옥수수와 테오신테 라인에 우스틸라고 성 실증의 병원성을 평가하기위한 신속하고 효율적인 방법

요약

생체영양 병원체 우스틸라고 수교를 이용한 옥수수 및 테오신테 식물을 접종하는 바늘 주입 방법의 사용이 설명된다. 상기 바늘 주입 접종 방법은 병원체가 아프레소리아 형성을 통해 식물에 유입되는 식물 잎 사이에 곰팡이 병원균의 통제된 전달을 용이하게 한다. 이 방법은 매우 효율적이며, 미국 maydis와재현 가능한 접종을 가능하게 합니다.

초록

옥수수는 전 세계적으로 주요 시리얼 작물입니다. 그러나, 바이오 트로피크 병원체에 대한 감수성은 생산성을 높이기 위한 주요 제약조건이다. U. maydis는 옥수수에 옥수수 smut의 생물 영양 곰팡이 병원균 및 인과 에이전트입니다. 이 질병은 미국에서 매년 약 10억 달러의 상당한 수율 손실을 담당하고 있으며 작물 회전, 살균제 적용 및 종자 치료를 포함한^여러 가지 방법은 현재 옥수수 smut^2를제어하는 데 사용됩니다. 그러나, 호스트 저항은 옥수수 smut를 관리 하기 위한 유일한 실용적인 방법. 옥수수, 밀, 쌀 등 농작물 식물의 식별은 다양한 생영양 병원균에 내성이 있는 것으로 매년^3-5%감소한다. 따라서 식물 잎 사이에 병원균을 효율적이고 재현적으로 전달하는 병원균 접종 방법의 사용은 미국 의 질비에내성이 있는 옥수수 선의 신속한 식별을 용이하게 할 것이다. 바와 같이, 미국 메이디스에내성이 있는 옥수수 라인을 들여쓰기위한 첫 번째 단계, 바늘 주입 접종 방법 및 저항 반응 스크리닝 방법은 옥수수, 테오신테 및 옥수수 x 테오신테 내성 라인을 접종하고 내성 식물을 선택하기 위해 이용되었다.

옥수수, 테오신테 및 옥수수 x 테오신테 내성 라인, 약 700 식물로 구성, 심어졌다, 미국 maydis의변형으로 접종, 저항을 위해 선별. 접종 및 스크리닝 방법은 성공적으로 미국 maydis에저항하는 3개의 테오신트 라인을 확인했습니다. 여기에 옥수수, 테오신테 및 옥수수 x 테오신테 내성 라인에 대한 상세한 바늘 주입 접종 및 저항 반응 스크리닝 프로토콜이 제시된다. 이 연구는 바늘 주입 접종이 식물 잎 사이에 미국 maydis를 효율적으로 전달할 수 있는 농업에서 귀중한 도구이며, 현재 질병 내성을 위해 번식 프로그램에서 결합하고 테스트할 수 있는 미국 산염에 내성이 있는 식물 라인을 제공했음을 보여줍니다.

서문

식물의 곰팡이 질병은 농업에 가장 저명한 위협 중 하나입니다. 세계 인구의 식량 수요로 인해 질병 저항이 개선된 작물을 개발할 필요성이 증가하고 있습니다. 식물 병원체는 작물 수확량^6에부정적인 영향을 미치는 질병을 일으키는 현장에서 작물 식물을 자연적으로 감염시킵니다. 저항하는 식물을 식별하고 활용하면 저항을 개선하고 수율 손실을 줄일 수 있는 것으로 나타났습니다. 내성 품종은 옥수수, 밀, 쌀, 사탕수수를 포함한 많은 식물 종에서 식물 병원균으로 식물을 접종하고 저항하는 라인^7을선택하여 확인되었습니다. 따라서 효율적인 접종 방법의 개발 및 사용은 많은 식물을 접종하고 저항을 위해 선별 할 수 있게 합니다. 딥 접종, 병원체 현탁액 배양배의 배관, 바늘 주입 접종^8-11등 다양한 접종 방법이 사용되고 있다. 각 방법을 통해 병원균이 식물성 잎 사이에 안정적으로 도입되어야 하며 병원균의 형성을 통해 식물성전환증을 통해 식물성^{전환기(12,13)를}보장해야 한다.

