توصيف النظم المعقدة باستخدام تصميم التجارب النهج: عابر التعبير البروتين في التبغ كدراسة حالة

Summary

نحن تصف تصميم التجارب النهج التي يمكن استخدامها لتحديد ونمذجة تأثير العناصر التحوير التنظيمية والنمو والتنمية المعلمات النبات، وشروط الحضانة على التعبير عابرة من الاجسام المضادة والبروتينات مراسل في النباتات.

Abstract

توفر النباتات فوائد متعددة لإنتاج المستحضرات الصيدلانية البيولوجية بما في ذلك تكاليف منخفضة، والتدرجية، والسلامة. يقدم التعبير عابرة ميزة إضافية للتنمية قصيرة والأوقات الإنتاج، ولكن يمكن لمستويات التعبير تتفاوت تفاوتا كبيرا بين دفعات بالتالي مما أدى إلى مخاوف تنظيمية في سياق الممارسات التصنيعية الجيدة. استخدمنا تصميم التجارب (وزارة الطاقة) نهج لتحديد تأثير العوامل الرئيسية مثل العناصر التنظيمية في بناء التعبير ونمو النبات والمعلمات التنمية، وشروط الحضانة خلال التعبير، على تنوع التعبير بين دفعات. اختبرنا النباتات تعبر عن مكافحة فيروس نقص المناعة البشرية الأضداد وحيدة النسيلة نموذج (2G12) والبروتين علامة فلوري (DsRed). نناقش الأساس المنطقي لاختيار خصائص معينة من النموذج وتحديد حدودها المحتملة. يمكن بسهولة نقل النهج العام إلى مشاكل أخرى لأن مبادئ نموذج لإعادة على نطاق واسع للتطبيق: القائم على المعرفة اختيار المعلمة، والحد من التعقيد عن طريق تقسيم المشكلة إلى وحدات أصغر الأولية، وإعداد برامج موجهة لمجموعات التجربة الأمثل وتصميم خطوة حكيمة تكبير. وبالتالي، فإن منهجية مفيد لوصف البروتين التعبير في النباتات ولكن أيضا للتحقيق في الأنظمة المعقدة الأخرى التي تفتقر إلى وصف الآلية ليس فقط. المعادلات التنبؤية واصفا الترابط بين المعلمات يمكن استخدامها لإنشاء نماذج الآلي لأنظمة معقدة أخرى.

Introduction

إنتاج البروتينات الصيدلانية البيولوجية في النباتات هو مفيد لأن النباتات هي غير مكلفة لتنمو، ومنصة يمكن زيادتها فقط من خلال زراعة المزيد من النباتات، والكائنات الممرضة للإنسان غير قادر على تكرار ^1،2. استراتيجيات التعبير عابرة تستند على سبيل المثال على التسلل من الأوراق مع الأجرعية المورمة يوفر فوائد إضافية لأن يتم تقليل الوقت بين نقطة التسليم الحمض النووي وتسليم منتج تنقيته من سنة إلى أقل من 2 شهور ^3. يستخدم التعبير عابرة أيضا لتحليل وظيفي، على سبيل المثال لاختبار الجينات لقدرتها على استكمال الخسارة من وظيفة المسوخ أو للتحقيق تفاعلات البروتين ^4-6. ومع ذلك، ومستويات التعبير عابرة تميل إلى إظهار قدر أكبر من التباين دفعة إلى دفعة من مستويات التعبير في النباتات المعدلة وراثيا ^7-9. وهذا يقلل من احتمال أن عمليات التصنيع الصيدلانية البيولوجية على أساس عابر واي التعبيرليرة لبنانية تتم الموافقة عليها في سياق الممارسات التصنيعية الجيدة (GMP) لاستنساخ هو سمة الجودة الحرجة، ويخضع لتقييم المخاطر ^10. يمكن لمثل الاختلاف أيضا قناع أي التفاعلات التي تنوي الباحثين للتحقيق. لذلك، شرعنا في تحديد العوامل الرئيسية التي تؤثر على مستويات التعبير عابرة في النباتات وبناء ذات جودة عالية نموذج تنبؤي الكمي.

وغالبا ما يستخدم (OFAT) نهج عامل واحد في واحد في وقت لتوصيف تأثير (أثر) من بعض المعلمات (العوامل) على النتيجة (الاستجابة) من تجربة ^11. ولكن هذا هو الأمثل لأن الاختبارات الفردية (يدير) أثناء التحقيق (التجربة) سيتم محاذاة مثل اللؤلؤ على سلسلة عبر المنطقة المحتملة امتدت من العوامل التي يتم اختبارها (تصميم الفضاء). تغطية تصميم الفضاء، وبالتالي درجة المعلومات المستقاة من التجربة هومنخفضة، كما هو مبين في الشكل 1A ^12. علاوة على ذلك، يمكن أن الترابط بين عوامل مختلفة (عامل التفاعلات) لا تزال مخبأة مما أدى إلى نماذج الفقراء و / أو التنبؤ أوبتيما كاذبة، كما هو مبين في الشكل 1B ^13.

السلبيات المذكورة أعلاه يمكن تجنبها باستخدام تصميم التجارب (وزارة الطاقة) في النهج الذي تنتشر تشغيل من تجربة أكثر بالتساوي في جميع أنحاء تصميم الفضاء، وهذا يعني أن أكثر من عامل واحد وتتنوع بين اثنان أشواط ^14. هناك تصاميم المتخصصة لمخاليط، وفحص العوامل (تصاميم مضروب) والكميات من آثار عامل على الردود (أساليب السطح ردا على ذلك، RSM ق) ^15. علاوة على ذلك، RSMs يمكن أن تتحقق عن تصاميم المركزية مركب ولكن يمكن أيضا أن يتحقق على نحو فعال باستخدام البرمجيات المتخصصة التي يمكن أن تطبق معايير مختلفة لاختيار أشواط. على سبيل المثال، ما يسمى D-optimalitسوف ذ معيار تحديد أشواط ذلك لتقليل الخطأ في معاملات النموذج الناتج، في حين أن المعيار IV-المثالية يختار أشواط أن تحقيق أدنى التنبؤ التباين في جميع أنحاء تصميم الفضاء ^15،16. في RSM وصفنا هنا يسمح الكميات الدقيقة لبروتين تعبير عابر في النباتات، ولكن يمكن بسهولة أن يتم نقلها إلى أي نظام ينطوي عدة (~ 5-8) العوامل الرقمية (مثل درجة الحرارة والوقت والتركيز) وعدد قليل (~ 2 - 4) العوامل قاطعة (مثل المروج، لون) الذي وصف الآلية غير متوفرة أو معقدة للغاية في تصميم نموذج.

النهج زارة الطاقة نشأت في العلوم الزراعية ولكن قد انتشر إلى مناطق أخرى لأنها قابلة للتحويل إلى أي الحالة التي يكون فيها من المفيد للحد من عدد من يدير اللازمة للحصول على بيانات موثوقة وتوليد نماذج وصفية لعمليات معقدة. وهذا بدوره أدى إلى إدراج زارة الطاقة في "إرشادات لالصناعة، Q8 (R2) تطوير ادوية "الصادرة عن المؤتمر الدولي لمواءمة المتطلبات التقنية لتسجيل المستحضرات الصيدلانية للاستخدام البشري (ICH) ^17. يستخدم على نطاق واسع الآن زارة الطاقة في مجال البحث العلمي والصناعة ^18. ومع ذلك، يجب توخي الحذر خلال تخطيط وتنفيذ التجربة لاختيار درجة متعدد الحدود غير لائق لنموذج متعدد الانحدار الخطي (نموذج القاعدة) يمكن أن يعرض حاجة لأشواط إضافية لنموذج جميع الآثار عامل بشكل صحيح. وعلاوة على ذلك، تالفة أو مفقودة توليد نماذج البيانات غير صحيحة وخاطئة التوقعات، وربما حتى منع أي محاولة بناء نموذج كما هو موضح في البروتوكول والمناقشة أقسام ^18. في قسم البروتوكول، ونحن سوف تحدد في البداية من الخطوات الأكثر أهمية التخطيط للتجربة تستند RSM-ثم شرح التصميم على أساس وزارة الطاقة برامج DesignExpert V8.1، ولكن تصاميم مماثلة يمكن أن يبنى مع غيرها من البرمجيات includiنانوغرام أحزاب اللقاء المشترك، Modde، وSTATISTICA. يتم اتباع الإجراءات التجريبية حسب تعليمات لتحليل البيانات والتقييم.

