Быстрый и эффективный метод оценки патогенности Ustilago maydis на линиях кукурузы и teosinte

Резюме

Описано использование метода инъекций иглы для прививки растений кукурузы и тоозинта биотрофическим патогеном Ustilago maydis. Метод инъекции иглы облегчает контролируемую доставку грибкового патогена между листьями растений, где возбудитель попадает в растение через образование аппресории. Этот метод является высокоэффективным, что позволяет воспроизводиться прививки с U. maydis.

Аннотация

Кукуруза является одной из основных зерновых культур во всем мире. Однако восприимчивость к биотрофическим патогенам является основным препятствием для повышения производительности. U. maydis является биотрофическим грибком патогена и возбудителем кукурузной головни на кукурузе. Это заболевание несет ответственность за значительные потери урожайности около $ 1,0 млрд в год^{в США 1 Несколько методов, включая севооборот,} фунгицидов и семян лечения в настоящее время используются для контроля кукурузы^{головне 2}. Тем не менее, сопротивление хозяина является единственным практическим методом для управления кукурузной головне. Выявление сельскохозяйственных растений, включая кукурузу, пшеницу и рис, устойчивых к различным биотрофическим патогенам, значительно снизило потери урожайности^{ежегодно на 3-5.} Таким образом, использование метода прививки патогена, который эффективно и воспроизводимо доставляет патоген между листьями растений, будет способствовать быстрой идентификации линий кукурузы, которые устойчивы к U. maydis. Как, первый шаг к indentifying линии кукурузы, которые устойчивы к U. maydis, метод инокуляции инъекции иглы и метод скрининга реакции сопротивления был использован для прививки кукурузы, теозинта и кукурузы x теозинтных интрогрессионных линий с штаммом U. maydis и для выбора устойчивых растений.

Кукуруза, тоозинте и кукуруза х teosinte интрогрессии линий, состоящий из около 700 растений, были посажены, привиты штаммом U. maydis, и скрининг на устойчивость. Методы прививки и скрининга успешно определили три линии тоозинта, устойчивые к U. maydis. Здесь представлен подробный протокол скрининга инъекций иглы и реакции сопротивления для кукурузы, тоозинта и кукурузы x teosinte интрогрессионных линий. Это исследование показывает, что прививка от инъекций иглы является бесценным инструментом в сельском хозяйстве, который может эффективно доставить U. maydis между листьями растений и предоставил растительные линии, которые устойчивы к U. maydis, которые теперь могут быть объединены и протестированы в программах разведения для улучшения устойчивости к болезням.

Введение

Грибковые заболевания растений представляют собой одну из самых серьезных угроз сельскому хозяйству. Необходимость разработки сельскохозяйственных культур с повышением устойчивости к болезням возрастает в связи с потребностями в продовольствии растущего населения мира. Растительные патогены естественным образом инфицируют растениеводства в полевых условиях, вызывая заболевания, которые негативно влияют на урожайность^6. Было показано, что выявление и использование устойчивых растений может повысить устойчивость и уменьшить потерю урожайности. Устойчивые сорта были выявлены во многих видах растений, включая кукурузу, пшеницу, рис и сорго путем инокулирования растений с патогеном растений и выбора для устойчивых^{линий 7}. Таким образом, разработка и использование эффективного метода прививки позволили бы многим растениям быть привитыми и проверены на устойчивость. Различные методы прививки были использованы в том числе прививки падения, трубопроводов культуры подвески патогенных клеток в вихрь растения, и иглы инъекций^{прививки 8-11}. С каждым методом, патоген должен надежно быть введен между листьями растений, где патоген попадает в растение через образование аппресории для обеспечения развития патогена и^{инфекции растений 12,13}.