딥 접종 방법은 식물 묘목 을 병원체 현탁액 배양으로 잠급하는 것을 포함하며, 파이펫팅 방법은 병원균 세포 현탁액 배양을 식물 묘목의 소용돌이에 배치해야합니다. 그러나 두 가지 방법에 문제가 있습니다. 첫째, 두 가지 방법은 잎 표면에서 매우 가변적인 식물 조직으로 병원균의 자연적인 움직임에 의존한다. 대부분의 병원균은 식물 잎 표면에 장토 마개 또는 상처를 통해 자연적으로 식물에 들어갑니다. 그러나, 잎 표면에 스토마타 및/또는 상처를 통해 식물 잎 표면을 관통하는 병원체 기능에 상당한 가변성이 있다. 따라서 병원균 침투는 잠재적으로 일관되지 않은 데이터를 초래할 수 있는 접종 방법으로 제어할 수 없습니다. 둘째, 많은 수의 식물을 선별할 때, 묘목을 병원체 현탁액 배양으로 침수하는 것은 시간이 많이 소요될 수 있으며, 스크리닝될 수 있는 식물의 수를 제한할 수 있다. 반대로, 본 원에 기재된 바늘 주입 접종 프로토콜은^{아프레소리아(14)의}형성을 용이하게 하는 식물 잎 사이에 병원체 현탁액 배양을 전달한다. 병원체는 병원체 침투 문제를 제거하는 식물에 들어가기 위해 새로 개발 된 appressoria를 활용합니다. 또한, 바늘 주입 접종 프로토콜은 미국 신체 상해와 접종 된 옥수수와 테오신테 식물에 대한 표현형의 범위를 제공하고 좋은 감염을 입증한다. 표현형은 병원체 현탁액 배양에 가장 적합한 농도를 결정하기 위해 마커로서 사용될 수 있으며, 이는 상이한 실험 내부와 그 사이에 일관된 식물 표현형을 초래한다.

병원균 세포 현탁액 배양으로 식물 접종에 이어 식물은 전형적으로 내성 또는 취약한 표현형^8-11,15를검출하기 위해 선별된다. 질병 등급 척도가 식물 표현형을 선별하고 분류하기 위해 광범위하게 사용되고 있지만, 분석중인 병원체에 따라 등급 척도가 다릅니다. 따라서, 미국 메이디및 옥수수 상호작용에 대한 질병 등급 척도 프로토콜 확립은 유사한 곰팡이 병원균(16)에 활용될 수 있다.

현재 일련의 프로토콜은 옥수수, 테오신테 및 옥수수 x 테오신테 내성 라인의 미국 증시 세포 현탁액 배양 및 질병 내성 반응 스크리닝을 가진 바늘 주입 접종을 자세히 설명합니다. 본 프로토콜은 옥수수 식물로 의한 미국 수산화의 바늘 주입 접종에 국한되지 않지만 상대적으로 모든 곰팡이 병원균 및 식물 종에 활용 될 수있다. 따라서, 동일한 프로토콜에 있는 두 방법의 세부 사항을 포함하여 연구원은 직접 접종 및 검열을 위한 프로토콜을 이용하거나 관심있는 병원체 및 식물 종에 더 잘 맞추기 위하여 원래 프로토콜을 조작할 수 있게 할 것입니다.

프로토콜

1. 식물 재료의 성장

1. 접종 및 스크리닝을 위해 식물 라인을 선택합니다. 2개의 옥수수 라인, 5개의 테오신테 라인, 그리고 미국 maydis에 대한 특징성이 없는 40개의 옥수수 x 테오신테 라인이 이 작품(표1)에사용되었다.
2. 실험용 식물종자(U. maydis 주입) 및 제어(물 주입) 바늘 주입 접종 실험. 각 플랜트 라인에 대해 이 작업을 수행합니다.
3. 작은 평지에 각 식물 라인에 대해 4 개의 씨앗 (복제)을 심고 손가락으로 토양으로 약 1/2 인치 씨앗을 밀어 토양으로 가볍게 덮음으로써(그림 1A 및 1B). 씨앗 위에 토양을 포장하지 마십시오. 씨앗을 심거나 씨앗 위에 토양을 포장하면 모종 출현에 문제가 발생할 수 있습니다.
4. 씨앗을 토양에 물을 넣습니다. 토양에 흠뻑 젖고 씨앗이 물을 뿌은 후 토양 아래에 남아 있는지 확인하십시오.
5. 물을 마신 후, 수중 및 야간 환경이 28/20°C, 광기간 의 14/10 시간, 각각 500 μmol/m² 초   광합성 활성 방사선이 캐노피의 상단에 있는 성장 챔버에 놓는다. 낮과 밤의 상대 습도를 각각 약 70%와 90%로 유지합니다.
6. 실험 전반에 걸쳐 일치하는 성장 환경을 유지하기 위해 동일한 성장 챔버에 모든 식물을 유지합니다.
7. 10일 후, 식물을 성장 챔버로부터 제거하고 바늘 주입 접종 방법을 사용하여 U. maydis 세포 현탁액 배양으로 식물을 접종한다. 참고 : 옥수수 식물은^8-10을심은 후 7 일 동안 접종 할 수 있습니다. 그러나, 테오신테 식물은 7 일 후에 너무 작습니다. 따라서, 실험 내의 일관성을 위해 심기 후 10일 후에 옥수수와 테오신테 식물을 접종한다(2.12단계 참조).