الشكل 1. مقارنة OFAT وزارة الطاقة. A. تباين متتابعة من عامل واحد في وقت واحد (OFAT) في تجربة (الدوائر الأسود والأحمر والأزرق) يحقق التغطية المنخفضة من تصميم الفضاء (المناطق التي تحاك). في المقابل، فإن الاختلاف من أكثر من عامل واحد في وقت واحد باستخدام تصميم التجارب (وزارة الطاقة) استراتيجية (الدوائر الخضراء) يعزز التغطية وبالتالي دقة النماذج الناتجة عن ذلك. ب. التغطية المتحيزة تصميم الفضاء يعني أن التجارب OFAT (الدوائر السوداء) يمكن أن تفشل أيضا لتحديد مناطق التشغيل الأمثل (الحمراء)، والتنبؤ الحلول دون المستوى الأمثل (دائرة سوداء كبيرة)، في حين أن وزارة الطاقة strategiوفاق (النجوم السوداء) هم أكثر عرضة لتحديد الظروف الأفضل (نجمة سوداء كبيرة).

Protocol

1. التخطيط لاستراتيجية وزارة الطاقة

1. تحديد العوامل والاستجابات ذات الصلة لإدراجها في التصميم.
   1. تحديد واحد أو عدة استجابات للقياس. هنا، استخدمت 2G12 وDsRed مستويات التعبير (ميكروغرام / مل)، بما في ذلك الحد الأدنى للكشف الفرق تعتبر (10 و 20 ميكروغرام / لتر، على التوالي) ذات الصلة والقيمة التقريبية للانحراف المعياري المقدر للنظام (4 و 8 ميكروغرام / مل، على التوالي) على أساس التجارب السابقة.
   2. استخدام الأدب المتاحة، بيانات من التجارب السابقة أو التصاميم الفحص المتخصصة (مثل تصميم مضروب، راجع المقدمة) لتحديد العوامل الهامة التي تؤثر على الاستجابات سيتم كميا (الجدول 1) ^{7،8،19،20.}
   3. تخصيص أنواع عامل (رقمية أو قاطعة) وتحديد نطاقات داخل والتي سوف تكون متنوعة العوامل الرقمية أثناء التحقيق زارة الطاقة (الجدول 1).
   4. تحديد numeriج العوامل التي الاختلاف المستمر من الصعب تنفيذها.
      1. تجنب استخدام التباين المستمر للعوامل التي لا يمكن تعديلها على وجه التحديد إلى مستوى معين، ويمكن عادة أن يسيطر على سبيل المثال درجة حرارة الحضانة إلا في حدود ± 2 درجة مئوية، وبالتالي الاختلاف المستمر باستخدام قيم مثل 27.2 درجة مئوية، 25.9 درجة مئوية، و 29.3 ° C بد منه ينبغي تجنبها.
      2. بدلا من ذلك، حدد عدد من المستويات منفصلة عن هذه العوامل (الجدول 1). عدد المستويات يجب أن يطابق نموذج قاعدة المتوقعة (الخطوة 1.2). هذا هو المهم فقط للتصاميم الأمثل، لأن التصاميم مركب المركزية لديها دائما مستويات عامل منفصلة.
   5. تعيين ما إذا كان عامل قاطعة هو الاسمية، أي لا أمر ضمني (مثل شركات مختلفة)، أو ترتيبي وبالتالي معلمة رقمية منفصلة (مثل أوراق مختلفة على النبات).
   6. تحديد المستويات لكلا النوعين من العوامل قاطعة.
2. حدد نموذج قاعدة مفيدة.
   1. استنادا إلى التجارب الأولية والأدب، وتوقع العلاقة بين كل عامل والاستجابة وكذلك عامل التفاعلات والاستجابة. على سبيل المثال، وخطي (كلما كان ذلك أفضل)، من الدرجة الثانية (واحد الأمثل أو غير الخطية زيادة / نقصان) أو مكعب (الانحراف الأمثل).
   2. تأكد من أن عدد من المستويات للعوامل رقمية منفصلة هو ن + 1، ن مع كونها درجة متعدد الحدود للعلاقة بين العامل والاستجابة لها. على سبيل المثال، من المتوقع إذا كانت درجة حرارة أن يكون لها تأثير على استجابة من الدرجة الثانية، ن = 2 وبالتالي ينبغي التحقيق في ثلاثة مستويات على الأقل درجة الحرارة إلى تحقيق يصلح لتأثير من الدرجة الثانية.
3. تحديد جزء من مساحة التصميم (FDS) التي ينبغي أن يكون التباين التنبؤ دون عتبة معينة (مستوى ألفا). وينبغي أن يكون FDS> 0.95 (تغطية أكثر من 95٪ من مساحة التصميم) لتحقيق نماذج التنبؤات التي تحقق قوية في جميع أنحاءكامل ^21-23 تصميم الفضاء.
   ملاحظة: A عتبة 0.05 يتوافق مع مستوى الأهمية 5٪ (نوع الخطأ الأول) وقيمة نموذجية. زيادة هذه القيمة سوف يقلل من عدد من التجارب اللازمة لاستراتيجية وزارة الطاقة ولكن في نفس الوقت سيزيد من احتمال أن آثار كبيرة سيفتقد والتي من شأنها أن التقديرات تأثيرها على الاستجابة تكون غير صحيحة.

الجدول 1. العوامل المؤثرة عابرة التعبير البروتين في التبغ بما في ذلك الاختلاف يتراوح خلال وزارة الطاقة. العوامل في جريئة أدرجت فقط في تصميم التجارب وصفها تحت عنوان "نموذج وصفي لتراكم DsRed خلال التعبير عابرة باستخدام مختلف مروج / 5'UTRs" في حين أن العوامل بخط مائل أدرجت فقط في تصميم ل"أمثلية incubatioن الظروف وخطط الحصاد لإنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة في النباتات باستخدام التعبير عابرة ".

الشكل 2. ويتم اختيار عملية التخطيط زارة الطاقة. العوامل التي لها تأثير كبير على استجابة قيد التحقيق استنادا إلى البيانات المتاحة. ثم يتم تعيين سمات عامل (على سبيل المثال رقمية)، ونطاقات المستويات. وتستخدم المعرفة والتجارب السابقة لتحديد نموذج قاعدة مناسبة. يتم تعريف متطلبات الطاقة التنبؤية على أساس التطبيق / الغرض من النموذج النهائي. ويمكن بعد ذلك نقل البيانات تجميعها في برنامج وزارة الطاقة المناسبة.

