사례 연구로 담배에 과도 단백질 발현 : 실험 접근의 디자인을 사용하여 복잡한 시스템의 특성

요약

우리는 식물에서 단일 클론 항체와 리포터 단백질의 과도 발현 유전자 조절 요소, 식물의 성장과 발달 파라미터 및 배양 조건의 영향을 결정하고 모델링하는 데 사용될 수있는 실험 방법의 설계를 설명한다.

초록

식물은 낮은 비용, 확장 성 및 안전성을 포함한 생물 약제의 제조를위한 다수의 이점을 제공한다. 일시적 발현은 짧은 개발 및 생산 시간의 추가적인 장점을 제공하지만, 발현 따라서 좋은 제조 연습의 맥락에서 규제 우려로 상승을주는 일괄 처리 사이에 상당히 다를 수 있습니다. 우리는 일괄 간의 발현의 변동에 대한식이 동안 규정 식 구조 요소, 식물의 성장과 발달 파라미터 및 배양 조건 등 주요 요인의 영향을 결정하기 위하여 실험 (DOE) 접근법의 디자인을 사용했다. 우리는 모델 항 HIV 단일 클론 항체 (2G12)과 형광 마커 단백질 (DsRed를)을 표현하는 식물을 시험했다. 우리는 모델의 특정 속성을 선택하기위한 이론적 근거를 설명하고 잠재적 한계를 식별합니다. 일반적인 방법은 간단하게 다른 문제로 전송 될 수 있기 때문에 모델의 원리광범위하게 다시 적용 : 작은 모듈, 최적의 실험 조합의 소프트웨어 가이드 설정 및 단계적 디자인 증가로 초기 문제를 분할하여 지식 기반 파라미터 선택, 복잡성 감소. 따라서, 방법론뿐만 아니라 식물의 단백질 발현을 특성화뿐만 아니라 기계적인 설명이 부족한 다른 복잡한 시스템의 조사에 유용합니다. 파라미터 사이의 상호 접속을 설명하는 예측 식들은 다른 복잡한 기계적 시스템 모델을 확립하는데 사용될 수있다.

서문

식물이 성장 저렴하기 때문에 식물에서 바이오 의약품 단백질의 생산이 유리하다, 플랫폼은 더 많은 식물을 재배하여 확장 할 수 있으며, 인간의 병원체는 ^1,2를 복제 할 수 없습니다. DNA 전달 및 정제 된 제품의 배달 지점 사이의 시간을 세 미만 2 달 이상 ^3로 감소하기 때문에 아그로 박테 리움 튜메 파시 엔스 잎의 침투에 예를 들어 기반의 일시적 발현 전략은 추가 혜택을 제공한다. 일시적 발현은 기능 상실 돌연변이를 보완하기 위해 또는 단백질 상호 작용 ^4-6을 조사하기 위해 자신의 능력에 대한 유전자를 테스트하는 기능 분석, 예를 들어 사용됩니다. 그러나, 일시적인 발현은 형질 전환 식물체 ^7-9의 발현 수준보다 큰 배치 별 편차를 표시하는 경향이있다. 이는 바이오 의약품의 제조 공정은 일시적인 발현 위스콘신에 근거한다는 가능성을 줄여재현성이 중요한 품질 특성과 위험 평가 ¹⁰ 될 수 있으므로 우수 제조 기준 (GMP)의 맥락에서 승인 될 것이다. 이러한 변화는 연구자가 조사하고자하는 모든 상호 작용에 마스크를 적용 할 수 있습니다. 따라서 식물에서 과도 발현 수준에 영향을 고품질 정량적 예측 모델을 구축하는 주요 요인의 동정을 설정.

하나의 요인 -에서 - 타임 (OFAT) 접근 방식은 종종 실험 ^11의 결과에 대한 특정 매개 변수 (요인)의 영향 (효과) (응답)를 특성화하는 데 사용됩니다. 연구 (실험) 동안 개별 테스트 (실행) (설계 공간)을 테스트하는 요인에 의해 스팬 잠재적 인 영역을 통해 문자열에 진주처럼 정렬됩니다 때문에이 차선이다. 디자인 공간과 실험에서 파생 된 정보 따라서 정도의 범위는낮은,도 1a에 도시 된 바와 같이 ^12. 도 1b ^13에 도시 된 바와 같이 또 다른 요인 (인자의 상호 작용) 사이의 상호 의존성은별로 모델 및 / 또는 거짓 옵티마의 예측 결과 은폐 남아있을 수있다.

전술 한 단점은 둘 이상의 요소가이 실행 ⁽¹⁴⁾ 사이에 변화되는 것을 의미하는 실험의 실행이 디자인 공간에 걸쳐 균등하게 분산되어있는 실험 (DOE) 방식의 설계를 사용하여 회피 할 수있다. 요인 (요인 설계) 및 반응에 인자에 미치는 영향의 정량 (반응 표면 방법, RSM 초) ^15를 선별 혼합물에 대한 전문적인 디자인이있다. 또한, RSM의 중부 - 복합체 설계로 실현 될 수 있지만, 또한 실행의 선택을위한 다른 기준을 적용 할 수있는 특수한 소프트웨어를 사용하여 효과적으로 성취 될 수있다. 예를 들어, 소위 D-optimalitY 기준은 IV-최적 성 기준은 설계 공간 ^{(15, 16)에} 걸쳐 가장 낮은 예측 분산을 달성 실행을 선택하는 반면, 이렇게 생성 된 모델의 계수들에서 오류를 최소화하기 위해 실행을 선택한다. 우리는 여기 설명 RSM은 식물에서 과도 단백질 발현의 정확한 정량을 허용하지만, 간단하게 (5-8 ~) 몇개 관련된 모든 시스템으로 전송 될 수있는 숫자 요인 (예 : 온도, 시간, 농도) 및 소수 (~ 2 - 4) 기계 론적 설명은 모델에 사용할 수 없거나 너무 복잡 categoric 요인 (예를 들어, 프로모터, 색상)하는.

