Un metodo rapido ed efficiente per valutare la patogenicità dei maydis di Ustilago sulle linee di mais e teosinte

Riepilogo

Viene descritto l'uso di un metodo di iniezione dell'ago per inoculare il mais e le piante teosinte con l'agente patogeno biotrofico Ustilago maydis. Il metodo di inoculazione dell'iniezione dell'ago facilita la somministrazione controllata dell'agente patogeno fungino tra le foglie della pianta in cui l'agente patogeno entra nella pianta attraverso la formazione di appresoria. Questo metodo è altamente efficiente, consentendo inoculazioni riproducibili con U. maydis.

Abstract

Il mais è una delle principali colture cerealicole in tutto il mondo. Tuttavia, la suscettibilità agli agenti patogeni biotrofici è il vincolo primario per aumentare la produttività. U. maydis è un agente patogeno fungino biotrofico e l'agente causale del mais sul mais. Questa malattia è responsabile di perdite di resa significative di circa $ 1,0 miliardi all'anno negli Stati^{Uniti 1 Diversi} metodi tra cui la rotazione delle colture, l'applicazione di fungicidi e i trattamenti delle sementi sono attualmente utilizzati per controllare il mal di mais². Tuttavia, la resistenza dell'ospite è l'unico metodo pratico per gestire il malumore di mais. L'identificazione delle piante coltivate tra cui mais, grano e riso resistenti a vari agenti patogeni biotrofi ha diminuito significativamente le perdite di^{resa ogni anno 3-5}. Pertanto, l'uso di un metodo di inoculazione patogena che fornisca in modo efficiente e riproducibile l'agente patogeno tra le foglie delle piante, faciliterebbe la rapida identificazione delle linee di mais resistenti a U. maydis. Come, un primo passo verso l'identificazione delle linee di mais resistenti a U. maydis, un metodo di inoculazione dell'iniezione di ago e un metodo di screening della reazione di resistenza è stato utilizzato per inoculare le linee di introgressione di mais, teosinte e mais x teosinte con un ceppo di U. maydis e per selezionare piante resistenti.

Le linee di introgressione di mais, teosinte e mais x teosinte, costituite da circa 700 piante, sono state piantate, inoculate con un ceppo di U. maydise vengono schernite per la resistenza. I metodi di inoculazione e screening hanno identificato con successo tre linee di teosinte resistenti a U. maydis. Qui viene presentato un protocollo dettagliato di inoculazione dell'iniezione di ago e screening della reazione di resistenza per le linee di introgressione di mais, teosinte e mais x teosinte. Questo studio dimostra che l'inoculazione dell'iniezione di aghi è uno strumento inestimabile in agricoltura in grado di fornire efficacemente U. maydis tra le foglie delle piante e ha fornito linee vegetali resistenti a U. maydis che ora possono essere combinate e testate nei programmi di allevamento per una migliore resistenza alle malattie.

Introduzione

Le malattie fungine delle piante rappresentano una delle minacce più eminenti per l'agricoltura. La necessità di sviluppare colture con una migliore resistenza alle malattie è in aumento a causa del fabbisogno alimentare di una popolazione mondiale in crescita. Gli agenti patogeni vegetali infettano naturalmente le piante coltivate sul campo causando malattie che hanno un impatto negativo sulla resa delle^{colture 6}. È stato dimostrato che identificare e utilizzare piante resistenti può migliorare la resistenza e ridurre la perdita di resa. Cultivar resistenti sono state identificate in molte specie vegetali tra cui mais, grano, riso e sorgo inoculando le piante con un agente patogeno vegetale e selezionando per linee resistenti⁷. Pertanto, lo sviluppo e l'uso di un metodo di inoculazione efficiente consentirebbero a molte piante di essere inoculate e vengono vengono utilizzati metodi di inoculazione e schermamento della resistenza. Sono stati utilizzati vari metodi di inoculazione tra cui l'inoculazione del tuffo, la pipettazione della coltura di sospensione delle cellule patogene nel vortice della pianta e l'inoculazione dell'iniezione di^{ago 8-11}. Con ogni metodo, l'agente patogeno deve essere introdotto in modo affidabile tra le foglie della pianta in cui l'agente patogeno entra nella pianta attraverso la formazione di appresoria per garantire lo sviluppo patogeno^{e l'infezione delle piante 12,13}.

