トウモロコシとテオシンテ線における ウスチラゴ の病原性を評価するための迅速かつ効率的な方法

要約

メズおよびテオシンテ植物を生物栄養病原体 ウスチラゴメイディス で接種する注射法の使用について説明する。 針注射接種方法は、病原体がアプリソリアの形成を通じて植物に入る植物葉の間の真菌病原体の制御された送達を促進する。この方法は非常に効率的で 、U.maydisで再現可能な接種を可能にします。

要約

トウモロコシは世界中の主要な穀物作物です。しかし、生物栄養病原体に対する感受性は、生産性を高めるための主要な制約である。 U.maydis は、トウモロコシの生物栄養真菌病原体およびトウモロコシスムートの因果剤である。この病気は、米国で年間約10億ドルの著しい収量損失を引き起こします¹ 作物の回転を含むいくつかの方法, 殺菌剤の適用と種子治療は、現在、トウモロコシのスマットを制御するために使用されています^2.しかし、ホスト抵抗は、トウモロコシスマットを管理するための唯一の実用的な方法です。種々の生物栄養病原体に耐性のあるトウモロコシ、小麦、米などの作物植物の同定は、毎年^3〜5の収量損失を著しく減少させている。したがって、植物葉間で病原体を効率的かつ再現的に送達する病原体接種方法を用いることは 、U.maydisに耐性のあるトウモロコシ株の迅速な同定を容易にするであろう。として 、U.maydisに耐性のあるトウモロコシラインを識別するための第一歩として、ニードル注射接種法および抵抗反応スクリーニング方法を利用して、トウモロコシ、テオシンテ、トウモロコシxテオシンテイントログレスラインを U.maydis 株で接種し、耐性植物を選択した。

トウモロコシ、テオシンテ及びトウモロコシxテオシンテ内線は、約700の植物からなる、植え付け 、U.maydisの株で接種し、抵抗性をスクリーニングした。接種およびスクリーニング方法は 、U.maydisに耐性のある3つのテオシンテ線を同定することに成功した。ここでは、トウモロコシ、テオシンテ、及びトウモロコシxテオシンテイントログレスラインの詳細な注射接種及び抵抗反応スクリーニングプロトコルが提示される。この研究は、針注射接種が植物の葉の間に U.maydis を効率的に供給できる農業における貴重なツールであり、現在組み合わせることができ、改善された疾患耐性のための繁殖プログラムでテストすることができる U.maydis に耐性のある植物ラインを提供していることを示しています。

概要

植物の真菌病は、農業に対する最も重要な脅威の1つを表しています。世界人口の増加に伴い、食のニーズが高まる中、耐病性の向上を伴う作物の開発が必要とされています。植物病原体は自然に作物収量に悪影響を与える疾患を引き起こすフィールドの作物植物に感染^{する 6}.耐性植物を同定し、利用することは抵抗を改善し、収量損失を減少させることができることが示されている。植物病原体を植物に接種し、耐性ライン⁷を選択することにより、トウモロコシ、小麦、米、ソルガムを含む多くの植物種において耐性品種が同定されている。したがって、効率的な接種方法の開発と使用は、多くの植物を接種し、抵抗性のためにスクリーニングすることを可能にするであろう。浸入接種、病原体細胞懸濁培養を植物の渦にピペット化、注射注射^8~11の注射など様々な接種方法が用いられている。各方法を用いて、病原体は、病原体の発達と植物感染^を確実に行うために、アプレソリアの形成を通じて植物に入る植物葉の間に確実に導入されなければならない。

浸潤接種法は、植物苗を病原体細胞懸濁培養物に浸入することを含み、ピペット法では病原体細胞懸濁液を植物苗の渦に入れる必要がある。ただし、両方の方法に問題があります。第一に、どちらの方法も、葉表面から植物組織への病原体の自然な動きに依存する。ほとんどの病原体は、自然に植物の葉表面に口孔や傷を介して植物に入ります.しかし、植物の葉表面を通して植物葉表面を貫通する病原体能力や葉表面の創傷には大きなばらつきがある。したがって、病原体の浸透は、いずれの接種方法でも制御できず、データの一貫性がなくなる可能性があります。第二に、多数の植物をスクリーニングする場合、苗を病原体細胞懸濁培養物に浸すと時間がかかり、スクリーニングできる植物の数を制限する可能性がある。逆に、本明細書に記載の針注射接種プロトコルは、アプレッサリア¹⁴の形成を促進する植物葉間の病原体細胞懸濁培養を送達する。病原体は、次に、新たに開発されたアプレッサリアを利用して、病原体の侵入問題を排除する植物に入ります。さらに、針注射接種プロトコルは、メイズおよびテオシンテ植物に対して 、U.maydis を接種し、良好な感染を示す様々なフェノタイプを提供する。この表現型は、異なる実験内および実験間で一貫した植物表現型をもたらす病原体細胞懸濁液培養に最適な濃度を決定するためのマーカーとして使用することができる。