2. 바늘 주입 접종

1. 라미나르 플로우 후드에서 모든 작업을 수행합니다. 냉동고 보관에서 미국 수지니스 글리세롤 주식을 제거하십시오. 미국 마디스 야생형 균주 1/2(짝짓기 형 a1b1) 및 2/9(짝짓기 형 a2b2, 동종 에 가까운 1/2) 감자 덱스트로스 한천(PDA) 플레이트에 멸균 루프 및 줄무늬 글리세롤 스톡을 사용한다. 균주를 별도로 유지합니다.
2. PDA 플레이트를 30°C 인큐베이터에 2일 동안 배치합니다. 다른 생영양 병원균을 사용하는 경우 적절한 변형, 미디어 및 성장 조건을 사용합니다. 미국 의 수지 변형이 잘 성장하고 있는지 확인하기 위해 이틀 동안 병원균의 성장을 모니터링합니다.
3. 2일 후에 인큐베이터에서 PDA 플레이트를 제거합니다. 플레이트는 좋은 병원균 성장을 가져야하며 단일 식민지(그림 2A)를포함해야합니다. 단일 식민지를 얻는 것이 중요합니다. 단일 식민지가 존재하지 않는 경우 낮은 농도에서 플레이트를 다시 행진.
4. 라미나르 플로우 후드로 모든 작업을 수행합니다. 멸균 이쑤시개를 사용하여 PDA 플레이트의 각 변형에 대해 단일 콜로니를 선택합니다. 단일 콜로니가 들어 있는 이쑤시개를 감자 덱스트로스 국물(PDB)에 넣습니다. 2-3 문화가 있는 것이 좋습니다.
5. 3ml PDB 배양을 30°C 인큐베이터/셰이커에 200rpm에 2일간 놓습니다. 문화의 성장을 보장하기 위해 이틀 동안 문화의 성장을 모니터링할 수 있습니다. 문화는 매우 흐린 나타납니다.
6. 인큐베이터/셰이커로부터 액체 배양을 제거하고 OD_600의 농도를 측정하여 세포가 1.0(~1 x 10⁷ 셀/ml)의 OD로 성장되었는지^{확인한다.}
7. 최종 30ml 배양량에 물을 사용하여 1 x 10⁶ 셀/ml의 최종 농도로 U. maydis 세포 현탁액 배양을 가져옵니다. 이러한 농도는 병원균 세포 현탁액 배양을 가진 식물의 좋은 감염을 일관되게 초래한다. ¹⁷

참고: 다양한 세포 현탁액 농도는^{접종18,19에}필요한 적절한 세포 티터를 결정하기 위해 상이한 병원균 균주를 사용할 때 테스트되어야 한다. 세포 현탁액 배양에 대한 주어진 최종 농도는 소급을 위한 출발점으로 사용될 수 있다. 병원체 세포 현탁액 배양의 적절한 농도는 좋은감염(그림 3A-E)으로식물 표현형을 시각화하여 검증되어야 한다.