Il metodo di inoculazione del tuffo prevede l'immersione di una piantina vegetale in una coltura di sospensione cellulare patogena, mentre il metodo di pipettaggio richiede di posizionare la coltura di sospensione cellulare patogena nel vortice della piantina vegetale. Tuttavia, ci sono problemi con entrambi i metodi. In primo luogo, entrambi i metodi dipendono dal movimento naturale dell'agente patogeno dalla superficie fogliare nel tessuto vegetale che è altamente variabile. La maggior parte degli agenti patogeni entra naturalmente nella pianta attraverso aperture stomatali o ferite sulla superficie fogliare della pianta. Tuttavia, c'è una significativa variabilità nella capacità degli agenti patogeni di penetrare nella superficie fogliare vegetale attraverso gli stomi e / o le ferite sulla superficie fogliare. Pertanto, la penetrazione dell'agente patogeno non può essere controllata con un metodo di inoculazione che potrebbe portare a dati incoerenti. In secondo luogo, quando si vaglia un gran numero di piante, immergere le piantine in una coltura di sospensione cellulare patogena può richiedere molto tempo e può limitare il numero di piante che possono essere schermate. Al contrario, il protocollo di inoculazione dell'iniezione di ago descritto nel presente documento fornisce la coltura di sospensione cellulare patogena tra le foglie della pianta facilitando la formazione di appressoria¹⁴. L'agente patogeno utilizza quindi gli appressori di nuova sviluppo per entrare nella pianta eliminando il problema della penetrazione dell'agente patogeno. Inoltre, il protocollo di inoculazione dell'iniezione di ago fornisce una gamma di fenotipi per piante di mais e teosinte che sono state inoculate con U. maydis e dimostrano una buona infezione. I fenotipi possono essere usati come marcatore per determinare la migliore concentrazione per la coltura di sospensione cellulare patogena con conseguente fenotipi vegetali coerenti all'interno e tra diversi esperimenti.

A seguito dell'inoculazione delle piante con una coltura di sospensione cellulare patogena, le piante sono in genere schermate per rilevare un fenotipo resistente o^{suscettibile 8-11,15}. Mentre le scale di valutazione della malattia sono state ampiamente utilizzate per schermare e classificare i fenotipi delle piante, le scale di classificazione differiscono a seconda dell'agente patogeno analizzato. Pertanto, uno stabilimento di protocollo sulla scala di classificazione delle malattie per le interazioni u. maydis e mais può essere utilizzato per agenti patogeni^{fungini simili 16}.

La presente serie di protocolli descrive in dettaglio l'inoculazione dell'iniezione di aghi con una coltura di sospensione cellulare U. maydis e lo screening della reazione di reazione di resistenza alle malattie di mais, teosinte e mais x linee di introgressione teosinte. I protocolli attuali non si limitano all'inoculazione dell'iniezione di aghi di U. maydis nelle piante di mais, ma possono essere utilizzati per relativamente qualsiasi agente patogeno fungino e specie vegetale. Pertanto, includere i dettagli di entrambi i metodi nello stesso protocollo consentirà ai ricercatori di utilizzare direttamente i protocolli per l'inoculazione e lo screening o di manipolare i protocolli originali per adattarsi meglio all'agente patogeno e alle specie vegetali di interesse.

Protocollo

1. Crescita del materiale vegetale

1. Selezionare le linee dell'impianto per l'inoculazione e lo screening. Per questo lavoro sono state utilizzate due linee di granturco, cinque linee di teosinte e quaranta linee di mais x teosinte con resistenza insolita agli U. maydis (tabella 1).
2. Semi vegetali per esperimenti sperimentali(iniezione di U. maydis) e controllo (iniezione d'acqua) di inoculazione dell'ago. Eseguire questa questa cosa per ogni linea di piante.
3. Piantare quattro semi (replicati) per ogni linea vegetale in piccoli appartamenti spingendo i semi di circa 1/2 pollice nel terreno con il dito e coprendo leggermente il terreno(figure 1A e 1B). Non imballare il terreno sopra il seme. Piantare il seme più in profondità o imballare il terreno sul seme può causare problemi con l'emergere della piantina.
4. Innaffia i semi nel terreno. Assicurarsi che il terreno sia imbevuto e che i semi rimangano sotto il terreno dopo l'irrigazione.
5. Dopo l'irrigazione, posizionare le piante in una camera di crescita con ambienti diurni e notturni di temperatura di 28/20 °C e 14/10 ore di fotoperiodo, rispettivamente e circa 500 μmol/m² sec   di radiazioni fotosinteticamente attive nella parte superiore del baldacchino. Mantenere l'umidità relativa durante il giorno e la notte rispettivamente a circa il 70% e il 90%.
6. Mantenere tutte le piante nella stessa camera di crescita per mantenere un ambiente di crescita congruente durante l'esperimento.
7. Dopo 10 giorni, rimuovere le piante dalla camera di crescita e inoculare le piante con la coltura di sospensione cellulare U. maydis utilizzando un metodo di inoculazione dell'iniezione di ago. Nota: Le piante di mais possono essere inoculate 7 giorni dopo la semina^8-10. Tuttavia, le piante di teosinte sono troppo piccole dopo 7 giorni. Pertanto, inoculare sia il mais che le piante di teosinte 10 giorni dopo la semina per verificarsi la coerenza all'interno dell'esperimento (vedere fase 2.12).