피해자의 접근 방식은 농업 과학에서 유래하지만, 그것이 신뢰할 수있는 데이터를 확보하는 데 필요한 실행의 수를 줄이고 복잡한 프로세스에 대한 설명이 포함 된 모델을 생성하는 데 유용합니다 어떤 상황에 양도 할 수 있기 때문에 다른 지역으로 확산하고있다. 이것은 차례로은 "지침에서 미상의 포함되었다산업은 인간의 사용에 대한 제약 (ICH) ^(17)의 등록을위한 기술 요구 사항의 조화에 관한 국제 회의에서 발표 Q8 (R2) 의약품 개발은 ". 미상은 현재 과학 연구 및 산업 ^(18)에 널리 사용된다. 그러나, 치료 중에주의해야 다중 선형 회귀 모델 (기본 모델)에 대한 부적절한 다항식 정도를 선택하기 때문에 계획과 실험의 실행은 제대로 모든 인자의 영향을 모델링하는 추가 실행을위한 필요를 소개 할 수있다. 또한, 손상되거나 누락 된 데이터가 잘못된 모델과 결함을 생성 예측, 심지어 프로토콜 및 토론 섹션 ^(18)에서 설명한 바와 같이 임의의 모형 구축 시도를 방지 할 수있다. 프로토콜 섹션에서, 우리는 처음 RSM 기반 실험을위한 가장 중요한 계획 단계를 설정 한 후 미상에 기반 디자인을 설명 할 것이다 소프트웨어 DesignExpert v8.1이. 그러나 유사한 디자인은 다른 소프트웨어 includi을 빌드 할 수 있습니다NG JMP, Modde 및 STATISTICA. 실험 절차는 데이터 분석 및 평가를위한 지침에 따른다.

그림 1. OFAT 및 미상.의 비교. 실험 (검은 색, 빨간색과 파란색 동그라미)의 시간 (OFAT) 하나의 인자의 연속 변화는 설계 공간 (빗금 친 지역)의 낮은 범위를 달성 할 수있다. 대조적으로, 실험 (DOE) 전략 (녹색 원)의 디자인을 사용하여 한 번에 하나 이상의 인자의 변형에 따르면 얻어진 모델. 따라서 B의 정밀도를 향상시킨다. 바이어스 설계 공간의 범위는 OFAT 실험 (검은 색 원)도, 최적의 작업 영역 (빨간색)를 식별 및 하위 최적의 솔루션 (큰 검은 원)을 예측하는 데 실패 할 수 있다는 것을 의미하는 반면 피해자의 strategiES (검은 별) 바람직 조건 (큰 검은 별)를 식별 할 가능성이 높습니다.

프로토콜

1. 미상 전략 계획

1. 디자인에 포함 관련 요소 및 응답을 확인합니다.
   1. 측정을위한 하나 또는 여러 개의 응답을 정의합니다. 여기서, 2G12 및 DsRed를 발현 수준은 중요한 (각각 10 및 20 ㎍ / ㎖,)로 간주 감지 할 수있는 최소의 차이와 시스템의 추정 표준 편차에 대한 근사값 (4-8 μg을 포함하여 (㎍ / ㎖)를 사용했다 / ㎖, 각각) 이전의 실험에 따라.
   2. 사용 가능한 문학을 사용하여, 이전의 실험 또는 전문 심사 디자인에서 데이터 누구의 충격 응답에 대한 정량화 될 것이다 (표 1) ^7,8,19,20 중요한 요소를 선택합니다 (예 : 요인 설계가 도입 참조).
   3. 요소 유형 (숫자 또는 categoric)를 할당하고 숫자 요인은 피해자의 조사 (표 1) 동안 변화 될 내에서 범위를 선택합니다.
   4. NUMERI를 확인C 요인하는 지속적인 변형은 구현하기 어렵다.
      1. 특정 수준으로 정밀하게 조정할 수없는 요인에 대한 지속적인 변화를 사용하지 마십시오. 예를 들어, 배양 온도는 전형적으로 ± 2 ° C 내에서 제어 할 수있는, 그러한 27.2 ° C, 25.9 ° C, 29.3 ° C의 필수와 같은 값을 사용하여, 따라서 지속적인 변화 피할 수.
      2. 대신, 이러한 요인 (표 1)에 대해 개별 수준의 번호를 선택합니다. 레벨의 수는 예상되는베이스 모델 (단계 1.2)와 일치한다. 중앙 복합 디자인은 항상 이산 인자 수준이 때문에, 최적의 설계에 대해서만 중요하다.
   5. , categoric 요인이 명목인지 여부를 지정 묵시적 순서 (예를 들어, 서로 다른 제조 업체), 또는 서수 따라서 이산 숫자 매개 변수 (식물에 대한 예를 들어, 다른 잎), 즉 없습니다.
   6. categoric 요인의 두 가지 유형의 레벨을 선택합니다.
2. 유용한 기본 모델을 선택합니다.
   1. 예비 실험 및 문헌에 기초하여, 각각의 인자 및 응답뿐만 아니라 요소의 상호 작용 및 응답 사이의 관계를 예측. 예를 들어, 선형 (더 나은), 차 (단일 최적의 비선형 증가 / 감소) 3 차 (최적의 왜곡).
   2. 별도의 숫자 요인에 대한 레벨의 수 n은 인자와 반응 사이의 관계 다항식 정도되는, N + 1인지 확인합니다. 예를 들어, 온도는 N = 2, 응답에 대한 이차 효과를 가질 것으로 예상되고, 따라서, 적어도 세 개의 온도 레벨 차 효과를 달성하기 위해 적합 조사되어야한다.
3. 예측 차이가 특정 임계 값 (알파 값) 미만이어야되는 디자인 공간의 분획 (FDS)를 정의. FDS는 전반에 걸쳐 강력한 예측을 산출 모델을 달성하기 위해 (설계 공간의 95 % 이상을 커버)> 0.95이어야한다전체 설계 공간 ^21-23.
   주 : 0.05의 임계 값은 5 %의 유의 수준 (유형 I 오류)에 해당하는 전형적인 값이다. 이 값을 늘리면 미상 전략에 필요한 실험의 수를 줄일 수 있지만, 동시에 상당한 효과가 놓친 응답에 미치는 영향의 예측이 잘못되었을 것이다 될 가능성이 증가합니다.

표 1. 변화를 포함하여 담배의 과도 단백질 발현에 영향을 미치는 요인은 굵게 미상입니다. 요인 만 "다른 프로모터 / 5'UTRs를 사용하여 일시적 발현시 DsRed를 축적에 대한 설명 모델"에서 설명 된 실험 설계에 포함 된시 범위 반면, 이탤릭체 요인 단지 "incubatio 최적화에 대한 설계에 포함되었다N의 조건으로 "과도 발현을 사용하여 식물에서 단일 클론 항체의 생산을 위해 수확 방식.