8. 접종 전에 두 개의 U. maydis 균주의 동일한 볼륨을 혼합합니다. 하나의 병원균균을 사용하는 경우 2.9단계로 진행한다. 각 접종 실험에 대한 신선한 U. maydis 세포 현탁액 배양을 준비하고 2 일 후에 세포 현탁액 배양을 폐기하십시오.
9. 실험용 바늘 주입 접종의 경우, 세포 현탁액 배양을 주사기로 끌어서 U. maydis 세포 현탁액 배양으로 3ml 주사기를 채우는 다.
10. 대조군 바늘 주입 접종의 경우, 물^17로3ml 주사기를 채우는 다. 실험용 바늘 주입 접종에 동일한 절차를 사용하십시오.
11. 각 3ml 주사기의 끝에 0.457 mm x 1.3cm 피하 바늘을 부착합니다. 선택된 바늘 크기는 식물 조직에 최소한의 손상으로 식물 잎 사이에 세포 현탁액 배양을 전달할 것이다.
12. 바늘 주입접종(도 2B)에대비하여 심기 10일 후에 성장 챔버로부터 실험 및 제어 식물을 제거한다(1.7단계 참조).
13. 미국 메이디스 세포 현탁액 배양을 함유한 피하 주사바늘을 토양 선 바로 위에 90° 각도로 실험 식물의 줄기에 조심스럽게 삽입한다. 바늘이 줄기 한가운데에 들어야 삽입합니다. 줄기(도 2C)를통해 바늘을 밀어붙이지 마십시오.
14. 미국 의 약 100 μl을 가진 실험 식물을 주입하여 세포 현탁액 배양^18,19. 이것은 모종의 높이에 따라 약간 달라집니다. 세포 현탁액 배양은 줄기를 통해 밀어 식물의 소용돌이로 이동합니다. 세포 현탁액 배양은 식물의 소용돌이에서 볼 수 있습니다. 3ml 주사기가 비어 질 때까지 각 개별 식물에 세포 현탁액 배양 100 μl을 계속 주입하십시오.
15. 주입 후 식물 줄기에서 바늘을 조심스럽게 제거하십시오. 지금 빈 3ml 주사기에서 바늘을 제거하고 물로 채웁니다. 바늘을 주사기에 다시 부착하고 바늘을 통해 물을 밀어 바늘 끝에 잡힐 수있는 식물 조직을 제거합니다.
16. 각 실험 플랜트에 대해 2.9-2.15단계를 반복합니다. 물을 주입하여 제어 식물에 대한 동일한 프로토콜을 따르십시오.
17. 접종된 실험 및 제어 식물을 다시 성장 챔버에 넣습니다. 식물 조직이 아닌 토양을 적시어 식물에 매일 물을.
18. 병원균 발달 및 식물 내성 반응을 감지하기 위해 매일 식물을 확인하십시오.

3. 저항 반응 스크리닝

1. 각 식물에 대한 저항 반응을 점수 및 기록 7, 10, 14, 및 21 일 사후 접종 (dpi) 1 5 저항 반응 등급 척도를 사용하여. 등급 척도의 수치 값이 증가함에 따라 질병 심각도가 증가합니다(표2). 1C(잎 클로로시스), 1A(잎 안토시아닌 생성) 또는 2(작은 잎 담즙) 저항 반응이 저항을 나타낸다. 3(줄기담), 4(기초담즙), 또는 5(식물사멸) 저항반응은 감수성을나타낸다(그림 3A-E 및 표 2)^18,19.
2. 실험 및 제어 식물과 기록 저항 반응 등급을 모두 점수.
3. 실험 및 제어 식물의 저항 반응을 비교합니다. 1C, 1A 또는 2 저항 반응 등급을 가진 실험 식물을 선택합니다. 이 식물은 미국 maydis^18,19에저항하는 것으로 간주됩니다.
4. 전체 실험을 반복하여 식물 표현형을 확인합니다.

결과

성공적인 바늘 주입 접종은 미국 신체 상해 (실험)로 접종 된 식물의 표현형을 시각화하여 결정 될 수있다. 실험 식물의 대다수는 미국 수지 감염에 취약했다. 민감성 식물은 검은 색 텔리오스포레스(그림3D 및 3E, 표 2)를가진 줄기 및 기저 담즙 형성에 의해 입증된 매우 심각한 질병 발달을 보였다. 몇몇 식물은 질병의 엄격 때문에 접종 후에 죽었...

토론

본 연구에서는 700개의 옥수수와 테오신테 식물의 줄기로 미국 의 균주를 전달하는 데 사용되는 바늘 주입 접종 방법이 성공적이었다. 또한, 개정된 질병 저항 등급 척도는 식물을 선별하고 병원체 발달을 검출하기 위해 사용되었다. 두 가지 방법을 모두 사용한 결과, 미국 메이디에 저항하는 식물 라인은 700개의 옥수수와 테오신테 식물 중 에서 확인되었으며, 이는 이제 질병 내성을 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seed for plants			Collected from original crosses
Growth chamber	Conviron	PGR14 REACH-IN
Planting flats	Hummert International	14-3385-2
Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite)	Hummert International	10-1059-2
Laminar flow hood	Lab Conoco	70875372
Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest			Stocks were grown from original culture
Sterile loop	Fisher Scientific	S17356A
Potato dextrose agar (PDA) plates	Fisher Scientific	R454311
Incubator set to 30 °C	Fisher Scientific	11-690-650F
Sterile toothpicks	Walmart		Purchased from Walmart and sterilized by autoclave
Potato dextrose broth (PDB)	Fisher Scientific	ICN1008617
Incubator-shaker set to 30 °C	New Brunswick	14-278-179
Spectrophotometer	Fisher Scientific	4001000
U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml)			Grown from glycerol stock as described in the methods
3 ml Syringes	Becton Dickinson	309606
.457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles	Kendall Brands	8881250321