Метод прививки погружения включает погружение саженца растений в культуру подвески патогенных клеток, в то время как метод пипетки требует размещения культуры подвески патогенных клеток в вихрь саженца растений. Тем не менее, есть проблемы с обоими методами. Во-первых, оба метода зависят от естественного движения патогена от поверхности листа в ткань растения, которая является весьма переменной. Большинство патогенных микроорганизмов естественным образом попадают в растение через стоматальные отверстия или раны на поверхности листьев растений. Тем не менее, существует значительная изменчивость в способности патогенов проникать поверхности листьев растений через стомату и / или раны на поверхности листа. Таким образом, проникновение патогенов не может контролироваться ни с помощью метода прививки, потенциально приводящего к несовместимым данным. Во-вторых, при скрининге большого количества растений погружение саженцев в культуру подвески патогенных клеток может занять много времени и может ограничить количество растений, которые могут быть проверены. И наоборот, протокол прививки инъекций иглы, описанный в настоящем, обеспечивает культуру подвески патогенных клеток между листьями растений, способствуя образованию аппрессории^14. Затем возбудитель использует недавно разработанную аппрессорию для входа на завод, устраняя проблему проникновения патогенов. Кроме того, протокол прививки от инъекций иглы содержит ряд фенотипов для растений кукурузы и тозинта, которые были привиты U. maydis и демонстрируют хорошую инфекцию. Фенотипы могут быть использованы в качестве маркера для определения наилучшей концентрации для культуры подвески патогенных клеток, что приводит к последовательной фенотипов растений внутри и между различными экспериментами.

После прививки растений с культурой подвески патогенных клеток, растения, как правило, проверяются для обнаружения резистентного или восприимчивого^{фенотипа 8-11,15}. В то время как шкалы рейтинга заболеваний широко используются для проверки и классификации фенотипов растений, рейтинговые шкалы различаются в зависимости от анализируемого патогена. Таким образом, болезнь рейтинговой шкалы протокола создания для U. maydis и кукурузы взаимодействия могут быть использованы для аналогичных грибковых патогенов¹⁶.

В настоящей серии протоколов подробно иглы инъекции прививки с U. maydis клеточной подвески культуры и резистентности к болезням реакции скрининга кукурузы, тоозинта и кукурузы х teosinte интрогрессии линий. Нынешние протоколы не ограничиваются инъекцией иглы U. maydis в кукурузные растения, но могут быть использованы для относительно любого грибкового патогена и видов растений. Таким образом, включение деталей обоих методов в один и тот же протокол позволит исследователям непосредственно использовать протоколы для прививки и скрининга или манипулировать первоначальными протоколами, чтобы лучше соответствовать патогена и видов растений, представляющих интерес.

протокол

1. Рост растительного материала

1. Выберите линии растений для прививки и скрининга. Для этой работы были использованы две линии кукурузы, пять линий teosinte и сорок линий teosinte кукурузы x с нехарактекторизованной устойчивостью к U. maydis (таблица 1).
2. Семена растений дляэкспериментальных (U. maydis инъекций) и контроля (впрыска воды) иглы инъекций прививки экспериментов. Сделай это для каждой линии завода.
3. Завод четыре семена (реплицирует) для каждой линии растений в небольших квартирах, нажав семена около 1 / 2 дюйма в почву пальцем и покрытие почвой слегка(рисунки 1A и 1B). Не упаковывайте почву над семенем. Посадка семян глубже или упаковка почвы над семенами может вызвать проблемы с появлением рассады.
4. Поливать семена в почву. Убедитесь, что почва пропитана и семена остаются под почвой после полива.
5. После полива поместите растения в камеру роста с дневной и ночной средой 28/20 градусов по Цельсию и 14/10 часов фотопериодов, соответственно, и примерно 500^{ммоль/м 2 сек} фотосинтетично активных излучей   в верхней части навеса. Поддерживать относительную влажность днем и ночью примерно на уровне 70% и 90% соответственно.
6. Храните все растения в одной камере роста для поддержания среды роста, которая совпадает в ходе эксперимента.
7. Через 10 дней удалите растения из камеры роста и прививки растений с U. maydis клеточной культуры подвески с помощью метода прививки иглы инъекций. Примечание: Кукурузные растения можно привить через 7 дней после посадки^8-10. Тем не менее, теозинте растения слишком малы после 7 дней. Поэтому прививают как кукурузу, так и теозинте растения через 10 дней после посадки для консистенции в рамках эксперимента (см. шаг 2.12).

