Eine schnelle und effiziente Methode zur Beurteilung der Pathogenität von Ustilago-Maydis auf Mais- und Teosintenlinien

Zusammenfassung

Die Verwendung einer Nadelinjektionsmethode zur Inokulation von Mais- und Teosintenpflanzen mit dem biotrophen Erreger Ustilago maydis wird beschrieben. Die Nadelinjektionsimpfung erleichtert die kontrollierte Abgabe des Pilzerregers zwischen den Pflanzenblättern, wo der Erreger durch die Bildung von Appresorie in die Pflanze gelangt. Diese Methode ist hocheffizient und ermöglicht reproduzierbare Impfungen mit U. maydis.

Zusammenfassung

Mais ist eine wichtige Getreidepflanze weltweit. Die Anfälligkeit für biotrophe Krankheitserreger ist jedoch die haupthindernis für die Steigerung der Produktivität. U. maydis ist ein biotropher Pilzerreger und der Erreger von Maiskot auf Mais. Diese Krankheit ist verantwortlich für erhebliche Ertragsverluste von etwa 1,0 Milliarden US-Dollar jährlich in den USA¹ Mehrere Methoden einschließlich Fruchtfolge, Fungizid-Anwendung und Saatgut-Behandlungen werden derzeit verwendet, um Mais-Schmutz²zu kontrollieren. Der Wirtswiderstand ist jedoch die einzige praktische Methode zur Verwaltung des Maisschmutzes. Die Identifizierung von Kulturpflanzen wie Mais, Weizen und Reis, die gegen verschiedene biotrophe Krankheitserreger resistent sind, hat die Ertragsverluste jährlich^{um 3-5}deutlich verringert. Daher würde die Verwendung einer Pathogen-Impfungsmethode, die den Erreger effizient und reproduzierbar zwischen den Pflanzenblättern liefert, die schnelle Identifizierung von Maislinien erleichtern, die gegen U. maydisresistent sind. Als ein erster Schritt zur Indentifizierung von Maislinien, die gegen U. Maydisresistent sind, wurde eine Nadelinjektionsimpfungsmethode und ein Resistenzreaktionsscreening-Verfahren verwendet, um Mais-, Teosinten- und Maisx-Teosinten-Introgressionslinien mit einem U.-Maydis-Stamm zu impfen und resistente Pflanzen auszuwählen.

Mais, Teosinte und Mais x Teosinte-Introgressionslinien, bestehend aus etwa 700 Pflanzen, wurden gepflanzt, mit einem Stamm von U. Maydisgeimpft und auf Widerstand gescreent. Die Impf- und Screening-Methoden identifizierten erfolgreich drei Teosintenlinien, die gegen U. maydisresistent sind. Hier wird ein detailliertes Nadelinjektions-Inokulations- und Resistenzreaktions-Screening-Protokoll für Mais-, Teosinat- und Mais x Teosinte-Introgressionslinien vorgestellt. Diese Studie zeigt, dass Nadelinjektionsimpfung ein unschätzbares Werkzeug in der Landwirtschaft ist, das U. Maydis zwischen den Pflanzenblättern effizient liefern kann und Pflanzenlinien zur Verfügung gestellt hat, die gegen U. Maydis resistent sind, die nun kombiniert und in Zuchtprogrammen zur Verbesserung der Krankheitsresistenz getestet werden können.

Einleitung

Pilzkrankheiten von Pflanzen stellen eine der größten Bedrohungen für die Landwirtschaft dar. Die Notwendigkeit, Kulturen mit verbesserter Krankheitsresistenz zu entwickeln, steigt aufgrund des Nahrungsmittelbedarfs einer wachsenden Weltbevölkerung. Pflanzenpathogene infizieren natürlich Pflanzen auf dem Feld und verursachen Krankheiten, die sich negativ auf den Ernteertrag auswirken⁶. Es hat sich gezeigt, dass die Identifizierung und Verwendung resistenter Pflanzen die Resistenz verbessern und den Ertragsverlust verringern kann. Resistente Sorten wurden in vielen Pflanzenarten wie Mais, Weizen, Reis und Sorghum identifiziert, indem die Pflanzen mit einem Pflanzenpathogen impfen und für resistente Linien⁷ausgewählt wurden. Daher würde die Entwicklung und Verwendung einer effizienten Impfmethode es ermöglichen, viele Pflanzen zu impfen und auf Resistenzen zu überprüfen. Verschiedene Impfmethoden wurden verwendet, einschließlich Tauchimpfung, Pipettierung der Pathogenzellsuspensionskultur in den Wirbel der Pflanze, und Nadelinjektionsimpfung^8-11. Bei jeder Methode muss der Erreger zuverlässig zwischen den Pflanzenblättern eingeschleppt werden, wo der Erreger durch die Bildung von Appresorie in die Pflanze gelangt, um die Entwicklung von Krankheitserregern und eine Pflanzeninfektion zu gewährleisten^12,13.