2. إنشاء RSM في DesignExpert

1. بدء DesignExpert وحدد "تصميم جديد". في إطار "الاستجابة السطحية"، واختيار و# 34؛ الأمثل "وأدخل عدد من العوامل الرقمية وقاطعة المختارة في القسم 1.1).
2. إدخال أسماء عامل، وحدات، وأنواع، وأنواع فرعية، عدد من المستويات / الحدود والقيم لمستويات مستوى لجميع العوامل في الحقول المقابلة.
3. انتقل إلى الصفحة التالية وتحت عنوان "بحث" خيارات تحديد "أفضل" وكذلك "الأمثلية" المعيار المطلوب، هنا "D الأمثل".
4. في القائمة "تحرير نموذج ..."، حدد النموذج الذي يحتوي على العوامل والتفاعلات المتوقعة في القسم 1.2). كان غامضا، حدد نموذج كامل يغطي جميع العوامل والتفاعلات للحصول على درجة متعدد الحدود معينة، وهنا "من الدرجة الثانية". لاحظ أن اختيار نموذج كامل (تحتوي على جميع التفاعلات) يمكن أن تزيد من عدد من التجارب اللازمة لوزارة الطاقة.
5. حدد عدد من "كتل". هنا، تم استخدام كتلة واحدة لأنه تم من نفس الدفعة، كان قد تم زرعها جميع النباتات جميع البكتيريا في وقت واحد وونفذت كل من الحقن في نفس اليوم من قبل نفس المشغل. استخدام أكثر من كتلة واحدة إذا دفعة أكثر من واحد من النباتات المستخدمة أو عدة مشغلين التعامل مع الحقن.
6. تحقيق التوازن في التصميم
   1. تمكين "فرض التوازن قاطعة" من ​​أجل توزيع أشواط التجربة بالتساوي بين مستويات عامل قاطعة، مثل المروجين المختلفة التي يتم اختبارها.
      ملاحظة: هذا يمكن أن تقلل من المثالية من التصميم لدرجة أن DesignExpert سوف يقدم تقريرا كقيمة٪ اعتمادا على النقاط المحددة من قبل الخوارزمية المثالية.
   2. حساب تصميم عدة مرات باستخدام خوارزمية البذور عشوائي تنفيذها لتقليل الانخفاض في المثالية.
      ملاحظة: الخسائر في المثالية يمكن أن تتراوح بين 3-40٪ ~ باستخدام إدخال البيانات نفسها، ولكن تغيير يمكن استخدام عدد من مكررات للحفاظ على التوازن قاطعة.
7. سوف يقترح البرنامج قيمة لعدد من "النقاط الموديل" استنادا إلى نموذج قاعدة، وهنا 70 أشواط. ضبط عدد أشواط ل "يعيد" و "لتقدير عدم وجود تناسب" لضمان أنها> 5٪ من عدد "النقاط الموديل" لكل، وهنا 10 أشواط لكل منهما.
8. انتقل إلى الصفحة التالية، حدد عدد من الردود وإدخال أسماء وحدات. ويمكن أيضا ردود إضافية تضاف في أي وقت خلال تقييم البيانات دون أي تأثير سلبي على التصميم.
9. مواصلة لبدء الخوارزمية، حساب مستويات عامل للتشغيل من وزارة الطاقة. إذا لا قاعدة نموذجية مختارة تتناسب مع عدد من المستويات لعامل معين، وسوف يتم عرض الإخطار وسوف يتم تشغيل الحساب. في هذه الحالة إما:
   1. زيادة عدد المستويات لهذا العامل؛ أو
   2. إلغاء تحديد المصطلحات في نموذج القاعدة التي لا يمكن أن يحسب على أساس العدد الحالي من المستويات.
   3. على سبيل المثال، إذا كان هناك مستويين لعامل "الوقت الحضانة" ر (أي 2 د و 5 د) في رانه التصميم الحالي ونموذج قاعدة من الدرجة الثانية بما في ذلك تي المدى تم اختيار ^2، إما إضافة مستوى ثالث لر (أي 8 د) أو إزالة عامل ر ² من هذا النموذج.
10. حفظ جدول البيانات التي تحتوي على تركيبات عامل الأمثل الذي يتم عرضه مرة واحدة حساب كاملة.
11. في "تصميم" عقدة حدد "التقييم" عقدة فرعية وانتقل إلى "الرسوم البيانية" علامة التبويب.
    1. في "أداة الرسوم البيانية" حدد "قوات الدفاع والأمن" وفي "FDS الرسم البياني" مربع اختيار "PRED" كنوع الخطأ. ثم أدخل الفرق كشفها الحد الأدنى فضلا عن القيمة التقريبية للانحراف المعياري المقدر للنظام محدد في القسم 1.1.1) كقيم ل "د" و "ق" على التوالي (20 و 8 هنا ميكروغرام / مل لDsRed). أيضا إدخال مستوى ألفا (٪ مقبولة في عداد المفقودين تأثير كبير) مناسبة للتطبيق، عادة 0.05 (5٪).
    2. تأكد من أن قوات الدفاع والأمن المحسوبة مباريات النسبة المئوية المحددة في القسم 1.3) (عادة> 0.95 لنماذج تنبؤية). منحنى شقة في المؤامرة FDS هو الأفضل، مشيرا إلى دقة التنبؤ موحدة في جميع أنحاء تصميم الفضاء.
       1. إذا كان هذا ليس هو الحال (كما هو موجود هنا، كان FDS 1٪ كما هو موضح في الشكل 3A)، والعودة إلى "تصميم" عقدة وفي شريط المهام اختر "أدوات تصميم"، ثم "تصميم زيادة ..." واختيار " زيادة ".
       2. حدد نفس "البحث" ومعايير "الأمثلية" كما كان من قبل. كما اختار نفس "نموذج تحرير" وإعدادات "فرض التوازن قاطعة". إذا تم إجراء عملية تكبير قبل تصميم أي تجربة (كما فعلت هنا)، ثم تغيير "ضع أشواط في كتلة" تعيين إلى "Block1".
       3. في قسم "يعمل" على إدخال عدد إضافي "نقاط الموديل"، والحفاظ على ما لا يقل عن 5٪ "يعيد" و "عدم تقديرمن يصلح "في تصميم الإجمالي. هنا، أضيفت 100 أشواط إضافية وليس" أدرجت مكررات "و" لتقدير عدم وجود تناسب ".
       4. بمجرد الانتهاء من الحساب، وإعادة النظر في الرسم البياني FDS كما هو موضح أعلاه. إذا كانت قوات الدفاع والأمن لا تزال غير مرضية، كرر تكبير التصميم كما هو موضح أعلاه. هنا كان FDS 100٪ بعد زيادة، وبالتالي لم تكن هناك حاجة مزيد من التعزيز (الشكل 3B).

الرقم 3. مقارنة المؤامرات FDS. A. ظبية تتكون من 90 أشواط تنتج كافية FDS من 1٪ فقط عن الخطأ المعياري من التنبؤ، وذلك باستخدام نموذج القاعدة من الدرجة الثانية في تركيبة مع القيم للفرق الحد الأدنى للكشف (20 ميكروغرام / مل) واستيتزاوج الانحراف المعياري للنظام (8 ميكروغرام / مل). B. زيادة من وزارة الطاقة إلى ما مجموعه 210 أشواط حققت FDS 100٪ ومنحنى مسطح تشير الدقة الموحد للنموذج في جميع أنحاء تصميم الفضاء.

