les graines dans le sol. Assurez-vous que le sol est trempé et que les graines restent sous le sol après l’arrosage.
5. Après l’arrosage, placez les plantes dans une chambre de croissance avec des environnements diurtiques et nocturnes de température de 28/20 °C et 14/10 h de photopériode, respectivement et d’environ 500 μmol/m² sec   de rayonnements photosynthétiquement actifs au sommet de la canopée. Maintenir l’humidité relative pendant le jour et la nuit à environ 70 % et 90 %, respectivement.
6. Gardez toutes les plantes dans la même chambre de croissance pour maintenir un environnement de croissance qui est conforme tout au long de l’expérience.
7. Après 10 jours, retirer les plantes de la chambre de croissance et leur inoculer la culture en suspension cellulaire U. maydis à l’aide d’une méthode d’inoculation par injection à l’aiguille. Note: Les plants de maïs peuvent être inoculés 7 jours après la plantation^8-10. Cependant, les plantes de teosinte sont trop petites après 7 jours. Par conséquent, inoculer à la fois les plants de maïs et de téosinte 10 jours après la plantation pour assurer leur cohérence dans le cadre de l’expérience (voir l’étape 2.12).

2. Inoculation par injection d’aiguille

1. Faites tout le travail dans une hotte à flux laminaire. Retirer les stocks de glycérol U. maydis de l’entreposage au congélateur. Utiliser une boucle stérile et des stocks de glycérol striés de souches de type sauvage U. maydis 1/2 (type d’accouplement a1b1) et 2/9 (type d’accouplement a2b2, près de l’isogénique à 1/2) sur les plaques de gélose au dextrose (PDA) de pomme de terre. Maintenez les souches séparément.
2. Placer les plaques de PDA stries d’U. maydis dans un incubateur à 30 °C pendant deux jours. Si vous utilisez un agent pathogène biotrophique différent, utilisez la souche, le média et les conditions de croissance appropriés. Surveiller la croissance de l’agent pathogène au cours de la période de deux jours pour s’assurer que la souche U. maydis se développe bien.
3. Retirez les plaques de PDA de l’incubateur après deux jours. Les plaques doivent avoir une bonne croissance pathogène et contenir des colonies simples (Figure 2A). Il est important d’obtenir des colonies uniques. Si des colonies simples ne sont pas présentes, les plaques sont à une concentration plus faible.
4. Faites tout le travail dans une hotte à flux laminaire. Utilisez un cure-dent stérile pour sélectionner une seule colonie pour chaque souche parmi les plaques de PDA. Placez le cure-dent contenant une seule colonie dans un bouillon de dextrose de pomme de terre (APB) de 3 ml. Il est conseillé d’avoir 2-3 cultures.
5. Placer les cultures d’APB de 3 ml dans un incubateur/agitateur à 30 °C pendant deux jours à 200 tr/min. Surveiller la croissance de la culture au cours de la période de deux jours pour assurer la croissance de la culture. La culture devrait sembler très trouble.
6. Retirer les cultures liquides de l’incubateur/agitateur et mesurer la concentration à_{DO 600} pour s’assurer que les cellules ont été cultivées à une DO de 1,0 (~1 x 10⁷ cellules/ml)^17.
7. Porter les cultures de suspension cellulaire de U. maydis à une concentration finale de 1 x 10⁶ cellules/ml, en utilisant de l’eau dans un volume de culture final de 30 ml. Cette concentration entraîne systématiquement une bonne infection des plantes par la culture de suspension cellulaire pathogène. ^{17 ans}

Remarque : Diverses concentrations de suspension cellulaire doivent être testées lors de l’utilisation de différentes souches pathogènes afin de déterminer le titre cellulaire approprié nécessaire à l’inoculation^18,19. La concentration finale donnée pour la culture en suspension cellulaire peut être utilisée comme point de départ pour le tittering. La concentration appropriée de la culture de suspension cellulaire pathogène doit être vérifiée en visualisant les phénotypes végétaux présentant une bonne infection (figures 3A-E).