Die Dip-Impfmethode beinhaltet das Eintauchen einer Pflanzensämling in eine Pathogenzellsuspensionskultur, während die Pipettiermethode erfordert, die Krankheitserregern-Zellsuspensionskultur in den Wirbel des Pflanzensämlings zu legen. Es gibt jedoch Probleme mit beiden Methoden. Erstens hängen beide Methoden von der natürlichen Bewegung des Erregers von der Blattoberfläche in das sehr variabel emittische Gewebe ab. Die meisten Krankheitserreger gelangen auf natürliche Weise durch stomataale Öffnungen oder Wunden auf der Pflanzenblattoberfläche in die Pflanze. Es gibt jedoch erhebliche Variabilität in der Fähigkeit der Krankheitserreger, die Pflanzenblattoberfläche durch die Stomata und/oder Wunden auf der Blattoberfläche zu durchdringen. Daher kann die Durchdringung von Krankheitserregern nicht mit einer der beiden Impfmethoden kontrolliert werden, die möglicherweise zu inkonsistenten Daten führen. Zweitens kann das Eintauchen der Sämlinge in eine Pathogenzellsuspensionskultur zeitaufwändig sein und die Anzahl der Pflanzen begrenzen, die gesiebelt werden können. Umgekehrt liefert das hier beschriebene Nadelinjektionsimpfungsprotokoll die Pathogenzellsuspensionskultur zwischen den Pflanzenblättern, die die Bildung von Appressadeia¹⁴erleichtert. Der Erreger nutzt dann die neu entwickelte Appressade, um in die Pflanze einzudringen, um das Problem der Pathogenpenetration zu beseitigen. Zusätzlich bietet das Nadelinjektions-Impfprotokoll eine Reihe von Phänotypen für Mais- und Teosintenpflanzen, die mit U. Maydis geimpft wurden und eine gute Infektion nachweisen. Die Phänotypen können als Marker verwendet werden, um die beste Konzentration für die Pathogenzellsuspensionskultur zu bestimmen, was zu konsistenten pflanzenphänotypen innerhalb und zwischen verschiedenen Experimenten führt.

Nach der Pflanzenimpfung mit einer Pathogenzellsuspensionskultur werden Pflanzen in der Regel gesiescreent, um einen resistenten oder anfälligen Phänotyp^8-11,15zu erkennen. Während Krankheitsbewertungsskalen ausgiebig verwendet wurden, um Pflanzenphänotypen zu untersuchen und zu klassifizieren, unterscheiden sich die Bewertungsskalen je nach analysiertem Erreger. Daher kann eine Krankheitsbewertungsskala Protokoll Einrichtung für U. Maydis und Mais Wechselwirkungen für ähnliche Pilzerreger verwendet werden¹⁶.

Die vorliegende Reihe von Protokollen beschreibt die Nadelinjektionsimpfung mit einer U. Maydis-Zellsuspensionskultur und dem Krankheitsresistenz-Reaktionsscreening von Mais-, Teosinat- und Mais x Teosinte-Introgressionslinien. Die vorliegenden Protokolle beschränken sich nicht auf die Nadelinjektionsimpfung von U. maydis in Maispflanzen, sondern können für relativ alle Pilzpathogene und Pflanzenarten verwendet werden. Daher wird die Einbeziehung der Einzelheiten beider Methoden in ein und demselben Protokoll es den Forschern ermöglichen, die Protokolle für die Impfung und das Screening direkt zu nutzen oder die ursprünglichen Protokolle zu manipulieren, um den Pathogen und die Pflanzenarten besser in das Interesse von Pflanzen zu passen.