3. الاستنساخ وتحليل التعبير كاسيت

1. زراعة كولاي في 5 مل LB المتوسطة (10 جرام / لتر تريبتون، 5 جرام / لتر خلاصة الخميرة، 170 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 50 ملغم / لتر الأمبيسلين، لتشمل لوحات أجار LB-15 جرام / لتر أجار) عند 37 درجة مئوية لمدة 6 -8 ساعة أو بين عشية وضحاها على شاكر المداري في 160 لفة في الدقيقة. تنبيه: الأمبيسلين هو مادة ضارة. تطعيم المتوسط ​​LB مع إما 50 ميكرولتر من ثقافة السائل أو الخلايا نقل من المستعمرات نمت على لوحات باستخدام طرف ماصة.
2. لتنقية الحمض النووي البلازميد جهاز الأمن السياسي، ومشتقات أخرى من pPAM (بنك الجينات AY027531)، من E. سلالة القولونية K12 DH5a، اتبع الإرشادات الموجودة في دليل تنقية الحمض النووي عدة ^24. تنبيه: ك تنقيةأنه يحتوي على المواد الكيميائية الضارة (انظر أعلاه دليل للحصول على التفاصيل). يوصف تسلسل البلازميد في الشكل 4 و من قبل المشتري وآخرون ^20.
3. تحديد تركيز الحمض النووي في شطافة تنقيته عن طريق قياس الامتصاصية لعينة 2 ميكرولتر في 260 نانومتر في جهاز معمل NanoDrop.
4. التأكد من هوية الحمض النووي البلازميد المنقى من قبل الهضم مع نوكليازات الاقتطاع الداخلية (الدقة).
   1. حدد الدقة وفقا لتسلسل البلازميد بحيث يتم إنشاء أنماط فريدة من نوعها ومميزة شظية. اتبع توصيات الشركة المصنعة لظروف الهضم مثل حجم رد الفعل، والوقت ودرجة الحرارة وتركيز استقرار ألبومين المصل البقري. تبعا لحساسية الجهاز التحليل، استخدم 50-500 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد في الهضم.
   2. إعداد 0،8-2،0٪ الرغوة لفصل شظايا الحمض النووي عن طريق الغليان الاغاروز في تريس بورات-EDTA (TBE) العازلة (90 ملي تريس، 90 ملي بورات، 2 مم EDTA، ودرجة الحموضة 8.0). Tانه شظايا أكبر من المتوقع، يجب استخدام أقل الاغاروز في هلام.
   3. إضافة 5 ميكرولتر من خمسة أضعاف عينة العازلة (5X سابو، 0.1٪ (ث / ت) برموفينول الزرقاء، 0.1٪ (ث / ت) الزيلين cyanol، 10٪ (ث / ت) الجلسرين الذائبة في TBE) إلى 50 ميكرولتر من RE المعالجة عينة من الحمض النووي وفصل شظايا من قبل الاغاروز الكهربائي للهلام في 100 V ~ ليتحقق 40 دقيقة أو حتى فصل واضح من شظايا. على كل هلام، وتشمل ممر تحتوي على علامات حجم سلم الحمض النووي للمقارنة، على سبيل المثال 2-3 ميكرولتر سلم 1 كيلو بايت.
5. استبدال 5'UTR أوميغا في جهاز الأمن السياسي مع واحد من 5'UTRs الثلاثة الأخرى.
   1. الافراج عن تسلسل 5'UTR أوميغا من ~ 4 ميكروغرام الحمض النووي جهاز الأمن السياسي تنقيته عن طريق العلاج مع 20 وحدة من ايكو RI-HF وضابط صف الدقة I-HF في NEBuffer 4 عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ~. ثم فصل شظايا كما هو موضح في الأقسام 3.4.2 و3.4.3.
   2. عزل جزء أكبر (PS، "العمود الفقري") من هلام الاغاروز باستخدام هلام اضافيةطقم كشن وفقا لدليل الشركة المصنعة ²⁵ وتحديد تركيز الحمض النووي النقي كما هو موضح في القسم 3.3). تنبيه: طقم استخراج هلام يحتوي على مواد كيميائية ضارة، راجع دليل للحصول على التفاصيل.
   3. عزل كلية العلوم الصحية، كلية العلوم الصحية، وLPH TL 5'UTRs من ناقلات متبرع مناسب عن طريق علاج ~ 10 ميكروغرام لكل ناقلات مع 20 وحدة من ايكو RI-HF والدقة راس I-HF في NEBuffer 4 عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ~. ثم فصل شظايا كما هو موضح في الأقسام 3.4.2 و3.4.3 وتنقية جزء أصغر 5'UTR المحتوية على النحو المبين في القسم 3.5.2.
   4. Ligate في 5'UTRs النقية المعزولة في مأخوذة منفصلة معزولة إلى المنقى ناقلات PS الخطية عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وفقا لتوصيات الشركة المصنعة ^26. استخدام ~ 50 نانوغرام من الحمض النووي ناقلات والزائدة المولي ثلاثة أضعاف من 5'UTR الحمض النووي في حجم ما مجموعه 20 ميكرولتر.
6. تحول الخلايا القولونية E مع اله البلازميدات المؤتلف ^26،27.
   1. إضافة ~ 10 نانوغرام (~ 4-5 ميكرولتر) من خليط ربط (انظر القسم 3.5.4) إلى 50 ميكرولتر RbCl المختصة E. القولونية والمزيج بلطف، ثم احتضان لمدة 30-60 دقيقة على الجليد. الصدمة الحرارية لمدة 1.5 دقيقة في 42 درجة مئوية، والبرد على الجليد لمدة 5-30 دقيقة.
   2. إضافة 950 ميكرولتر من خالية من المضادات الحيوية LB المتوسطة واحتضان لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية و 160 دورة في الدقيقة. لاختيار transformants، تنتشر 50 و 100 ميكرولتر من ثقافة على لوحات أجار LB تحتوي على الأمبيسلين واحتضان لمدة 16-20 ساعة على ~ 37 درجة مئوية.
   3. تطعيم 5-10 مستعمرات منفصلة تمثل كل ربط المروج-5'UTR هو موضح في القسم 3.1 إلى مأخوذة 5 مل من LB المتوسطة التي تحتوي على الأمبيسلين. ثم تنقية الحمض النووي البلازميد وتأكيد هويتها كما هو موضح في المقاطع 3،2-3،4.
7. استبدال المروج 35SS مع المروج غ في كل من الأربعة البلازميدات باستخدام 5'UTR تصاعدي الأول وايكو RI الدقة في NEBuffإيه 4 عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة كما هو موضح في الأقسام 3.5 و 3.6.
8. أعرض كل من البلازميدات ثمانية مما أدى إلى A. المورمة سلالة GV3101: pMP90RK بواسطة التثقيب الكهربائي ^28.
   1. إضافة ~ 500 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد المنقى إلى 50 ميكرولتر المختصة A. المورمة الخلايا على الجليد. مزيج بلطف ونقل الى prechilled 0.2 سم كفيت electroporation. تأكد من أن الخليط في الجزء السفلي من كفيت و لا تحتوي على فقاعات.
   2. خلايا النبض عند 2.5 كيلو فولت لمدة 5 ميللي ثانية وتأكيد شدة ومدة النبض.
   3. تجنب تركيزات مرتفعة من الملح في عينة من الحمض النووي أو إعداد غير صحيح من ألف المختصة المورمة لأن هذه الخلايا يمكن أن يؤدي إلى التيارات أيون عالية مما يسبب تبخير الفورية لتعليق الخلية، والحد بشكل كبير فعالية التحول.
   4. إضافة 950 ميكرولتر من YEB وسيط وبدون المضادات الحيوية (استخراج 5 ز / L لحوم البقر، 1 غرام / لتر خلاصة الخميرة، 5 ز / L peptonه، 5 ز / L السكروز، 2 ملي MgSO _4، ودرجة الحموضة 7.0)، مزيج بلطف ونقل على الفور الى العقيمة 1.5 مل أنبوب التفاعل. احتضان لمدة 2-4 ساعة عند 26-28 درجة مئوية و 160 دورة في الدقيقة.
   5. تنتشر 1-2 ميكرولتر على لوحات أجار YEB تحتوي على مضادات حيوية (50 ملغ / لتر   كربنيسيلين، 25 ملغ / لتر الكاناميسين، 25 ملغ / لتر ريفامبيسين) لاختيار transformants. تنبيه: ريفامبيسين هو عبارة عن مادة سامة.
   6. تطعيم ثلاثة مأخوذة 5 مل من YEB المتوسطة التي تحتوي على المضادات الحيوية مع الخلايا من المستعمرات منفصلة تمثل كل ربط المروج-5'UTR واحتضان لمدة 48-72 ساعة عند 26-28 درجة مئوية و 160 دورة في الدقيقة.
9. تأكيد نجاح A. المورمة التحول.
   1. 2 نقل ميكرولتر من كل قسامة من القسم 3.8.6 لفصل 48 مأخوذة ميكرولتر من PCR MASTERMIX (2 ميكرولتر من كل الأسهم التمهيدي 10 ميكرومتر (400 نانومتر تركيز النهائي من كل التمهيدي)،1 ميكرولتر 10 ملي مزيج dNTP (200 ميكرومتر تركيز النهائي من كل ثلاثي الفوسفات deoxynucleoside)، 5 ميكرولتر 10 أضعاف توسيع الدقة العالية العازلة مع 15 ملي MgCl _2، 0.75 توسيع ميكرولتر مزيج انزيم عالية الدقة، و39.25 ميكرولتر الماء المقطر العقيمة).
   2. تضخيم الكاسيت التعبير عن كل البلازميد باستخدام الاشعال المناسب (FWD: 5'-CCT CAG غا GAG الجهاز المركزي للمحاسبات TAC-3 '، 1026 النيوكليوتيدات ملزمة المنبع من المروج؛ REV: 5'-CCA الاهلي CGA GTA CAC AAC-3'، ملزمة داخل الموقع تذييل بعديد الأدينيلات 35S) في ظل الظروف المناسبة PCR. هنا، تم استخدام 94 درجة مئوية لمدة تمسخ الأولي تليها 30 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية تمسخ، 51 ° C الصلب لمدة 30 ثانية و 72 درجة مئوية استطالة لمدة 120 ثانية، وخطوة استطالة النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 8 دقيقة.
   3. تحديد حجم المنتجات PCR بواسطة الاغاروز الكهربائي للهلام كما هو موضح في القسم 3.4.3.
10. إعداد أ. المورمة الأسهم الجلسرين من قبلخلط 500 ميكرولتر 50٪ (V / V) الجلسرين العقيمة مع 500 ميكرولتر من A. المورمة الثقافات من القسم 3.8.6 التي تم تأكيد التحول (القسم 3.9.3). تخزين مخزونات الجلسرين في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
11. حساب الطاقات للطي من مختلف mRNAs وباستخدام خادم الويب RNAfold ²⁹ وتشمل تسلسل النوكليوتيدات من موقع بداية النسخي خلال لغليان 50 الأولى من المنطقة الترميز.
    1. في قسم "طية الخوارزميات والخيارات الأساسية" حدد "الطاقة الحرة الحد الأدنى (MFE) وظيفة التقسيم" و "تجنب أزواج قاعدة معزولة" الخيارات.
    2. في "خيارات متقدمة للطي" اختيار "التعلق الطاقات على جانبي الحلزون في أي حال من الأحوال"، "المعلمات الحمض النووي الريبي (تيرنر النموذج، 2004)" وتغيير "إعادة مقياس المعلمات الطاقة إلى درجة حرارة معينة (C)" إلى 25 درجة مئوية.
    3. في المقطع "خيارات إخراج" تحديد كافة الخيارات.
    من "نتائج الحرارية تنبؤ المجموعات" من ملف الإخراج، استخراج "الطاقة الحرة من الفرقة الحرارية" و "تكرار هيكل MFE في فرقة" القيم للمقارنة.