그림 2. 미상 계획 과정. 조사에서 응답에 큰 영향 요인은 사용 가능한 데이터를 기반으로 선택됩니다. 그런 다음 요소 특성 (예를 들어, 숫자), 범위와 수준이 할당됩니다. 이전 기술과 실험은 적합한 염기 모델을 정의하기 위해 사용된다. 예측 능력 요구 사항은 최종 모델의 적용 / 목적에 따라 정의된다. 컴파일 된 데이터는 해당 피해자의 소프트웨어에 전송 될 수 있습니다.

2. DesignExpert에서 RSM 설정

1. DesignExpert를 시작하고 "새로운 디자인"을 선택합니다. "응답 표면"창에서, 선택 및# 34; 최적 "및 1.1 절에서 선택한 숫자와 categoric 요인)의 번호를 입력합니다.
2. 해당 필드에있는 모든 요소에 대한 요소 이름, 단위, 유형, 하위 유형, 레벨 / 레벨 테두리와 수준에 대한 값을 입력합니다.
3. 다음 페이지로와에서 계속 "검색"옵션이 "최고"뿐만 아니라 원하는 "최적 성"기준, 여기에 "D-최적"를 선택합니다.
4. "편집 모델 ..."메뉴에서 요인과 1.2 절에 예상되는 상호 작용)를 포함하는 모델을 선택합니다. 불확실한 경우에, 여기에서 특정 다항식 정도에 대한 모든 요소와 상호 작용, "이차"를 포함하는 전체 모델을 선택합니다. (모든 상호 작용을 포함하는) 풀 모델을 선택하는 미상 필요한 실험의 수를 늘릴 수 있다는 것을주의한다.
5. "블록"의 번호를 선택합니다. 모든 식물은 동일한 배치에서, 모든 세균이 동시에 배양되었다 있었기 때문에 여기서, 하나의 블록이 사용되었다모든 주사는 동일한 오퍼레이터에 의해 동일한 날에 수행 하였다. 식물의 하나 이상의 배치를 사용하거나 복수의 작업자가 주사를 처리하면 하나 이상의 블록을 사용한다.
6. 디자인의 균형을
   1. , categoric 요인 수준에 균등 실험의 실행을 배포하기 위해 테스트 등 다른 발기인을 "categoric 균형을 강제로"사용합니다.
      주 : 이것은 DesignExpert가 최적 성 알고리즘에 의해 선택된 포인트에 따라 % 값으로보고 할 정도로 설계의 최적 성을 감소시킬 수있다.
   2. 최적 성의 감소를 최소화하기 위해 구현 된 임의 화 알고리즘을 사용하여 설계를 여러 번 재 계산.
      참고 : 최적 성 손실의 범위는 3~40%가 동일한 입력 데이터를 사용하지만, 복제물의 수가 categoric 균형을 유지하는데 사용될 수있다 변화 ~부터.
7. 소프트웨어는베이스 모델에 근거 "모델 지점"의 수에 대한 값을 제안 할 것이다여기에 (70)가 실행됩니다. 그것은 여기에 각 "모델 점", 10 실행하는 각의 수의> 5 %를 보장하기 위해 "적합의 부족 예상", "복제합니다"과 실행의 수를 조정합니다.
8. 응답 수를 선택하고 자신의 이름과 단위를 입력, 다음 페이지로 계속 진행합니다. 추가의 반응은 또한 디자인에 어떠한 부정적인 영향없이 데이터 평가 동안 언제든지 첨가 할 수있다.
9. 미상의 실행에 대한 요소 수준을 계산하는 알고리즘을 시작하기 위해 계속합니다. 선택된 기본 모델은 특정 인자에 대한 레벨의 수와 일치하지 않으면, 통지가 표시되고 계산은 시작하지 않을 것이다. 이 경우 하나
   1. 이 인자 수준의 수를 증가하거나
   2. 수준의 현재 수를 기준으로 계산 될 수없는 기본 모델의 조건을 취소합니다.
   3. 예를 들어, T의 요인 "배양 시간"T (즉, 2 D 5 D)에 대한 두 가지 수준이있는 경우그는 현재 디자인과 ^(2)가 선정 된 기간 T를 포함하는 차 기본 모델은 t의 세 번째 수준 (즉, 8 d)를 추가하거나 모델에서 계수 t ^2를 제거 하나.
10. 계산이 완료되면 표시되는 최적의 요소의 조합을 포함하는 스프레드 시트를 저장합니다.
11. "디자인"노드의 "평가"의 서브 노드를 선택하고 "그래프"탭으로 이동합니다.
    1. "그래프 도구"에서 "FDS"을 선택하고 "FDS 그래프"상자에 오류 유형으로 "들은 Pred"를 선택합니다. 그런 다음 각각 "D"및 "S"의 값 DsRed를위한 (여기 20 및 13 ㎍ / ㎖)로 섹션 1.1.1에 정의 된 시스템의 추정 표준 편차의 최소 검출 가능한 차이뿐만 아니라 대략적인 값)을 입력한다. 또한 응용 프로그램에 적합한 알파 수준 (허용 %가 큰 영향을 누락), 일반적으로 0.05 (5 %)를 입력합니다.
    2. ) 계산 FDS는 1.3 절에 정의 된 비율과 일치하는지 확인합니다 (예측 모델에 대한 일반적> 0.95). FDS 플롯의 평면 곡선 디자인 공간에 걸쳐 균일 예측 정밀도를 나타내는 것이 바람직하다.
       1. 이 경우 (여기에서 발견 그림의 (A)에 도시 된 바와 같이, FDS는 1 %였다)이 아닌 경우, "다시"디자인 "노드로 이동하여 작업 표시 줄에"설계 도구 "를 선택한 다음"증강 디자인을 ... "을 선택 "증가.
       2. 이전과 동일한 "검색"과 "최적 성"기준을 선택합니다. 또한 동일한 "편집 모델"과 "categoric 균형을 강제로"설정을 선택했다. 디자인의 증가는 (여기에 다 같이) 모든 실험 이전에 수행되는 경우, 변경 "블록 (Block)"으로 설정 "블록으로 실행을 넣어."
       3. "런"절에 부족 예상 중량을 최소 5 % "를 복제"및 "유지, 추가"모델 포인트 "의 번호를 입력의 적합 "전체 디자인. 여기에, 100 추가 실행 첨가하고, 더"를 복제 "와"맞는 부족을 추정 "는 포함되지 않았다.
       4. 계산이 완료되면, 전술 한 바와 같이 FDS 그래프를 재검토. FDS이 여전히 만족스럽지 않으면, 전술 한 바와 같이 설계 보강을 반복한다. 여기 FDS는 보강 후 100 %이고, 따라서 더 이상 확대 (그림 3B)이 필요하지 않았다.