Protokoll

1. Wachstum von Pflanzenmaterial

1. Wählen Sie Anlagenlinien für Dieinokulation und Siebung aus. Für diese Arbeit wurden zwei Maislinien, fünf Teosintenlinien und vierzig Maisx-Teosintenlinien mit uncharakterisierter Resistenz gegen U. Maydis verwendet (Tabelle 1).
2. Pflanzensamen für experimentelle(U. maydis Injektion) und Kontrolle (Wasserinjektion) Nadelinjektion Impfexperimente. Tun Sie dies für jede Anlagenlinie.
3. Pflanzen Sie vier Samen (Replikationen) für jede Pflanzenlinie in kleinen Wohnungen, indem Sie die Samen etwa 1/2 Zoll mit dem Finger in den Boden schieben und leicht mit Erde bedecken (Abbildungen 1A und 1B). Den Boden nicht über den Samen verpacken. Das Tieferanpflanzen oder das Verpacken des Bodens über das Saatgut kann Probleme mit der Entstehung des Sämlings verursachen.
4. Gießen Sie die Samen in den Boden. Stellen Sie sicher, dass der Boden eingeweicht ist und die Samen nach dem Gießen unter dem Boden bleiben.
5. Legen Sie die Pflanzen nach der Bewässerung in eine Wachstumskammer mit Tages- und Nachtumgebungen von 28/20 °C Temperatur bzw. 14/10 Hr Photoperioden bzw. ca. 500 mol/m² sec   photosynthetisch aktive Strahlungen an der Spitze des Vordachs. Halten Sie die relative Luftfeuchtigkeit während des Tages und der Nacht bei ca. 70% bzw. 90%.
6. Halten Sie alle Pflanzen in der gleichen Wachstumskammer, um eine Wachstumsumgebung zu erhalten, die über das Experiment kongruent ist.
7. Nach 10 Tagen, entfernen Sie die Pflanzen aus der Wachstumskammer und impfen Sie die Pflanzen mit der U. Maydis Zellsuspensionskultur mit einer NadelinjektionImpfmethode. Hinweis: Maispflanzen können 7 Tage nach der Pflanzung geimpft werden^8-10. Allerdings sind die Teosintenpflanzen nach 7 Tagen zu klein. Daher impfen Sie sowohl Mais- als auch Teosintenpflanzen 10 Tage nach der Pflanzung für Konsistenz innerhalb des Experiments (siehe Schritt 2.12).

2. Nadelinjektionsimpfung

1. Arbeiten Sie alle in einer laminaren Durchflusshaube. Entfernen U. Maydis Glycerin Bestände aus Gefriertruhen Lagerung. Verwenden Sie eine sterile Schleife und Streifen Glycerin Bestände von U. Maydis Wild-Typ Stämme 1/2 (Paarung Typ a1b1) und 2/9 (Paarung Typ a2b2, nahe isogen bis 1/2) auf Kartoffel dextrose Agar (PDA) Platten. Pflegen Sie Stämme separat.
2. PDA-Platten mit U. Maydis zwei Tage lang in einen 30 °C-Inkubator stellen. Bei Verwendung eines anderen biotrophen Erregers verwenden Sie die entsprechenden Stamm-, Medien- und Wachstumsbedingungen. Überwachen Sie das Wachstum des Erregers über den Zeitraum von zwei Tagen, um sicherzustellen, dass der U. Maydis-Stamm gut wächst.
3. Entfernen Sie die PDA-Platten nach zwei Tagen aus dem Inkubator. Die Platten sollten ein gutes Pathogenwachstum haben und einzelne Kolonien enthalten (Abbildung 2A). Es ist wichtig, einzelne Kolonien zu erhalten. Wenn keine einzelnen Kolonien vorhanden sind, werden die Platten mit einer niedrigeren Konzentration umgestreift.
4. Erledigen Sie die ganze Arbeit in einer laminaren Strömungshaube. Verwenden Sie einen sterilen Zahnstocher, um eine einzelne Kolonie für jeden Stamm aus den PDA-Platten auszuwählen. Legen Sie den Zahnstocher mit einer einzigen Kolonie in eine 3 ml Kartoffeldextrosebrühe (PDB). Es wird empfohlen, 2-3 Kulturen zu haben.
5. Die 3 ml PDB-Kulturen zwei Tage lang bei 200 Umdrehungen pro Minute in einen 30 °C-Inkubator/Shaker geben. Überwachen Sie das Wachstum der Kultur während des zweitägigen Zeitraums, um das Wachstum der Kultur zu gewährleisten. Die Kultur sollte sehr wolkig erscheinen.
6. Entfernen Sie die flüssigen Kulturen aus dem Inkubator/Shaker und messen Sie die Konzentration bei OD_600, um sicherzustellen, dass die Zellen auf eine OD von 1,0 (ca. 1 x 10⁷ Zellen/ml)¹⁷angebaut wurden.
7. Bringen Sie die U. Maydis-Zellsuspensionskulturen auf eine Endkonzentration von 1 x 10⁶ Zellen/ml, mit Wasser in einem endgültigen 30 ml Kulturvolumen. Diese Konzentration führt konsequent zu einer guten Infektion der Pflanzen mit der Pathogenzellsuspensionskultur. ¹⁷