الشكل 4. المروج و 5 'UTR المتغيرات. تم إنشاء أشرطة التعبير من خلال تبادل تدريجي لل5'UTR، مما أدى إلى أربع مجموعات مع CaMV 35SS المروج، تليها استبدال هذا المروج مع تسلسل غ الغلة أربعة أنواع إضافية و ما مجموعه ثمانية مجموعات المروج / 5'UTR مختلفة.

4. زراعة النبات

1. إعداد محلول 0.1٪ من الأسمدة Ferty2 ميجا في غير المتأينة المياه في درجة الحموضة 5.9.
2. إعداد 10 كتل × 10 × 8 سم الصوف الصخري التي كتبها بيغ مكثفة مع الماء منزوع الأيونات لإزالة المواد الكيميائية المتبقية وأخيرا تتوازن مع الأسمدة.
3. بذور نباتات التبغ عن طريق وضع 1-2 بذور التبغ على كل كتلة الصوف الصخري تليها مطاردة قصيرة مع الأسمدة والحرص على تجنب غسل البذور بعيدا.
4. تنبت وزراعة نباتات التبغ لمدة 42 يوما في دفيئة في درجة حرارة 25/22 ° C يوم / ليلة، والرطوبة النسبية 70٪ والإضاءة 16 ساعة (180 ملمول ثانية ^-1 م ^-2؛ λ = 400-700 نانومتر) . خلال هذه الفترة الضوئية، ري مع الأسمدة لمدة 15 دقيقة كل ساعة في الثقافة المائية.