2. Прививка инъекций иглы

1. Делайте все работы в ламинарном капюшоне потока. Удалите запасы глицерола U. maydis из морозильной камеры. Используйте стерильную петлю и полосы глицерола запасов U. maydis дикого типа штаммов 1/2 (брачный тип a1b1) и 2/9 (брачный тип a2b2, вблизи изогенных до 1/2) на картофель декстроза агар (PDA) пластин. Поддерживайте штаммы отдельно.
2. Поместите КПК пластины полосатый с U. maydis в инкубаторе 30 градусов по Цельсию в течение двух дней. При использовании другого биотрофического патогена используйте соответствующие условия деформации, мультимедиа и роста. Мониторинг роста патогена в течение двух дней, чтобы убедиться, что штамм U. maydis растет хорошо.
3. Удалите КПК пластины из инкубатора через два дня. Пластины должны иметь хороший рост патогенов и содержать одиночные колонии(рисунок 2A). Важно получить одиночные колонии. Если одиночные колонии не присутствуют restreak плиты на более низкой концентрации.
4. Делайте всю работу в ламинарный капюшон потока. Используйте стерильную зубочистку, чтобы выбрать одну колонию для каждого штамма из КПК пластин. Поместите зубочистку, содержащую одну колонию, в 3 мл картофельного бульона декстрозы (PDB). Рекомендуется иметь 2-3 культуры.
5. Поместите 3 мл культур PDB в инкубатор/шейкер по 30 градусов по Цельсию в течение двух дней при 200 об/мин. Мониторинг роста культуры в течение двух дней, чтобы обеспечить рост культуры. Культура должна выглядеть очень облачно.
6. Удалите жидкие культуры из инкубатора/шейкера и измерьте концентрацию в OD_600, чтобы убедиться, что клетки были выращены в OD 1,0 (1 х 10⁷ клеток/мл)¹⁷.
7. Довнесите культуры подвески клеток U. maydis до окончательной концентрации 1 x 10⁶ клеток/мл, используя воду в окончательном объеме культуры 30 мл. Эта концентрация последовательно приводит к хорошей инфекции растений с культурой подвески патогенных клеток. ^{17 Лет}

Примечание: Различные концентрации клеточной суспензии должны быть проверены при использовании различных штаммов патогенов, чтобы определить соответствующий клеточный цитер,^{необходимый для прививки 18,19}. Учитывая окончательную концентрацию для культуры подвески клеток могут быть использованы в качестве отправной точки для хихикать. Соответствующая концентрация культуры суспензии патогенных клеток должна быть проверена путем визуализации фенотипов растений с хорошейинфекцией (рисунки 3A-E).