FDS 플롯 3. 비교 그림. 90 런 이루어지는. DOE는 감지 할 수있는 최소의 차이 (20 ㎍ / ㎖) 및 ESTI 대한 값과 결합하여 이차 기본 모델을 이용하여, 예측의 표준 오차를 1 %의 불충분 FDS를 생산시스템 (8 ㎍ / ㎖). B의 표준 편차를 결합. (210) 실행의 총에 미상의 증가는 설계 전반에 걸쳐 모델의 균일 한 정도를 나타내는 100 % FDS와 평면 곡선을 달성했다.

3. 클로닝 및 발현 분석 카세트

1. 5 ㎖ LB 배지에서 대장균 양성 (10g / L의 트립 톤, 5g / L의 효모 추출물, 170 mM의 NaCl을 50 ㎎ / L의 암피실린, LB 한천 플레이트는 15g / L에 한천을 포함의 경우) 6, 37 ° C에서 160 rpm에서 진탕에 -8 시간 또는 하룻​​밤. 주의 : 암피실린은 유해 물질이다. 피펫 팁을 사용하여 접시에 성장 식민지에서 액체 배양 또는 전달 세포의 50 μL 하나와 LB 배지에 접종한다.
2. PSO 플라스미드 DNA의 정제, 및 E.로부터 pPAM (GenBank 등록 AY027531)의 다른 유도체를 들면 대장균 K12 균주 DH5a은, DNA 정제 키트 설명서 ^(24)의 지시를 따릅니다. 주의 : 정화 K그것은 (자세한 내용은 사용 설명서 위 참조) 유해 화학 물질이 포함되어 있습니다. 플라스미드 시퀀스는 그림 4와 구매자 등. ^(20)에 의해 설명되어 있습니다.
3. NanoDrop 장치의 260 ㎚에서 2 μL 샘플의 흡광도를 측정함으로써 정제 된 DNA 용출액의 농도를 결정한다.
4. 제한 엔도 뉴 클레아 (해상도)와 소화에 의해 정제 된 플라스미드 DNA의 신원을 확인합니다.
   1. 고유하고 구별 단편 패턴이 생성되도록 플라스미드 순서에 따라 입술을 선택한다. 이러한 반응의 양, 시간, 온도 및 안정 소 혈청 알부민 농도와 소화의 조건에 대한 제조업체의 권장 사항을 따르십시오. 감도에 따라 분석 장치는 소화 당 플라스미드 DNA의 50-500 NG를 사용한다.
   2. 트리스 - 붕산-EDTA (TBE) 버퍼 (; 산도 8.0 90 MM 트리스, 90 mM의 붕산, 2 mM의 EDTA)에 아가로 오스 끓여 DNA 조각의 분리에 대해 0.8 ~ 2.0 % 젤을 준비합니다. 티그는 큰 기대 단편은 아가 로스가 적은 겔에 사용되어야한다.
   3. 50 μL에 5 배 샘플 버퍼의 5 μL (배 SABU, 0.1 % (W / V) 브로 모 페놀 블루, 0.1 % (W / V) 크실렌 cyanol, 10 % (TBE에 용해 W / V) 글리세롤)를 추가 DNA 샘플 RE 처리 및 ~ 40 분 또는 단편의 명확한 분리가 달성 될 때까지, 100 V에서 아가 로스 겔 전기 영동으로 분리 단편. 각 젤에서 비교를 위해 DNA 사다리 크기의 마커를 포함하는 레인, 예를 들면 2 ~ 3 ㎕의 1-KB 사다리 있습니다.
5. 다른 세 5'UTRs 중 하나 PSO의 오메가 'UTR를 교체합니다.
   1. 60 분 ~ 37 ° C에서 20 에코 RI-HF의 단위와 NEBuffer 4 NCO I-HF 입술로 처리하여 ~ 4 μg 정제 PSO의 DNA에서 오메가 'UTR 순서를 해제합니다. 섹션 3.4.2와 3.4.3에 설명 된대로 조각을 분리합니다.
   2. 여분의 겔을 사용하는 아가로 오스 겔로부터 큰 단편 (PS "백본") 격리제조사의 설명서 ^(25)와 섹션 3.3에 설명 된대로 정제 된 DNA의 농도를 결정)에있어서의 ction 키트. 주의 : 젤 추출 키트는 유해한 화학 물질을 포함하는 자세한 내용은 설명서를 참조하십시오.
   3. 60 분 ~ 37 ° C에서 20 에코 RI-HF의 단위와 NEBuffer 4 NCO I-HF RE가 각각 벡터 ~ 10 μg을 처리하여 적합한 기증자 벡터에서 CHS, CHS-LPH 및 TL 5'UTRs을 분리합니다. 그런 섹션 3.4.2 및 3.4.3에 설명 된 단편을 분리 및 섹션 3.5.2에 설명 된대로 작아 5'UTR - 함유 단편을 정제.
   4. 제조업체의 권장 사항 ^26에 따라 5 분 동안 25 ° C에서의 고립 된 정제 선형 추신 벡터에 별도의 분량 씩 분리 된 정제 5'UTRs을 결찰. ~ 50 벡터 DNA의 NG 및 20 μL의 총 부피의 5'UTR DNA의 3 배 몰 과량을 사용한다.
6. 번째로 변환 대장균 세포전자 재조합 플라스미드 ^{(26, 27).}
   1. 추가 ~ 10 NG 내고 혼합물 (~ 4-5 μL) (섹션 3.5.4 참조) 50 μL RbCl 관할 E. 대장균과 부드럽게 혼합 한 후 얼음에 30 ~ 60 분 동안 품어. 5 ~ 30 분 동안 얼음에 42 ° C와 감기에서 1.5 분간 열 충격.
   2. 항생제없는 LB 배지 950 μl를 추가하고 37 ° C에서 1 시간, 160 rpm으로 배양한다. 형질 전환 체의 선택을위한, 암피실린을 함유하는 LB 아가 플레이트상에서 배양의 50 및 100 μl를 확산하고 37 ℃에서 ~ 16-20 시간 동안 인큐베이션