5. عابر التعبير البروتين

1. إعداد أ. المورمة للحقن في الأوراق.
   1. تطعيم 5-50 مل من YEB المتوسطة التي تحتوي على المضادات الحيوية مع 1٪ A. المورمة الثقافة البرد الأسهم واحتضان عند 27 درجة مئوية حتى OD <الفرعية> ل 600Nm يصل 5.0 (~ 48-72 ساعة اعتمادا على حجم ونوع السفينة).
   2. تمييع A. ثقافة المورمة بالماء و2 أضعاف المتوسط ​​تسلل (4.3 غرام / لتر Murashige وسكوغ أملاح (الرقم الهيدروجيني 5.6)، 5 ز / L السكروز، 1.8 غرام / لتر جلوكوز، و 100 ملي acetosyringone) لمطابقة _{ل 600Nm} OD المطلوبة للحقن. تأكيد _{ل 600Nm} OD قبل الحقن. ملاحظة: إن _{ل 600Nm} OD من 1.0 يتوافق مع 1.43 ± 0.12 ~ × 10 ⁹ مل مستعمرة وحدة في تشكيل.
2. حقن A. المورمة تعليق في الأوراق.
   1. اختيار وتسمية أوراق noncotyledon والمواقف في هذا الشأن إلى أن تعامل (على سبيل المثال وفقا لاستراتيجية وزارة الطاقة).
   2. لا حقن مختلفة A. المورمة الحلول في نفس المجال وربي. بدلا من ذلك، استخدام أقسام معارضة على كل جانب من محور منتصف الوريد. إذا كان بحاجة إلى أكثر من عقدين من حلول مختلفة ليتم حقنه في نفس الموقف استخدام additionaل النبات.
   3. يهز جيدا A. المورمة حل ل resuspend أي الخلايا التي قد استقروا منذ إعداد التخفيف ونضح في حقنة 1 مل.
   4. خدش البشرة بلطف في موقف المعدة للحقن مع طرف ماصة أو ما شابه ذلك لتسهيل تدفق من A. المورمة الحل. تجنب تمزيق ورقة شفرة أثناء القيام بذلك.
   5. عقد حقنة عمودي على ورقة شفرة لمس برميل ضد مجال وربي في أن يعامل بلطف ودفع منفذ (مع عدم وجود إبرة المرفقة) على الجانب السفلي من ورقة. اضغط على الجانب العلوي من ورقة بلطف في نفس الوقت لمنع رقة شفرة من نقل أو تمزق.
   6. دفع برفق إلى أسفل المكبس المحاقن. ألف والحل المورمة دخول المساحات بين الخلايا ضمن ورقة شفرة كما يتبين من المناطق المعالجة تظهر قتامة خضراء ورطبة. كرر هذا الإجراء في عدة مناصب حتى intercosta كلهوتسللت المجال ل مع أ. المورمة. ثم تواصل مع الحقل وربي المقبل.
   7. تأكد من يبقى حقنة عمودي على ورقة. سوف يميل حقنة تتسبب في تعليق البكتيرية لطفرة خارج تحت ضغط عال.
   8. إذا كان مختلفا A. وتستخدم حلول المورمة (على سبيل المثال لاختبار منشطات مختلفة)، وإزالة أي حل الزائدة المتبقية على الجانب السفلي من ورقة من الحقن الأولى باستخدام منشفة ورقية أو ما شابه ذلك قبل تطبيق الحل التالي.
3. بعد تسلل الحضانة من النباتات وأخذ العينات.
   1. إعداد المخبر البيئئي النباتي للنباتات تعامل ~ 24 ساعة قبل حقن للسماح درجة الحرارة والرطوبة موازنة بالمستويات المطلوبة لوزارة الطاقة.
   2. بعد حقن، ونقل النباتات إلى المخبر البيئئي النباتي ووضعها في صواني كبيرة بما يكفي للري بالماء حتى نهاية فترة الحضانة التي تحددها وزارة الطاقة.
   3. إنشاء فوت 16 ساعةoperiod باستخدام ستة أوسرام أبيض بارد 36 أنابيب الفلورسنت واط لكل 0.7 م ² (75 مليمول ثانية ^-1 م ^-2؛ λ = 400-700 نانومتر). منع النباتات من التظليل بعضها البعض من خلال تحديد عدد النباتات إلى ستة لكل 0.7 م ^2.
   4. قبل أخذ العينات، وتأكد من تحديد الحقل وربي الصحيح من خلال مقارنة التسمية المضافة في القسم 5.2.1 وخطة وزارة الطاقة.
   5. استخدام حفار الفلين لإزالة 4-5 أقراص رقة من الحقول وربي تعامل في المواقف والأوقات التي أشار إليها زارة الطاقة. لا تقم بإزالة ورقة كاملة من المصنع خلال أخذ العينات. استقرار رقة مع منشفة ورقية باليد أثناء إزالة الأقراص لمنع تمزق.
   6. تحديد كتلة من كل عينة ووضعه في 1.5 مل أنبوب من البلاستيك رد فعل المسمى مع اسم العينة والشامل. تخزين العينات في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية قبل البروتين الكميات. قد يكون مؤقتا عملية في هذه المرحلة لعدة أشهر اعتمادا على الاستقرار عينةودرجة حرارة التخزين.

6. الكميات البروتين

1. استخراج البروتينات من العينات القرص ورقة.
   1. إضافة 3 مل من استخراج العازلة (50 ملي فوسفات الصوديوم، كلوريد الصوديوم 500 ملم؛ درجة الحموضة 8.0) في ملغ من عينة الشامل وطحن أقراص رقة في الأنبوب رد فعل باستخدام مدقة الكهربائية حتى لا تظل شظايا كبيرة. تجنب ارتفاع درجة الحرارة من العينة.
   2. إزالة المواد الصلبة فرقت بواسطة الطرد المركزي العينة مرتين في 16،000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. نقل طاف في أنبوب 1.5 مل نظيف رد فعل بعد كل خطوة من دون إزعاج بيليه.
   3. بعد الطرد المركزي، قد يكون مؤقتا عملية من خلال تجميد استخراج النباتية في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية لعدة أشهر اعتمادا على استقرار درجة حرارة العينة والتخزين. تؤكد أن دورة تجميد ذوبان الجليد لا يؤثر على تركيز البروتين الهدف (ق).
2. قياس مضان DsRed.
   1. إعداد ثلاثة مكررات التقنية من كل عينة إلى أسود 96 جيدا لوحات نصف مساحتها (50 ميكرولتر لكل بئر استخراج). تجنب تشكيل فقاعات خلال pipetting ل.
   2. استخدام مجموعة من ستة التخفيفات (0، 25، 75، 125، 175 و 225 ميكروغرام / مل) من معيار DsRed في لوحة 96 جيدا لتوليد منحنى المرجعية الخطوط الملاحية المنتظمة. تحضير التخفيفات في برنامج تلفزيوني وتخزينها في 4 درجات مئوية لاستخدامها في غضون 3 أشهر.
   3. قياس مضان مرتين، بالتتابع، في قارئ لوحة 96 جيدا مزودة 530/25 نانومتر الإثارة و590/35 مرشحات الانبعاثات نانومتر.
   4. لكل عينة، متوسط ​​مضان على اثنين من يقرأ ومكررات التقنية الثلاثة وطرح القيمة المسجلة للتحكم فارغة تحتوي على 0 ميكروغرام / مل DsRed. طرح أيضا هذه القيمة من يقرأ من التخفيفات القياسية واستخدام هذه القيم الفارغة لتصحيح لالانحدار الخطي مما أسفر عن منحنى المرجعية (من خلال أصل تنسق).
   5. استخدام المنحدر من منحنى إشارة لتحويل وluorescence قياس للعينات في تركيزات DsRed. إذا لزم الأمر، وتمييع العينات بحيث يسقط قراءات ضمن الفاصل الزمني تركيز المعايير وينظر هذا عامل التخفيف في الحسابات اللاحقة.
3. تحديد تركيز 2G12.
   1. إعداد جهاز سطح مأكل صدى (SPR) لقياس تركيز الأجسام المضادة وذلك بربط البروتين على سطح الخلية تنشيط تدفق واحد. استخدام خلية تدفق أخرى كمرجع بواسطة تعطيل السطح دون اقتران من البروتين ^30،31.
   2. تمييع المستخلصات النباتية في 1:20 SPR تشغيل العازلة (10 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.4، 3 ملي EDTA، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، 0.05٪ ت / ت توين-20) وحدات قياس استجابة (RU) من الأجسام المضادة لبروتين ملزمة ألف في ثلاثة مكررات التقنية لكل عينة في نهاية حقن 90 ميكرولتر (180 ثانية في 30 ميكرولتر / دقيقة). طرح RU قياس في خلية تدفق المرجعية (أي البروتين A) من RU تقاس في التجارب فلوريداآه الخلية (بروتين سطح).
   3. قياس مستوى 585 نانوغرام / مل 2G12 بعد كل 10-15 العينات وطرح القيمة المقاسة في تدفق الخلايا المرجعية كما هو موضح أعلاه. استخدام متوسط ​​RU هذه المعايير لحساب منحنى خطي من خلال مرجعية أصل تنسق.
   4. حساب تركيزات 2G12 في العينات استنادا إلى التخفيف 01:20 والمنحدر من منحنى المرجعية.
   5. التحقق من وجود قوي غير محددة ملزمة إلى الخلية المرجعية، والتي يمكن أن تفسد القياس. أيضا التحقق ما إذا كانت المعايير 2G12 الحفاظ على قيم ثابتة تقريبا (<5٪ الاختلاف) في جميع أنحاء التحليل، كما يعكس تباين أكبر شيخوخة بروتين السطح.