Hinweis: Bei Verwendung verschiedener Pathogenstämme sollten verschiedene Zellsuspensionskonzentrationen getestet werden, um den für die Impfung erforderlichen Zelltiter zu bestimmen^18,19. Die gegebene Endkonzentration für die Zellsuspensionskultur kann als Ausgangspunkt für das Tittering verwendet werden. Die entsprechende Konzentration der Pathogenzellsuspensionskultur sollte durch Visualisierung der Pflanzenphänotypen mit guter Infektion überprüft werden (Abbildungen 3A-E).

8. Mischen Sie gleiche Volumina der beiden U. Maydis-Stämme vor der Impfung. Wenn Sie einen Krankheitserreger verwenden, fahren Sie mit Schritt 2.9 fort. Bereiten Sie frische U. Maydis-Zellsuspensionskulturen für jedes Impfexperiment vor und entsorgen Sie Zellsuspensionskulturen nach zwei Tagen.
9. Für die experimentelle Nadelinjektionsimpfung eine 3 ml Spritze mit der Us-Zellsuspensionskultur füllen, indem Sie die Zellsuspensionskultur in die Spritze ziehen.
10. Für die Steuernadelinjektionsimpfung eine 3 ml Spritze mit Wasser¹⁷füllen. Verwenden Sie das gleiche Verfahren für die experimentelle Nadelinjektionsimpfung.
11. Befestigen Sie eine 0,457 mm x 1,3 cm hypodermische Nadel am Ende jeder 3 ml Spritze. Die gewählte Nadelgröße liefert die Zellsuspensionskultur zwischen den Pflanzenblättern mit minimalen Schäden am Pflanzengewebe.
12. Entfernen Sie die Versuchs- und Kontrollpflanzen 10 Tage nach der Pflanzung in Vorbereitung auf Nadelinjektionsimpfungen(Abbildung 2B) (siehe Schritt 1.7).
13. Setzen Sie die hypodermische Nadel mit der U. maydis-Zellsuspensionskultur vorsichtig in den Stamm einer Versuchspflanze in einem 90°-Winkel knapp über der Bodenlinie ein. Setzen Sie die Nadel ein, bis sie sich in der Mitte des Stiels befindet. Drücken Sie die Nadel nicht durch den Stiel (Abbildung 2C).
14. Injizieren Sie die Versuchspflanze mit ca. 100 l der U. Maydis-Zellsuspensionskultur ^18,19. Dies variiert je nach Höhe des Sämlings leicht. Die Zellsuspensionskultur wird durch den Stamm drücken und in den Wirbel der Pflanze bewegen. Die Zellsuspensionskultur wird im Wirbel der Pflanze sichtbar sein. In jede einzelne Pflanze spritzen Sie weiterhin 100 l der Zellsuspensionskultur, bis die 3 ml Spritze leer ist.
15. Entfernen Sie nach der Injektion die Nadel vorsichtig aus dem Pflanzenstamm. Entfernen Sie die Nadel aus der nun leeren 3 ml Spritze und füllen Sie sie mit Wasser. Befestigen Sie die Nadel wieder an der Spritze und drücken Sie das Wasser durch die Nadel, um Pflanzengewebe zu entfernen, das in der Nadelspitze gefangen werden kann.
16. Wiederholen Sie die Schritte 2.9-2.15 für jede Versuchspflanze. Folgen Sie dem gleichen Protokoll für die Kontrollanlagen, indem Sie Wasser injizieren.
17. Legen Sie die geimpften Versuchs- und Kontrollpflanzen wieder in die Wachstumskammer. Gießen Sie die Pflanzen täglich, indem Sie den Boden und nicht das Pflanzengewebe benetzen.
18. Überprüfen Sie die Pflanzen täglich, um die Entwicklung von Krankheitserregern und Pflanzenresistenzreaktionen zu erkennen.