病原体細胞懸濁液培養による植物接種後、植物は通常^、8-11,15の耐性または感受性表現型を検出するためにスクリーニングされる。疾患評価尺度は植物の型をスクリーニングし、分類するために広く使用されているが、評価尺度は分析される病原体によって異なる。したがって、 米国メイディス およびトウモロコシ相互作用に対する疾患評価尺度プロトコル確立は、同様の真菌病原体¹⁶に利用することができる。

本シリーズのプロトコルは、 メイ ズ細胞懸濁液培養およびトウモロコシ、テオシンテ、およびトウモロコシxテオシンテイントログレスラインの疾患耐性反応スクリーニングによる針注射接種を詳述している。本プロトコルは、トウモロコシ植物への U.maydis の注射の針に限定されるものではなく、比較的あらゆる真菌病原体および植物種に利用することができる。したがって、同じプロトコルに両方の方法の詳細を含めると、研究者は接種とスクリーニングのためのプロトコルを直接利用したり、元のプロトコルを操作して目的の病原体および植物種により適合することができます。

プロトコル

1. 植物材料の成長

1. 接種とスクリーニングのための植物ラインを選択します。この作業には、2つのトウモロコシライン、5つのテオシンテライン、および40のトウモロコシxテオシンテ線が、この作業に使用された。
2. 実験用植物種子(U.maydis 注射)および制御(水注入)針注入接種実験。各プラントラインに対してこれを行います。
3. 小さなフラットに各植物ラインの4つの種子(複製)を植える指で約1/2インチの種子を土に押し込み、軽く土で覆う(図1Aと 1B)。土を種の上に詰めないでください。種を深く植えたり、種の上に土を詰め込んだりすると、苗の出現に問題が生じる可能性があります。
4. 種子を土に水を入れます。土壌が浸され、種子が水を浸した後も土壌の下に残っていることを確認してください。
5. 水をやった後、昼と夜の環境で植物を配置し、昼と夜の環境は28/20°Cの温度と14/10時間の光周期、キャノピーの上部に約500 μmol/m²秒   の光合成活性放射線。昼夜の相対湿度を、それぞれ約70%と90%に保つ。
6. すべての植物を同じ成長室に保管して、実験全体で一致する成長環境を維持します。
7. 10日後、成長チャンバーから植物を取り出し、針注射接種法を用いて U.maydis 細胞懸濁液培養で植物を接種する。注:トウモロコシ植物は^{、植え8-10}の7日後に接種することができます。しかし、テオシンテ植物は7日後には小さすぎる。したがって、実験内で一貫性を保つため、植え付けの10日後にトウモロコシとテオシンテ植物の両方を接種する(ステップ2.12参照)。

2. 針注射接種

1. すべての作業は、ラミナーフローフードで行います。冷凍庫の貯蔵から U.メイディス グリセロールストックを除去します。ジャガイモのブドウ糖アガー(PDA)プレートに、無菌ループおよびストリークグリセロールストックを 使用して、野生 型菌株1/2(交配型a1b1)と2/9(交配型a2b2、アイソジェニックに近い1/2)を使用します。株を別々に維持します。
2. PDAプレートを30°Cインキュベーターに 2日間、U.maydis で縞に入れてください。異なる生物栄養病原体を使用する場合は、適切な株、培地および成長条件を使用する。2日間の病原体の成長を監視して 、U.maydis 株が良好に成長していることを確認します。
3. 2日後にインキュベーターからPDAプレートを取り出します。プレートは、良好な病原体の成長を有し、単一のコロニーを含む必要があります (図 2A).単一のコロニーを得ることが重要です。単一コロニーが存在しない場合は、より低い濃度でプレートを再縞する。
4. ラミナーフローフードですべての作業を行います。PDAプレートから各株のための単一のコロニーを選択するために無菌爪楊枝を使用してください。1つのコロニーを含む爪楊枝を3mlポテトデキストローススープ(PDB)に入れる。2-3の文化を持つことをお勧めします。
5. 3ml PDB培養物を30°Cインキュベーター/シェーカーに200rpmで2日間置きます。2日間の培養の成長を監視し、文化の成長を確実にします。カルチャは非常に曇っているように見えるはずです。
6. インキュベーター/シェーカーから液体培養液を取り出し_、OD600で濃度を測定し、細胞が1.0(〜1 x 10⁷細胞/ml)のODに成長したことを確認した。
7. U.maydis細胞懸濁液培養液を、最終的な30ml培養量の水を使用して、1 x 10⁶細胞/mlの最終濃度に持ち込みます。この濃度は、一貫して病原体細胞懸濁液培養で植物の良好な感染をもたらす。¹⁷

注: 様々な細胞懸濁液濃度は、接種に必要な適切な細胞の標的を決定するために異なる病原体株を使用する場合にテストする必要があります^18,19.細胞懸濁液培養に対する与えられた最終濃度は、ちらつきの出発点として使用することができる。病原体細胞懸濁液培養の適切な濃度は、良好な感染を有する植物表現型を可視化することによって検証されるべきである(図3A-E)。