7. تحليل البيانات والتقييم

1. تحليل الاستجابات لوحظ في التجارب التعبير عن (ط) القيم القصوى أخطاء (مرتفعة أو منخفضة) مما يدل على القياس يدويا، (ب) نتائج غير عادية، مثل التركيبات عامل أن الجينتقييم الاستجابات غير المتوقعة تشير إلى تبادل البيانات، و (ج) القيم المفقودة.
   ملاحظة: استخدام هذه الإجراءات لمنع بناء نموذج استنادا إلى بيانات خاطئة.
2. نقل البيانات استجابة تحليلها (هنا تركيزات البروتين) في "تصميم" عقدة DesignExpert. تأكد من أن البيانات استجابة يتم تعيين بشكل صحيح إلى إعدادات عامل المقابلة. هناك قسم المساعدة الواسعة المتاحة في البرنامج DesignExpert التي تغطي جوانب تناولها أدناه.
3. في "تحليل" العقدة، واختيار استجابة لتحليلها وتحديد البداية "لا شيء" في علامة التبويب التحول.
   ملاحظة: ينصح التحول للدقيقة / ماكس نسب الاستجابة أكبر من 10. يمكن الحصول على التحول الأكثر فائدة من صندوق كوكس مؤامرة في "تشخيص" التبويب في قسم "تشخيص" من "أداة تشخيص" هو موضح أدناه (القسم 7.8). A التحول تسجيل ₁₀ غالبا ما يكون مناسبا.
يستمر إلى "ملخص صالح" علامة التبويب، الذي يقدم معلومات عامة عن العوامل التي تعتبر مهمة بالنسبة للنظام قيد التحقيق (على سبيل المثال اثنين عامل التفاعلات والآثار من الدرجة الثانية). يقوم البرنامج تشير إلى نموذج أولي على أساس أهميتها.
4. في "الموديل" علامة التبويب، وانتقاؤه نموذج الأولي استنادا إلى نتائج "ملخص صالح". استخدام وضع آلية لتعديل هذا النموذج:
   1. حدد "أمر العمليات" الذي هو أمر واحد فوق النموذج المقترح، على سبيل المثال ثم اذا كان النموذج المقترح هو "2FI" (اثنين عامل التفاعل) اختر "التربيعية".
   2. اختيار "الخلف" في الميدان "التحديد"، والتي سوف إزالة تكراري حيث nonsignificant من النموذج بعد الانتقال إلى "أنوفا" التبويب على أساس "ألفا من" القيمة التي ينبغي أن تكون في البداية 0.100.
   3. إذا طلب من قبل البرنامج، ودائما تصحيح التسلسل الهرمي نموذج تلقائيا لأن هذا هو لزم الامرذ لتوليد نماذج موثوقة ^32،33.
5. في "أنوفا" علامة التبويب، والتحقيق في النموذج المقترح والعوامل المدرجة. إذا لزم الأمر، وإزالة أي عوامل يدويا مع القيم ع فوق عتبة محددة سلفا (0.05 هنا، المقابلة لمستوى الدلالة 5٪) أو تلك التي تستند المحتمل على النظر الميكانيكية عن طريق التحول إلى "نموذج" علامة التبويب، تغيير "اختيار" إلى "يدوي" والقضاء على العوامل المناسبة من الطراز.
6. مرة أخرى في "أنوفا" علامة التبويب، وتقييم نموذج منتعشة من حيث القيمة ع من "الموديل" (قيمة منخفضة أمر مرغوب فيه لأن هذا يدل دلالة) و(قيمة عالية "الافتقار لاحتواء" أمر مرغوب فيه لأن هذا يدل على عدم وجود دلالة)، وكذلك القيم ل "الجذر التربيعي"، "الجذر التربيعي المعدل" و "الجذر التربيعي توقع" (القيم> 0.80 ومرغوب فيه لجميع القيم الثلاث).
   1. مقارنة هذه القيم FOص نماذج مختلفة بما في ذلك / باستثناء العوامل أهمية على عدة مستويات.
      ملاحظة: قد يكون من المفيد لتكرار العمود استجابة في "تصميم" عقدة وتنفيذ كل تحليل فردي، أو لتصدير الجدول كله "أنوفا" في برنامج آخر مثل جدول بيانات.
7. انتقل إلى "تشخيص" التبويب لتأكيد الجودة للنموذج وكشف القيم المتطرفة المحتملة في مجموعة البيانات التي لديها تأثير قوي على النموذج من خلال دراسة كافة علامات التبويب في "أداة تشخيص" (القسم "تأثير" "التشخيص" و) .
   1. في قسم "تشخيص" من "أداة تشخيص"، تنفيذ الإجراءات التالية:
      1. ضمان وتنتشر نقاط عشوائيا داخل حدود في "مقابل البواقي توقع" الرسم البياني. هنا، يشير إلى وجود توزيع شيفرون على شكل حاجة للتحول البيانات.
      2. وتنتشر ضمان النقاط بشكل عشوائي داخل حدود في"البواقي مقابل توقع" الرسم البياني. هنا، يشير إلى وجود توزيع شيفرون على شكل حاجة للتحول البيانات.
      3. التحقيق في ما إذا كانت نقطة في "البواقي مقابل تشغيل" مخطط مبعثر عشوائيا في حدود. وثمة نمط (على سبيل المثال "درج") يشير إلى وجود اتجاه في بناء كتلة البيانات ويمكن استخدامها لمواجهة نفوذها على النموذج.
      4. ابحث عن خط مستقيم مائل يشير إلى نموذج مثالي في "توقع مقابل الفعلية" المؤامرة. كلما زاد تشتت البيانات حول القطر، وأقل دقة النموذج.
      5. تحقق من وجود تداخل الأزرق (أفضل) والأخضر (الفعلية) الخطوط العمودية في صندوق كوكس مؤامرة تشير إلى تحويل البيانات. إذا لم يكن الخط الأخضر مباراة واحدة في الزرقاء (خارج الفاصل الزمني المشار إليها بواسطة خطوط عمودية حمراء) العودة إلى القسم 7.3 وتحسين الجولة بناء نموذج عن طريق تحديد تحويل البيانات التي اقترحها صندوق كوكس مؤامرة. مرة أخرى الازدواجية في إعادةيمكن أن يكون العمود استجابته المفيد مقارنة نماذج مختلفة.
      6. تأكد من أن النقاط الواردة في "البواقي مقابل عامل" الخرائط (هناك مخطط واحد لكل عامل نموذج) مبعثر عشوائيا في حدود. انحناء في توزيع البيانات قد تشير إلى وجود عامل مفقودة في النموذج.
   2. في قسم "التأثير" من "أداة تشخيص"، تأكد من وجود تشتت عشوائية من البيانات داخل حدود في "مخلفات studentized خارجيا"، "الرافعة المالية"، "DFFITS" و "DFBETAS" المؤامرات والتوزيع بالتساوي دون منخفضة القيم المتطرفة في "كوك بعد" المؤامرة.
8. في "الرسوم البيانية الموديل" علامة التبويب، تصور نموذج تقييمها. لعدد محدود من العوامل رقمية (على سبيل المثال 3) سطح الاستجابة ("3D سطح") تمثيل مفيد لتقييم أوبتيما / الخصائص يدويا.
   ملاحظة: السطوح استجابة توضيح فقط تأثير اثنين من القوات المسلحة الكونغوليةالاختصاصات على الاستجابة قيد التحقيق. وكشفت تأثير أي عامل إضافي على الاستجابة عن طريق تغيير قيمته (العوامل رقمية) أو مستوى (عوامل قاطعة) في إطار "العوامل أداة". بدلا من ذلك، عوامل يمكن تعيينها على محور مؤامرة بالنقر بزر الماوس الأيمن عليها في إطار "العوامل أداة" واختيار محور المتغير المستقل المطلوب.
   1. التلاعب في مستويات عامل والتنازل عنها لتنسق الرسم البياني باستخدام "أداة العوامل".
   2. الرسوم البيانية التصدير باستخدام "الرسم البياني تصدير إلى ملف ..." الأمر في "ملف" التبويب.
9. استخدام "العددي" عقدة فرعية في "الأمثل" عقدة لتحسين استجابة عدديا (تصغير، تكبير، في المدى) تبعا لعوامل النموذج، الذي بدوره بعض القيود يمكن تطبيقها (مثل الحدود والأوزان) عن طريق "معايير" علامة التبويب.
   1. حساب ودراسة الحلول العددية في "الحلول"التبويب على أساس المدخلات الواردة في "معايير" علامة التبويب.
   2. تصدير هذه الحلول لبرامج أخرى (مثل جداول البيانات) لمزيد من التحليل (مثلا رسوم بيانية) وكشف عن ضبط عامل القيم المرتبطة استجابة عالية أو منخفضة.
      ملاحظة: هذا هو المفيد لو يتم التحقيق أكثر من ثلاثة عوامل الرقمية والتمثيل 3D أمر صعب.
10. استخدام "التنبؤ نقطة" العقدة الفرعية للتنبؤ استجابة لإعدادات عامل محددة.
    1. استخدام هذا التوقع لكافة الإعدادات التي يتم تقييمها (هنا، كل المروج وتركيبات 5'UTR وكذلك جميع الأوراق والأوقات الحضانة أو مواقف أوراق ودرجات الحرارة الحضانة).
    2. تصدير القيم المتوقعة وجمعها لمجموعة البيانات التي يمكن استخدامها لوصف التعبير عابرة في نباتات التبغ، على سبيل المثال عن طريق حساب التعبير عن تركيبة معينة المروج-5'UTR في وقت معين بمعدل متوسط ​​أعلى من كل المناصب ورقة أو انحلالق ق جميع أوراق النبات.
    3. تطبيع البيانات التعبير استنادا إلى جماهير مختلفة يترك لتسفر عن مستوى التعبير محددة (ز ^-1 ميكروغرام) أو معدل التعبير محددة (ز ^-1 ميكروغرام ساعة ^-1).
    4. بدلا من ذلك، تصدير معاملات "المعادلة النهائي" من أسفل "أنوفا" التبويب في جدول بيانات وتتضاعف لهم مع مجموعة من إعدادات عامل لانتاج نفس مجموعة البيانات.
       ملاحظة: قد تحتوي هذه المجموعة فقط قيم معامل من داخل مساحة التصميم الأولي، لأنه لا يناسب نموذج المعادلة المجهزة للاستقراء.
11. إجراء التجربة تأكيدا للحصول على نقاط نموذج التي تهم رئيسية.
    1. أداء عابرة التعبير البروتين تحت ظروف المحددة ل "التنبؤ بوينت" (القسم 7.11). على سبيل المثال استخدام نفس درجات الحرارة ويترك الخ
    2. تحديد تركيزات البروتين لهذا التعبير عابرة هxperiment كما وصف أعلاه (القسم 6) ومقارنتها مع القيم التي تنبأ بها النموذج.
    3. تحقق ما إذا كان متوسط ​​تركيز البروتين في التجربة التأكيد يندرج ضمن الفاصل الزمني التنبؤ نموذج سطح الاستجابة التي تم الحصول عليها خلال التنبؤ نقطة. مباراة يؤكد القوة التنبؤية للنموذج. ويشير عدم تطابق يمكن أن تكون هناك حاجة إلى نموذج جودة منخفضة وأشواط إضافية.
    4. ملاحظة: محطة تقلب دفعة إلى دفعة يوسع الفاصل الزمني التنبؤ وربما خفض قيمة التجارب تأكيد يؤديها مع دفعة مختلفة من النباتات. ومع ذلك، قد العينات التي لم تستخدم لتوليد نموذج ولكن التي نشأت من نفس دفعة النباتية والعينات الواردة في نموذج خدمة ضوابط فعالة.