   3. 암피실린을 포함하는 LB 배지 5 ㎖의 분취 량으로 3.1 절에 설명 된 각각의 프로모터 'UTR 결찰을 나타내는 5-10 별도의 식민지를 접종한다. 그런 다음 플라스미드 DNA를 정제 및 섹션 3.2-3.4에 설명 된대로 해당 ID를 확인합니다.
7. NEBuff에 오름차순 I 에코 RI 된 RE를 사용하여 네 'UTR 플라스미드 각 NOS 프로모터와 35SS 프로모터를 교체어 섹션 3.5 및 3.6에서 1 시간 동안 37 ° C에서 기술 한 바와 같이, 4.
8. A.에 팔 얻어진 플라스미드를 각각 소개 일렉트로 ^(28)에 의해 pMP90RK : 변형 GV3101을 투메 파시 엔스.
   1. 50 μL 능력 A.에 정제 된 플라스미드 DNA의 ~ 500 NG 추가 얼음에 세포를 투메 파시 엔스. 부드럽게 혼합 prechilled 0.2 cm의 일렉트로 베트로 전송할 수 있습니다. 혼합물 베트의 하단에 거품이있는지를 확인해야합니다.
   2. 펄스 세포 5 밀리 2.5 kV의 펄스에서의 강도 및 지속 시간을 확인한다.
   3. DNA 샘플 또는 관할 A. 잘못된 대비 높은 소금 농도를 피 이러한 크게 변형 효능을 감소 세포 현탁액을 즉시 기화를 일으키는 높은 이온 전류를 초래할 수 있기 때문에 세포 투메 파시 엔스.
   4. 항생제없이 YEB 매체의 950 μL (5g / L 쇠고기 추출물, 1g / L의 효모 추출물, 5g / L의 펩톤 추가전자, 5g / L의 자당, 2 ㎜ _망초, 산도 7.0), 부드럽게 혼합 및 멸균 1.5 ML 반응 관에 바로 전송할 수 있습니다. 26 ~ 28 ° C와 160 rpm에서 2 ~ 4 시간 동안 배양한다.
   5. (50 ㎎ / L 항생제를 포함 YEB 한천 플레이트에 1-2 μl를 확산   형질 전환 체의 선택 카르 베니 실린, 25 ㎎ / L 카나마이신, 25 ㎎ / L의 리팜피신). 주의 : 리팜피신은 독성 물질이다.
   6. 각 프로모터 'UTR 결찰을 나타내는 별도의 식민지에서 세포와 항생제를 포함 YEB 매체의 세 5 ㎖의 분취 량을 접종하고 26 ~ 28 ° C와 160 rpm에서 48 ~ 72 시간 동안 배양한다.
9. A.의 성공을 확인 변환을 투메 파시 엔스.
   1. 전송 섹션 3.8.6에서 각각 나누어지는 2 μL는 PCR의 mastermix 48 μL 씩 분주 (각 10 μM 프라이머 주식의 2 μL (각 프라이머의 400 nm의 최종 농도)를 분리하는1 μL 10 밀리미터의 dNTP 믹스 (각 옥시 뉴 클레오 시드 삼인산 200 μM 최종 농도), 5 ㎕의 10 배 825 μL) 고 충실도 효소 믹스를 확장하고 39.25 ㎕의 멸균 증류수, 15 mM의 _MgCl2를 가진 고 충실도 버퍼를 확장합니다.
   2. 적절한 프라이머를 사용하여 각 플라스미드의 발현 카세트 (FWD 증폭 : 5'-CCT CAG GAA GAG CAA TAC-3 ', 프로모터의 상류 1,026 뉴클레오타이드를 바인딩; REV : 5'-CCA AAG CGA GTA CAC AAC-3', 바인딩 적절한 PCR 조건에서) 35S 폴리아 데 닐화 사이트 내. 여기에, 94 ° C에서 15 초 동안 94 ° C의 변성 30 회 반복 초기 변성에 사용하고, 30 초, 120 초 동안 72 ° C의 신장을위한 51 ° C에서 어닐링, 8, 72 ° C에서 최종 신장 단계 분.
   3. 3.4.3 절에서 설명한 바와 같이, 아가 로스 겔 전기 영동에 의해 PCR 생성물의 크기를 결정한다.
10. A. 준비 에 의해 글리세롤 주식을 투메 파시 엔스A. 500 ㎕를 500 ㎕의 50 %가 혼합 (V / V) 멸균 글리세롤 변환 (섹션 3.9.3) 확인 된의 섹션 3.8.6에서 문화를 투메 파시 엔스. 추가로 사용할 때까지 -80 ° C에서 글리세롤 주식을 저장합니다.
11. RNAfold 웹 서버 ^(29)를 사용하여 상이한의 mRNA 접히는 에너지를 계산하고, 부호화 영역의 제 50 염기쌍까지 전사 개시 사이트에서 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
    1. "알고리즘과 기본 옵션을 접어"절에있는 "최소한의 자유 에너지 (MFE) 및 파티션 기능"및 옵션 "고립 된 염기쌍을 방지"를 선택합니다.
    2. 에서 "고급 접이식 옵션" "어떤 경우에도 나선의 양쪽에 에너지 매달려"를 선택, "RNA 매개 변수 (터너 모델, 2004)"및 25 ° C.에 "주어진 온도 (C) 에너지 매개 변수를 재조정"변경
    3. "출력 옵션"섹션에서 모든 옵션을 선택합니다.
    비교 값 "앙상블의 MFE 구조의 주파수" "열역학적 앙상블의 자유 에너지"와 압축을 풉니 다.

그림 4. 발기인 및 5 'UTR이 발현 카세트가 NOS 순서가 네 개의 추가 변종을 산출하고이 프로모터의 교체 다음에 CaMV 35SS 발기인 네 개의 조합의 결과로,'UTR의 단계적 교환에 의해 생성 된. 변종 8 개의 서로 다른 프로모터 / 'UTR 조합의 총.