2. Inoculazione dell'iniezione di ago

1. Fai tutto il lavoro in un cappuccio a flusso laminare. Rimuovere le scorte di glicerolo U. maydis dallo stoccaggio del congelatore. Utilizzare un ciclo sterile e scorte di glicerolo striato di ceppi di tipo selvatico U. maydis 1/2 (tipo di accoppiamento a1b1) e 2/9 (accoppiamento di tipo a2b2, vicino isogenico a 1/2) su piatti di agar destrosio di patate (PDA). Mantenere i ceppi separatamente.
2. Posizionare le piastre PDA striate con U. maydis in un incubatore a 30 °C per due giorni. Se si utilizza un diverso agente patogeno biotrofico utilizzare il ceppo, i mezzi e le condizioni di crescita appropriati. Monitorare la crescita dell'agente patogeno durante il periodo di due giorni per garantire che il ceppo di Maydis negli Stati Uniti sta crescendo bene.
3. Rimuovere le piastre PDA dall'incubatore dopo due giorni. Le piastre devono avere una buona crescita patogena e contenere singole colonie(figura 2A). È importante ottenere singole colonie. Se le singole colonie non sono presenti riposano le piastre a una concentrazione inferiore.
4. Fai tutto il lavoro in una cappa di flusso laminare. Utilizzare uno stuzzicadenti sterile per selezionare una singola colonia per ogni ceppo dalle piastre PDA. Posizionare lo stuzzicadenti contenente una singola colonia in un brodo di destrosio di patate da 3 ml (PDB). Si consiglia di avere 2-3 culture.
5. Mettere le colture PDB da 3 ml in un incubatore/agitatore a 30 °C per due giorni a 200 giri/min. Monitora la crescita della cultura nel periodo di due giorni per garantire la crescita della cultura. La cultura dovrebbe apparire molto nuvolosa.
6. Rimuovere le colture liquide dall'incubatore/agitatore e misurare la concentrazione a OD₆₀₀ per assicurarsi che le cellule siano state coltivate ad un OD di 1,0 (~1 x 10⁷ cellule/ml)¹⁷.
7. Portare le colture di sospensione cellulare U. maydis ad una concentrazione finale di 1 x 10^{6 cellule/ml,} utilizzando acqua in un volume finale di coltura di 30 ml. Questa concentrazione si traduce costantemente in una buona infezione delle piante con la coltura di sospensione cellulare patogena. ^{17 di cui: la commissione per i}

Nota: Varie concentrazioni di sospensione cellulare devono essere testate quando si utilizzano diversi ceppi patogeni per determinare il titolo cellulare appropriato necessario per l'inoculazione^18,19. La concentrazione finale data per la coltura di sospensione cellulare può essere utilizzata come punto di partenza per la tura. L'adeguata concentrazione della coltura di sospensione cellulare patogena deve essere verificata visualizzando i fenotipi vegetali con una buona infezione (figure 3A-E).