8. 接種前に2つの U.の 同量を混合する。1つの病原菌株を使用する場合は、ステップ2.9に進む。各接種実験に対して新鮮な U.maydis 細胞懸濁液培養液を調製し、2日後に細胞懸濁培養を廃棄する。
9. 実験的な注射接種のために、細胞懸濁液培養液を注射器に引き込み 、U.maydis 細胞懸濁液で3mlシリンジを充填する。
10. 制御針注射接種の場合、3mlシリンジを水¹⁷で満たす。実験用注射接種に同じ手順を使用してください。
11. 各3 ml シリンジの端に0.457 mm x 1.3 cmの皮下注射針を取り付けます。選択された針のサイズは植物のティッシュへの最低の損傷と植物葉の間の細胞懸濁液の培養を提供する。
12. 注射の注射に備えて植え付けの10日後に成長室から実験および制御植物を取り除く(図2B)(ステップ1.7を参照)。
13. U.maydis細胞懸濁液培養液を含む皮下注射針を、土壌ラインのすぐ上の90°の角度で実験プラントの茎に慎重に挿入します。針が茎の真ん中に入るまで挿入します。針をステム(図2C)に押し込んではいかない。
14. 実験プラントに約100μlの U.maydis 細胞懸濁液培養^18,19を注入する。これは苗の高さによって若干異なります。細胞懸濁液は茎を押し通し、植物の渦に移動します。細胞懸濁液は、植物の渦中に見える。3 ml シリンジが空になるまで、各植物に細胞懸濁液培養液 100 μl を注入し続けます。
15. 注射後、慎重に植物茎から針を取り除きます。今空の3 mlシリンジから針を取り出し、水で満たします。針を注射器に戻し、針先に引っ掛かるかもしれない植物組織を取り除くために針を通して水を押します。
16. 各実験プラントについて、手順 2.9 ~2.15 を繰り返します。水を注入することにより、制御プラントの同じプロトコルに従ってください。
17. 接種した実験および制御プラントを成長室に戻します。植物組織ではなく土壌を湿潤させることによって植物に毎日水を与える。
18. 病原体の開発と植物抵抗反応を検出するために毎日植物をチェックしてください。

3. 抵抗反応スクリーニング

1. 1~5抵抗反応評価スケールを用いて、接種後(dpi)後の各植物の抵抗反応をスコア付けして記録します。格付けスケール上の数値が増加するにつれて疾患の重症度が増加する(表2)。1C(葉緑化)、1A(葉アントシアニン産生)、または2(小葉の胆汁)抵抗性反応は抵抗性を示す。A 3 (茎の胆汁)、4(基底胆汁)、または5(植物死)抵抗反応は感受性を示す(図3A-Eおよび表2)18,19。
2. 実験と制御植物の両方をスコアし、抵抗反応評価を記録します。
3. 実験プラントと制御プラントの抵抗反応を比較します。1C、1A、または2の抵抗反応評価を有する実験プラントを選択します。これらの植物は 、U.maydis^18,19に耐性であると考えられています。
4. 実験全体を繰り返して、植物の表向きを確認します。

結果

針注射の接種に成功した場合、U.maydis(実験)で接種された植物の表現型を可視化することによって決定することができる。実験植物の大部分は、U.maydis感染の影響を受けやすかった。この影響を受けやすい植物は、黒色の管門を有する茎および基底胆汁形成によって示される非常に重篤な疾患の発症を示した(図3Dおよび3E、表2)。いくつかの植...

ディスカッション

本研究では、700トウモロコシとテオシンテ植物の茎に U.maydis の株を送達するために使用される針注射接種方法が成功した。さらに、改訂された疾患耐性評価尺度を使用して、植物をスクリーニングし、病原体の発達を検出した。両方の方法を使用した結果 、U.maydis に耐性のある植物ラインが700トウモロコシとテオシンテ植物の間で同定され、現在は組み合わせることができ、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seed for plants			Collected from original crosses
Growth chamber	Conviron	PGR14 REACH-IN
Planting flats	Hummert International	14-3385-2
Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite)	Hummert International	10-1059-2
Laminar flow hood	Lab Conoco	70875372
Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest			Stocks were grown from original culture
Sterile loop	Fisher Scientific	S17356A
Potato dextrose agar (PDA) plates	Fisher Scientific	R454311
Incubator set to 30 °C	Fisher Scientific	11-690-650F
Sterile toothpicks	Walmart		Purchased from Walmart and sterilized by autoclave
Potato dextrose broth (PDB)	Fisher Scientific	ICN1008617
Incubator-shaker set to 30 °C	New Brunswick	14-278-179
Spectrophotometer	Fisher Scientific	4001000
U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml)			Grown from glycerol stock as described in the methods
3 ml Syringes	Becton Dickinson	309606
.457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles	Kendall Brands	8881250321