4. 식물 재배

1. 비료의 0.1 % 용액을 제조 FertypH가 5.9​​에서 탈 이온수에서 2 메가.
2. 잔류 화학 물질을 제거하고 마지막으로 비료와 평형을 탈 이온수로 광범위한 세척에 의해 10 × 10 × 8cm의 암면 블록을 준비합니다.
3. 비료 멀리 씨앗을 세척에주의하면서 짧은 플러시 다음 각 암면 블록에 1-2 담배 씨앗을 배치하여 종자 담배 식물을.
4. 발아 22분의 25 ° C의 주 / 야간 온도, 상대 습도 70 % 및 16 시간의 광주에서 온실에있는 42 일 동안 담배 식물을 경작 (180 밀리몰 초 ^-1 m ^-2를, λ = 400 ~ 700 nm의) . 이 광주 동안 수경에 15 분마다 시간을위한 비료와 관개.

5. 과도 단백질 발현

1. A. 준비 잎에 주입 투메 파시 엔스.
   1. 1 % A.와 항생제를 포함 YEB 매체의 5 ~ 50 ㎖를 접종 크라이 주식 문화를 투메 파시 엔스와 OD <때까지 27 ° C에서 알을 품다서브> 600NM 5.0 (~ 48 ~ 72 시간 볼륨과 용기의 종류에 따라)에 도달한다.
   2. A. 희석 물 주입에 필요한 OD의 _{600 ㎚에 맞게} 2 배 침투 매체 (4.3 g / L 무라 시게와 스쿡 염 (산도 5.6), 5g / L의 자당, 1.8 g / L의 포도당, 100 MM의 아세토 시린 곤)와 튜메 파시 엔스 문화. 바로 주입하기 전에 외경 _{600 ㎚을} 확인합니다. 참고 : ~ 1.43 ± 0.12 × 10 ⁹ 식민지 ML 당 단위를 형성하는 1.0 대응의 외경 _{600 ㎚를.}
2. A.를 주입 잎에 현탁액을 투메 파시 엔스.
   1. 선택 (예 : 미상 전략에 따라) 처리하는 그 noncotyledon 나뭇잎과 위치를 레이블.
   2. 다른 A를 주사하지 말라 같은 늑간 필드에 솔루션을 투메 파시 엔스. 대신, 중간 정맥 축 양쪽에 반대 섹션을 사용합니다. 두 개 이상의 서로 다른 해법은 동일한 위치에 주입 될 필요가있는 경우에이 additiona를 사용L 공장.
   3. 철저 A.를 흔들 1-ML의 주사기에 희석 대기음을 준비하고 있기 때문에 정착 할 수있는 세포를 재현 탁하는 튜메 파시 엔스 솔루션입니다.
   4. 부드럽게 A.의 유입을 용이하게하기 위해 유사한 피펫 팁 또는 함께 주입위한 위치에 표피를 긁어 솔루션을 투메 파시 엔스. 그렇게하는 동안 잎 블레이드를 파열하지 마십시오.
   5. 처리 부드럽게 잎의 아래쪽에 (붙어 있던 바늘) 콘센트를 밀어하는 늑간 필드에 대한 배럴을 감동 잎 잎에 수직으로 주사기를 잡고. 변속 또는 파열로부터 엽신 않도록 부드럽게 동시에 잎의 상면을 누른다.
   6. 조심스럽게 주사기의 피스톤을 아래로 밀어 넣습니다. A. 어두운 녹색 촉촉한 나타나는 처리로 표시된 영역으로 튜메 파시 엔스 솔루션은 잎 잎에서 세포 간 공백을 입력합니다. 전체 intercosta 때까지 여러 위치에서이 절차를 반복합니다L 필드는 A로 침투 튜메 파시 엔스. 그런 다음 늑간 필드를 계속합니다.
   7. 확인 주사기 잎에 수직으로 유지합니다. 주사기를 기울 세균 현탁액을 고압 하에서 날릴하게됩니다.
   8. 다른 경우 A. 튜메 파시 엔스 솔루션은 (예 : 다른 프로모터를 테스트하기 위해) 사용하는 다음 해결책을 적용하기 전에 유사한 종이 타월 또는을 사용하여 첫 번째 주입에서 나뭇잎의 밑면에 남아있는 여분의 용액을 제거.
3. 식물과 샘플링의 포스트 침투 배양.
   1. 처리 식물을 phytotron 준비 ~ 미상에 필요한 수준에서 온도와 습도 평형을 허용 주입하기 전에 24 시간.
   2. 주입 후, phytotron에 식물을 전송하고 미상에 의해 결정 배양 기간이 끝날 때까지 물을 관개를위한 충분한 트레이에 배치합니다.
   3. 16 시간의 사 ž을 설정operiod 0.7 m ² 당 6 오스람 차가운 백색 36 W 형광등 사용 (75 밀리몰 초 ^-1 m ^-2를, λ = 400 ~ 700 nm 정도). 0.7 m ² 당 6 식물의 수를 제한하여 서로 차광으로부터 식물을 막는다.
   4. 샘플링하기 전에 올바른 늑간 필드가 5.2.1 및 피해자의 계획에 추가 레이블을 비교하여 선택한 확인하십시오.
   5. 미상에 표시된 위치와 시간에 처리 늑간 필드에서 4 ~ 5 잎 디스크를 제거하기 위해 코르크 송곳을 사용합니다. 샘플링하는 동안 공장에서 전체 잎을 제거하지 마십시오. 파열을 방지하기 위해 디스크를 제거하는 동안 휴대용 종이 타월로 잎을 안정.
   6. 각 시료의 질량을 결정하고 샘플 이름과 질량으로 표시 1.5 ㎖의 플라스틱 반응 관에 배치합니다. 단백질 정량 전에 -20 ° C 또는 -80 ° C에서 샘플을 저장합니다. 이 과정은 샘플의 안정성에 따라 몇 달 동안이 단계에서 일시 중지 할 수있다및 보관 온도.