8. Смешайте равные объемы двух штаммов U. maydis до прививки. При использовании одного патогенного штамма переходите к шагу 2.9. Подготовка свежих культур подвески клеток U. maydis для каждого эксперимента по прививке и отбрасывание культур клеточной суспензии через два дня.
9. Для экспериментальной прививки инъекций иглы заполните шприц 3 мл культурой подвески клеток U. maydis, внося культуру подвески клеток в шприц.
10. Для прививки инъекций контрольной иглы заполните 3 мл шприца водой^17. Используйте ту же процедуру для экспериментальной инъекции иглы прививки.
11. Прикрепите подкожной иглой 0,457 мм х 1,3 см к концу каждого 3 мл шприца. Выбранный размер иглы доставит культуру подвески клетки между листьями завода с минимальным повреждением к ткани завода.
12. Удалите экспериментальные и контрольные установки из камеры роста через 10 дней после посадки в рамках подготовки к прививкам от инъекций иглы(рисунок 2B)(см. шаг 1.7).
13. Аккуратно вставьте подкожные иглы, содержащие U. maydis клеточной культуры подвески в стебель экспериментального растения под углом 90 "чуть выше линии почвы. Вставьте иглу, пока она находится в середине стебля. Не проталкивать иглу через стебель(рисунок 2C).
14. Ввись экспериментальное растение с около 100 мкл U. maydis клеточной культуры^{подвески 18,19}. Это будет незначительно варьироваться в зависимости от высоты рассады. Культура подвески клеток проталкивает стебель и переходит в водоворот растения. Культура подвески клеток будет видна в водовороте завода. Продолжайте вводить 100 мкл культуры подвески клеток в каждое отдельное растение до тех пор, пока шприц 3 мл не опустеет.
15. После инъекции осторожно снимите иглу со стебля растения. Снимите иглу с теперь пустого 3 мл шприца и заполните водой. Прикрепите иглу обратно к шприцу и нажмите воду через иглу, чтобы удалить любые ткани растений, которые могут быть пойманы в кончик иглы.
16. Повторите шаги 2.9-2.15 для каждого экспериментального завода. Следуйте тому же протоколу для контрольных установок путем введения воды.
17. Поместите привитые экспериментальные и контрольные установки обратно в камеру роста. Вода растений ежедневно, смачивая почву не ткани растений.
18. Проверьте растения ежедневно, чтобы обнаружить развитие патогенов и реакции устойчивости растений.

3. Скрининг реакции сопротивления

1. Оценка и запись реакций сопротивления для каждого растения 7, 10, 14 и 21 дней после прививки (dpi) с использованием 1 до 5 рейтинг реакции сопротивления шкалы. Тяжесть заболевания увеличивается по мере увеличения численных значений по рейтинговой шкале(таблица 2). 1C (хлороз листьев), 1A (производство листьев антоциана), или 2 (малые листовые желчи) реакция сопротивления указывает на устойчивость. 3 (стволовые желчи), 4 (базальная желчь), или 5 (смерть растений) реакция сопротивления указывает на восприимчивость (Рисунки 3A-E и Таблица 2)^18,19.
2. Оценка как экспериментальных, так и контрольных установок и рекордные оценки реакции сопротивления.
3. Сравните реакции сопротивления экспериментальных и контрольных установок. Выберите экспериментальные установки с рейтингом реакции сопротивления 1С, 1A или 2. Эти растения считаются устойчивыми к U. maydis^18,19.
4. Повторите весь эксперимент, чтобы проверить фенотипы растений.

Результаты

Успешная инъекционная прививка иглы может быть определена путем визуализации фенотипа растений, привитых U. maydis (экспериментальный). Большинство экспериментальных растений были восприимчивы к инфекции U. Maydis. Чувствительные растения показали очень тяжелое развитие болезни, ?...

Обсуждение

В этом исследовании метод прививки инъекций иглы, используемый для доставки штамма U. maydis в стебель 700 растений кукурузы и тоозинта, был успешным. Кроме того, была использована пересмотренная шкала рейтинга устойчивости к болезням для проверки растений и выявления развития патоген...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Seed for plants			Collected from original crosses
Growth chamber	Conviron	PGR14 REACH-IN
Planting flats	Hummert International	14-3385-2
Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite)	Hummert International	10-1059-2
Laminar flow hood	Lab Conoco	70875372
Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest			Stocks were grown from original culture
Sterile loop	Fisher Scientific	S17356A
Potato dextrose agar (PDA) plates	Fisher Scientific	R454311
Incubator set to 30 °C	Fisher Scientific	11-690-650F
Sterile toothpicks	Walmart		Purchased from Walmart and sterilized by autoclave
Potato dextrose broth (PDB)	Fisher Scientific	ICN1008617
Incubator-shaker set to 30 °C	New Brunswick	14-278-179
Spectrophotometer	Fisher Scientific	4001000
U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml)			Grown from glycerol stock as described in the methods
3 ml Syringes	Becton Dickinson	309606
.457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles	Kendall Brands	8881250321