8. Mescolare volumi uguali dei due ceppi di U. maydis prima dell'inoculazione. Se si utilizza un ceppo patogeno procedere al passaggio 2.9. Preparare nuove colture di sospensione cellulare U. maydis per ogni esperimento di inoculazione e scartare le colture di sospensione cellulare dopo due giorni.
9. Per l'inoculazione sperimentale dell'iniezione di ago, riempire una siringa da 3 ml con la coltura di sospensione cellulare U. maydis disegnando la coltura di sospensione cellulare nella siringa.
10. Per l'inoculazione dell'iniezione dell'ago di controllo, riempire una siringa da 3 ml con^{acqua 17}. Utilizzare la stessa procedura per l'inoculazione sperimentale dell'iniezione di ago.
11. Attaccare un ago ipodermico da 0,457 mm x 1,3 cm all'estremità di ogni siringa da 3 ml. La dimensione selezionata dell'ago fornirà la coltura di sospensione cellulare tra le foglie della pianta con danni minimi al tessuto vegetale.
12. Rimuovere gli impianti sperimentali e di controllo dalla camera di crescita 10 giorni dopo la semina in preparazione delle inoculazioni di iniezione dell'ago(figura 2B)(vedere fase 1.7).
13. Inserire con cura l'ago ipodermico contenente la coltura di sospensione cellulare U. maydis nel gambo di una pianta sperimentale con un angolo di 90° appena sopra la linea del suolo. Inserire l'ago fino a quando non si trova al centro dello stelo. Non spingere l'ago attraverso lo stelo (Figura 2C).
14. Iniettare l'impianto sperimentale con circa 100 μl della coltura di sospensione cellulare U. maydis ^18,19. Questo varierà leggermente a seconda dell'altezza della piantina. La coltura della sospensione cellulare spingerà attraverso il gambo e si sposterà nel vortice della pianta. La coltura di sospensione cellulare sarà visibile nel vortice della pianta. Continuare a iniettare 100 μl della coltura di sospensione cellulare in ogni singola pianta fino a quando la siringa da 3 ml è vuota.
15. Dopo l'iniezione, rimuovere con cura l'ago dallo stelo della pianta. Rimuovere l'ago dalla siringa da 3 ml ora vuota e riempire con acqua. Attaccare l'ago alla siringa e spingere l'acqua attraverso l'ago per rimuovere qualsiasi tessuto vegetale che può essere catturato nella punta dell'ago.
16. Ripetere i passaggi da 2.9 a 2.15 per ogni impianto sperimentale. Seguire lo stesso protocollo per gli impianti di controllo iniettando acqua.
17. Riposizionare gli impianti sperimentali e di controllo inoculati nella camera di crescita. Innaffiare le piante ogni giorno bagnando il terreno non il tessuto vegetale.
18. Controllare quotidianamente le piante per rilevare lo sviluppo di agenti patogeni e le reazioni di resistenza delle piante.

3. Screening della reazione di resistenza

1. Segnare e registrare le reazioni di resistenza per ogni pianta 7, 10, 14 e 21 giorni dopo l'inoculazione (dpi) utilizzando una scala di valutazione della reazione di resistenza da 1 a 5. La gravità della malattia aumenta con l'aumentare dei valori numerici nella scala di classificazione (tabella 2). Una reazione di resistenza 1C (clorosi fogliare), 1A (produzione di antocianina fogliare) o 2 (piccole galle fogliari) indica resistenza. A 3 (galle staminali), 4 (galla basale) o 5 (morte vegetale) la reazione di resistenza indica suscettibilità(figure 3A-E e tabella 2)^18,19.
2. Segna impianti sperimentali e di controllo e registra i livelli di reazione di resistenza.
3. Confrontare le reazioni di resistenza degli impianti sperimentali e di controllo. Selezionare piante sperimentali con una resistenza di reazione 1C, 1A o 2. Queste piante sono considerate resistenti a U. maydis^18,19.
4. Ripetere l'intero esperimento per verificare i fenotipi della pianta.

Risultati

Un'inoculazione riuscita dell'iniezione di ago può essere determinata visualizzando il fenotipo delle piante inoculate con U. maydis (sperimentale). La maggior parte delle piante sperimentali erano suscettibili all'infezione da U. maydis. Le piante sensibili hanno mostrato uno sviluppo di malattie molto grave dimostrato dalla formazione di staminali e galle basali con teliospore nere(figure 3D e 3E, tabella 2). Diverse piante erano morte dopo l'inocul...

Discussione

In questo studio il metodo di inoculazione dell'iniezione di ago utilizzato per fornire un ceppo di U. maydis nel gambo di 700 piante di mais e teosinte ha avuto successo. Inoltre, è stata utilizzata una scala di valutazione della resistenza alle malattie rivista per migliorare le piante e rilevare lo sviluppo di agenti patogeni. Come risultato dell'utilizzo di entrambi i metodi, le linee vegetali resistenti agli U. maydis sono state identificate tra 700 piante di mais e teosinte che ora possono essere...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seed for plants			Collected from original crosses
Growth chamber	Conviron	PGR14 REACH-IN
Planting flats	Hummert International	14-3385-2
Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite)	Hummert International	10-1059-2
Laminar flow hood	Lab Conoco	70875372
Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest			Stocks were grown from original culture
Sterile loop	Fisher Scientific	S17356A
Potato dextrose agar (PDA) plates	Fisher Scientific	R454311
Incubator set to 30 °C	Fisher Scientific	11-690-650F
Sterile toothpicks	Walmart		Purchased from Walmart and sterilized by autoclave
Potato dextrose broth (PDB)	Fisher Scientific	ICN1008617
Incubator-shaker set to 30 °C	New Brunswick	14-278-179
Spectrophotometer	Fisher Scientific	4001000
U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml)			Grown from glycerol stock as described in the methods
3 ml Syringes	Becton Dickinson	309606
.457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles	Kendall Brands	8881250321