6. 단백질 정량

1. 잎 디스크 샘플에​​서 단백질을 추출합니다.
   1. 샘플 질량의 밀리그램 당 더 큰 파편이 남아 있지 않을 때까지 전동 유봉을 사용하여 반응 관의 리프 디스크 그라인드; (산도 8.0 50 mM의 인산 나트륨, 500 mM 염화나트륨) 추출 완충액 3 mL를 넣고. 샘플의 과열을 방지.
   2. 4 ℃에서 20 분 동안 16,000 XG에서 두 번 샘플을 원심 분리하여 분산 된 고체를 제거 펠렛을 방해하지 않고 각 단계 후 깨끗한 1.5 ml의 반응 튜브에 뜨는을 전송합니다.
   3. 원심 분리 후, 처리는 식물 시료의 안정성 및 저장 온도에 따라 수개월 -20 ° C 또는 -80 ° C에서 추출하고 동결 일시 정지 될 수있다. 동결 - 해동 사이클은 표적 단백질 (들)의 농도에 영향을주지 않는 것을 확인한다.
2. DsRed를 형광을 측정합니다.
   1. 블랙 96 - 웰 반 지역 플레이트 (물론 당 50 μL 추출물)로 각 샘플의 세 가지 기술은 복제를 준비합니다. 피펫 팅하는 동안 거품의 형성을 피할 것.
   2. 라이너의 기준 곡선을 생성하는 96 - 웰 플레이트 당 DsRed를 표준의 여섯 희석 (0, 25, 75, 125, 175, 225 ㎍ / ㎖) 세트를 사용합니다. PBS에 희석을 준비 3 개월 이내에 사용을위한 4 ° C에서 저장합니다.
   3. 25분의 530 nm의 여기 및 35분의 590 nm의 방출 필터 장착 96 - 웰 플레이트 판독기에서 순차적으로 두번 형광을 측정한다.
   4. 각 샘플의 경우, 두 가지 이상의 형광 판독 세 기술적 반복 실험의 평균을 0 ㎍ / ㎖의 DsRed를 함유 안함 제어에 대하여 값을 뺀다. 또한 표준 희석 읽기에서이 값을 빼고 (좌표의 원점을) 참조 곡선을 산출 선형 회귀 이러한 빈 보정 값을 사용합니다.
   5. F 변환하는 기준 곡선의 기울기를 사용DsRed를 농도에 샘플을 측정 luorescence. 필요한 경우, 판독이 표준 농도 간격 내에 있도록 시료를 희석하고 후속 계산에이 희석 인자를 고려한다.
3. 2G12의 농도를 결정합니다.
   1. 하나의 플로우 셀의 활성화 된 표면에 단백질을 결합하여 항체 농도의 측정을 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 장치를 준비한다. 단백질 ^{(30, 31)의} 커플 링을하지 않고 표면을 불 활성화에 의해 기준으로 다른 흐름 셀을 사용합니다.
   2. 식물 SPR 실행 완충액 (10 mM의 HEPES pH를 7.4, 3 mM의 EDTA, 150 mM의 염화나트륨, 0.05 %의 v / V 트윈 -20) 1:20를 추출 희석 세에서 단백질에 결합하는 항체의 반응 유닛 (RU)을 측정 90 μL 주입 (30 μL / 분으로 180 초)의 단부에서 각 샘플의 데이터 복제합니다. 실험 FL 측정 RU에서 레퍼런스 플로우 셀 (무 단백질 A)에서 측정 RU 빼기아우 셀 (단백질 표면).
   3. 각 샘플 10-15 후 585 NG / ㎖ 2G12 표준을 측정하고 상술 한 바와 같이 레퍼런스 흐름 세포 측정 값을 뺀다. 좌표의 원점을 선형 기준 곡선을 계산하기 위해 이러한 기준의 평균 RU를 사용한다.
   4. 1시 20분 희석액과 기준 곡선의 기울기에 기초하여 상기 샘플에서 2G12 농도를 계산한다.
   5. 어떤 손상 될 수 측정, 기준 셀에 강한 비 특이 결합을 확인합니다. 또한 큰 변화가 단백질 표면의 노화를 반영으로 2G12 표준은, 분석을 통해 거의 일정한 값 (<5 % 변동)을 유지하는지 여부를 확인합니다.