3. Widerstandsreaktions-Screening

1. Erfassen und erfassen Sie die Widerstandsreaktionen für jede Pflanze 7, 10, 14 und 21 Tage nach der Inokulation (dpi) mit einer Widerstandsreaktionsskala von 1 bis 5. Der Schweregrad der Erkrankung nimmt mit der Erhöhung der numerischen Werte auf der Bewertungsskala zu (Tabelle 2). A 1C (Blattchlorose), 1A (Blatt-Anthocyan-Produktion) oder 2 (kleine Blattgallen) Widerstandsreaktion zeigt Widerstand. A 3 (Stammgallen), 4 (Basalgalle) oder 5 (Pflanzentod) Widerstandsreaktion zeigt Anfälligkeit (Abbildungen 3A-E und Tabelle 2)^18,19.
2. Bewerten Sie sowohl Versuchs- als auch Kontrollpflanzen und zeichnen Sie Widerstandsreaktionswerte auf.
3. Vergleichen Sie die Widerstandsreaktionen der Versuchs- und Kontrollanlagen. Wählen Sie Versuchspflanzen mit einer Widerstandsreaktionsbewertung von 1C, 1A oder 2 aus. Diese Pflanzen gelten als resistent gegen U. maydis^18,19.
4. Wiederholen Sie das gesamte Experiment, um die Pflanzlichen Phänotypen zu verifizieren.

Ergebnisse

Eine erfolgreiche Nadelinjektionsimpfung kann durch Visualisierung des Phänotyps der mit U. maydis (experimentell) geimpften Pflanzen bestimmt werden. Die meisten Versuchspflanzen waren anfällig für U. Maydis-Infektionen. Die anfälligen Pflanzen zeigten eine sehr schwere Krankheitsentwicklung, die durch Stamm- und Basalgallenbildung mit schwarzen Teliosporen nachgewiesen wurde (Abbildungen 3D und 3E, Tabelle 2). Mehrere Pflanzen waren nach der Impfu...

Diskussion

In dieser Studie war die Nadelinjektionsimpfungsmethode, mit der ein Stamm von U. Maydis in den Stamm von 700 Mais- und Teosintenpflanzen geliefert wurde, erfolgreich. Zusätzlich wurde eine überarbeitete Seuchenresistenz-Bewertungsskala verwendet, um die Pflanzen zu untersuchen und die Entwicklung von Krankheitserregern zu erkennen. Als Ergebnis der Verwendung beider Methoden wurden Pflanzenlinien, die gegen U. Maydis resistent sind, unter 700 Mais- und Teosintenpflanzen identifiziert, die nun kombini...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seed for plants			Collected from original crosses
Growth chamber	Conviron	PGR14 REACH-IN
Planting flats	Hummert International	14-3385-2
Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite)	Hummert International	10-1059-2
Laminar flow hood	Lab Conoco	70875372
Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest			Stocks were grown from original culture
Sterile loop	Fisher Scientific	S17356A
Potato dextrose agar (PDA) plates	Fisher Scientific	R454311
Incubator set to 30 °C	Fisher Scientific	11-690-650F
Sterile toothpicks	Walmart		Purchased from Walmart and sterilized by autoclave
Potato dextrose broth (PDB)	Fisher Scientific	ICN1008617
Incubator-shaker set to 30 °C	New Brunswick	14-278-179
Spectrophotometer	Fisher Scientific	4001000
U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml)			Grown from glycerol stock as described in the methods
3 ml Syringes	Becton Dickinson	309606
.457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles	Kendall Brands	8881250321