8. Mélanger des volumes égaux des deux souches d’U. maydis avant l’inoculation. Si vous utilisez une souche pathogène, passez à l’étape 2.9. Préparer des cultures fraîches de suspension cellulaire d’U. maydis pour chaque expérience d’inoculation et jeter les cultures de suspension cellulaire après deux jours.
9. Pour l’inoculation expérimentale par injection d’aiguille, remplissez une seringue de 3 ml avec la culture de suspension cellulaire U. maydis en tirant la culture de suspension cellulaire dans la seringue.
10. Pour l’inoculation par injection d’aiguille de contrôle, remplissez une seringue de 3 ml avec de l’eau¹⁷. Utilisez la même procédure pour l’inoculation expérimentale par injection d’aiguilles.
11. Fixez une aiguille hypodermique de 0,457 mm x 1,3 cm à l’extrémité de chaque seringue de 3 ml. La taille d’aiguille choisie fournira la culture de suspension cellulaire entre les feuilles de la plante avec un minimum de dommages au tissu végétal.
12. Retirer les plantes expérimentales et témoins de la chambre de croissance 10 jours après la plantation en vue des inoculations par injection d’aiguilles(figure 2B)(voir l’étape 1.7).
13. Insérez soigneusement l’aiguille hypodermique contenant la culture en suspension cellulaire U. maydis dans la tige d’une plante expérimentale à un angle de 90° juste au-dessus de la ligne du sol. Insérez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle soit au milieu de la tige. Ne poussez pas l’aiguille à travers la tige(figure 2C).
14. Injecter à la plante expérimentale environ 100 μl de la culture en suspension cellulaire U. maydis ^18,19. Cela variera légèrement en fonction de la hauteur du semis. La culture en suspension cellulaire poussera à travers la tige et se déplacera dans le tourbillon de la plante. La culture en suspension cellulaire sera visible dans le tourbillon de la plante. Continuer d’injecter 100 μl de la culture de suspension cellulaire dans chaque plante individuelle jusqu’à ce que la seringue de 3 ml soit vide.
15. Après l’injection, retirez soigneusement l’aiguille de la tige de la plante. Retirez l’aiguille de la seringue de 3 ml maintenant vide et remplissez-la d’eau. Reblocez l’aiguille à la seringue et poussez l’eau à travers l’aiguille pour enlever tout tissu végétal qui pourrait être pris dans l’extrémité de l’aiguille.
16. Répétez les étapes 2.9 à 2.15 pour chaque plante expérimentale. Suivez le même protocole pour les plantes témoins en injectant de l’eau.
17. Replacez les plantes expérimentales et de contrôle inoculées dans la chambre de croissance. Arrosez les plantes quotidiennement en mouillant le sol et non les tissus végétaux.
18. Vérifiez les plantes quotidiennement pour détecter le développement d’agents pathogènes et les réactions de résistance des plantes.

3. Dépistage des réactions de résistance

1. Noter et enregistrer les réactions de résistance pour chaque plante 7, 10, 14 et 21 jours après l’inoculation (dpi) à l’aide d’une échelle d’évaluation de réaction de résistance de 1 à 5. La gravité de la maladie augmente à mesure que les valeurs numériques sur l’échelle d’évaluation augmentent (tableau 2). Une réaction de résistance 1C (chlorose foliaire), 1A (production d’anthocyanine foliaire) ou 2 (petites galles foliaires) indique une résistance. Une réaction de résistance 3 (galles de la tige), 4 (galles basale) ou 5 (mort des plantes) indique une susceptibilité(figures 3A-E et tableau 2)^18,19.
2. Noter à la fois les plantes expérimentales et les plantes témoins et enregistrer les cotes de réaction de résistance.
3. Comparer les réactions de résistance des plantes expérimentales et de contrôle. Sélectionnez des plantes expérimentales avec un indice de réaction de résistance de 1C, 1A ou 2. Ces plantes sont considérées comme résistantes à U. maydis^18,19.
4. Répétez toute l’expérience pour vérifier les phénotypes végétaux.

Résultats

Une inoculation par injection d’aiguille réussie peut être déterminée en visualisant le phénotype des plantes inoculées avec U. maydis (expérimental). La majorité des plantes expérimentales étaient sensibles à l’infection à U. maydis. Les plantes sensibles ont montré un développement de maladie très grave démontré par la formation de tiges et de galles basales avec des téliospores noires(figures 3D et 3E, tableau 2). Plusieurs plan...

Discussion

Dans cette étude, la méthode d’inoculation par injection à l’aiguille utilisée pour administrer une souche d’U. maydis dans la tige de 700 plants de maïs et de téosinte a été couronnée de succès. De plus, une échelle révisée d’évaluation de la résistance aux maladies a été utilisée pour dépister les plantes et détecter le développement d’agents pathogènes. Grâce à l’utilisation des deux méthodes, des lignées de plantes résistantes à U. maydis ont été identifiée...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seed for plants			Collected from original crosses
Growth chamber	Conviron	PGR14 REACH-IN
Planting flats	Hummert International	14-3385-2
Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite)	Hummert International	10-1059-2
Laminar flow hood	Lab Conoco	70875372
Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest			Stocks were grown from original culture
Sterile loop	Fisher Scientific	S17356A
Potato dextrose agar (PDA) plates	Fisher Scientific	R454311
Incubator set to 30 °C	Fisher Scientific	11-690-650F
Sterile toothpicks	Walmart		Purchased from Walmart and sterilized by autoclave
Potato dextrose broth (PDB)	Fisher Scientific	ICN1008617
Incubator-shaker set to 30 °C	New Brunswick	14-278-179
Spectrophotometer	Fisher Scientific	4001000
U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml)			Grown from glycerol stock as described in the methods
3 ml Syringes	Becton Dickinson	309606
.457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles	Kendall Brands	8881250321