النتائج

نموذج وصفي لتراكم DsRed خلال التعبير عابرة استخدام منشطات و5'UTRs مختلفة

وقد استخدم مضان DsRed في مقتطفات ورقة تشير إلى مستوى التعبير من البروتين المؤتلف وبالتالي تم استخدامه باعتباره استجابة في استراتيجية وزارة الطاقة. كان...

Discussion

كل تجربة يتطلب تخطيطا دقيقا لأن الموارد غالبا ما تكون نادرة وباهظة الثمن. هذا صحيح بصفة خاصة للاستراتيجيات وزارة الطاقة هذا بسبب أخطاء أثناء مرحلة التخطيط (على سبيل المثال اختيار نموذج القاعدة التي لا تغطي جميع التفاعلات عامل هام) يمكن أن يقلل بشكل كبير من القوة...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.	DoE software
Tryptone	Carl Roth GmbH	8952.2	Media component
Yeast extract	Carl Roth GmbH	2363.2	Media component
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Media component
Ampicillin	Carl Roth GmbH	K029.2	Antibiotic
Agar-Agar	Carl Roth GmbH	5210.2	Media component
Escherichia coli K12 DH5a	Life Technologies	18263-012	Microorganism
pPAM	GenBank	AY027531	Cloning/expression vector;
NucleoSpin Plasmid	MACHEREY-NAGEL GmbH	740588.250	Plasmid DNA isolation kit
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up	MACHEREY-NAGEL GmbH	740609.250	Plasmid DNA purification kit
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	n.a.	Spectrophotometer
NcoI	New England Biolabs Inc.	R3193L	Restrictionendonuclease
EcoRI	New England Biolabs Inc.	R3101L	Restrictionendonuclease
AscI	New England Biolabs Inc.	R0558L	Restrictionendonuclease
NEB 4	New England Biolabs Inc.	B7004S	Restrictionendonuclease buffer
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Media component
Disodium tetraborate	Carl Roth GmbH	4403.3	Media component
EDTA	Carl Roth GmbH	8040.2	Media component
Agarose	Carl Roth GmbH	6352.4	Media component
Bromophenol blue	Carl Roth GmbH	A512.1	Color indicator
Xylene cyanol	Carl Roth GmbH	A513.1	Color indicator
Glycerol	Carl Roth GmbH	7530.2	Media component
Mini-Sub Cell GT Cell	BioRad	170-4406	Gel electrophoresis chamber
Agrobacterium tumefaciens strain GV3101:pMP90RK	DSMZ	12365	Microorganism
Electroporator 2510	Eppendorf	4307000.658	Electroporator
Beef extract	Carl Roth GmbH	X975.2	Media component
Peptone	Carl Roth GmbH	2365.2	Media component
Sucrose	Carl Roth GmbH	4621.2	Media component
Magnesium sulfate	Carl Roth GmbH	0261.3	Media component
Carbenicillin	Carl Roth GmbH	6344.2	Antibiotic
Kanamycin	Carl Roth GmbH	T832.3	Antibiotic
Rifampicin	Carl Roth GmbH	4163.2	Antibiotic
FWD primer	Eurofins MWG Operon	n.a.	CCT CAG GAA GAG CAA TAC
REV primer	Eurofins MWG Operon	n.a.	CCA AAG CGA GTA CAC AAC
2720 Thermal cycler	Applied Biosystems	4359659	Thermocycler
RNAfold webserver	University of Vienna	n.a.	Software
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Grodan Rockwool Cubes 10 x10 cm	Grodan	n.a.	Rockwool block
Greenhouse	n.a.	n.a.	For plant cultivation
Phytotron	Ilka Zell	n.a.	For plant cultivation
Omnifix-F Solo	B. Braun	6064204	Syringe
Murashige and Skoog salts	Duchefa	M 0222.0010	Media component
Glucose	Carl Roth GmbH	6780.2	Media component
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Phytohormon analogon
BioPhotometer plus	Eppendorf	6132 000.008	Photometer
Osram cool white 36 W	Osram	4930440	Light source
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Centrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuge
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Fluorescence plate reader
Biacore T200	GE Healthcare	n.a.	SPR device
Protein A	Life Technologies	10-1006	Antibody binding protein
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Media component
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Media component
2G12 antibody	Polymun	AB002	Reference antibody