7. 데이터 분석 및 평가

1. (II) 비정상적인 결과, 예를 들어, 인자 조합 유전자, 수동 (I) 극단 값을 나타내는 (높거나 낮은) 측정 오류에 대한 식 실험에서 관찰 된 반응을 분석데이터 교환을 나타내는 예기치 못한 반응을 평가하고, (ⅲ) 값을 누락.
   주 : 결함이있는 데이터를 기반으로 모델 구축을 방지하기 위해 이러한 작업을 사용합니다.
2. DesignExpert의 "디자인"노드로 분석 된 응답 데이터 (여기에서 단백질 농도)를 전송합니다. 응답 데이터가 올바르게 대응하는 요인 설정에 할당되어 있는지 확인합니다. 측면 아래 주소 커버 DesignExpert 소프트웨어에서 사용할 수있는 광범위한 도움말 섹션이 있습니다.
3. "분석"노드에서 분석 할 응답을 선택하고 처음 변환 탭에서 "없음"을 선택합니다.
   참고 : 변환은 10보다 큰 응답의 최대 / 최소 비율을 권장합니다. 가장 유용한 변환은 아래에서 설명하는 "진단 도구"(7.8 절)의 "진단"절에있는 "진단"탭에서 박스 콕스 플롯에서 얻을 수 있습니다. 로그인 ₁₀ 변환은 종종 적절하다.
조사중인 시스템 (예를 들어, 두 가지 요소의 상호 작용, 차 효과)에 중요한 요인에 대한 일반적인 정보를 제공하는 "맞춤 요약"탭으로 이동합니다. 이 소프트웨어는 그 중요성에 따라 초기 모델을 제안합니다.
4. "모델"탭에서, 초기 모델은 "적당한 요약"결과에 따라 미리 선택됩니다. 이 모델을 편집하는 자동 모드를 사용합니다 :
   1. 제안 된 모델은 "2FI"(두 가지 요인의 상호 작용) 인 경우 "이차"를 선택 한 위해 제안 된 모델 위에 "프로세스 순서"예를 선택합니다.
   2. 반복적으로 처음에 0.100해야한다 "알파 중"값을 기준으로 "분산 분석"탭으로 진행 한 후 모델에서 비 유효 조건을 제거 할, "선택"필드에서 "뒤로"를 선택합니다.
   3. 소프트웨어에 의해 요청하는 경우이 necessar 때문에, 항상 자동으로 모델 계층 구조를 수정신뢰할 수있는 모델 ^{(32, 33)를} 생성하는 예.
5. "ANOVA"탭에서 제안 된 모델과 포함 인자를 조사합니다. 필요한 경우, 수동으로 "선택"을 변경, 다시 "모델"탭으로 전환하여 (5 % 유의 수준에 해당하는, 여기에 0.05) 미리 정의 된 임계 값보다 P-값으로 모든 요소를​​ 제거하거나 가능성이 기계적인 고려를 기반으로하는 그 "매뉴얼"과 모델에서 해당 요소를 제거.
6. 위로 "ANOVA"탭에서, "모델"(이 의미를 나타 내기 때문에 낮은 값이 바람직하다)와 "부족 -의 적합"(높은 값의 P-값의 관점에서 새로 모델을 평가하는 것이 바람직합니다 이 의미의 부족)뿐만 아니라 "R-제곱"의 값을 나타 내기 때문에 (> 0.80 값이 세 가지 값 바람직하다), "R-제곱 조정"과 "R-제곱 예측".
   1. fo를이 값을 비교몇 가지 유의 수준에서의 요인을 제외하고 /를 포함한 다양한 모델을 r에.
      참고 :이 "디자인"노드의 응답 열을 복제하고 개별적으로 분석을 수행, 또는 스프레드 시트와 같은 다른 프로그램에 전체 "ANOVA"테이블을 수출하는 데 도움이 될 수 있습니다.
7. 모델의 품질을 확인하고 "진단 도구"에있는 모든 탭 ( "진단"와 "영향"섹션)을 검사하여 모델에 강한 영향을 데​​이터 집합의 잠재적 인 특이점을 감지하는 "진단"탭으로 이동합니다 .
   1. "진단 도구"의 "진단"섹션에서 다음 작업을 수행합니다 :
      1. 확인 포인트는 무작위의 범위 내에서 흩어져있는 차트 "잔차 대 예측". 여기서, 갈매기 모양의 분포는 데이터 변환의 필요성을 나타냅니다.
      2. 확인 포인트 무작위의 한계 내에 흩어져차트를 "잔차 대 예측". 여기서, 갈매기 모양의 분포는 데이터 변환의 필요성을 나타냅니다.
      3. 조사 "잔차 실행 대"차트 분산의 점은 무작위 범위 내에서 여부. 패턴 (예 : "계단") 모델에 미치는 영향을 상쇄하는 데 사용할 수있는 데이터 블록 건물의 경향을 나타냅니다.
      4. 줄거리 "실제 대 예측"의 이상적인 모델을 나타내는 직선 대각선 줄을 찾습니다. 대각선 주변 데이터의 산란 큰, 덜 정확한 모델.
      5. 데이터 변환을 나타내는 파란색 (최고) 및 녹색 상자 - 콕스 음모 (실제) 수직 라인의 중복을 확인합니다. 녹색 라인 (빨간색 수직선으로 표시 간격에) 블루와 일치하지 않는 경우에는 다시 7.3으로 이동하여 상자 - 콕스 음모에 의해 제안 된 데이터 변환을 선택하여 모델 구축 라운드를 향상시킬 수 있습니다. 또 다시의 중복sponse 열은 서로 다른 모델을 비교하는 것이 유용 할 수 있습니다.
      6. "잔차 요인 대"차트 (각 모델 요소에 대한 하나의 차트가)의 포인트 범위 내에서 무작위로 분산해야합니다. 데이터 분배 곡률이 모델에서 결함 요소를 나타낼 수있다.
   2. "진단 도구"의 "영향"섹션에서 "활용", "DFFITS"와 "DFBETAS"플롯과 균등하게 낮은 분포하지 않고, 반드시 "외부 스튜던트 잔차"의 범위 내에서 데이터의 임의의 산란이 확인 "요리사의 거리"음모 극단 값.
8. "모델 그래프"탭에서 평가 모델을 시각화. 숫자 요인의 한정 (예 3) 반응 표면 ( "3D 표면") 표현은 수동 옵티마 / 특성을 평가하는 데 유용합니다.
   주의 : 반응 표면 만이 FAC의 영향을 도시조사에서 응답에 TORS. 응답에서 추가 요소의 효과는 "요인 도구"창에서 값 (숫자 요인) 또는 레벨 (categoric 요인)을 변경하여 공개합니다. 또한, 요인 "요인 도구"윈도우에 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 원하는 독립 변수 축을 선택하여 플롯 축에 할당 할 수 있습니다.
   1. 요소 레벨을 조작하고 "요인 도구"를 사용하여 그래프 좌표에 할당 할.
   2. "파일"탭에서 명령을 ... "파일로 내보내기 그래프"를 사용하여 수출 그래프.
9. 를 통해 (예를 들어, 한계 및 무게) 차례로 특정 제약 조건이 적용될 수있는 모델 요소에 따라 (범위, 최대화, 최소화) 수치 응답을 최적화하기 위해 "최적화"노드의 "수치"서브 노드를 사용 "기준"탭을 선택합니다.
   1. "솔루션"의 계산과 수치 해석을 검토"기준"탭에서 제공되는 입력에 따라 탭을 선택합니다.
   2. 높거나 낮은 응답 값과 관련된 요인의 설정을 표시하는 추가 분석 (예 : 막대 그래프) 다른 소프트웨어 (예 : 스프레드 시트)에이 솔루션을 내 보냅니다.
      참고 : 세 개 이상의 숫자 요인을 조사 및 3D 표현이 어려운 경우이 도움이됩니다.
10. 특정 요소 설정에 대한 응답을 예측하는 "포인트 예측"하위 노드를 사용합니다.
    1. 모든 설정 (여기 모든 프로모터 'UTR 조합뿐만 아니라 모든 나뭇잎과 배양 시간 또는 잎의 위치와 배양 온도)를 평가하는이 예측을 사용합니다.
    2. 예측값을 내보내고 특정 시간에 특정 프로모터 5'UTR 조합에 대한 식을 계산함으로써, 예 담배 식물에서 일시적 발현을 설명하는 데 사용할 수있는 데이터 배열로 컴파일 모든 리프 위치 또는 아크로 걸쳐 평균화식물의 SS는 모든 잎.
    3. 특정 발현 량 (μg g ^-1) 또는 특정 발현율 (μg의 g ^{-1 열연 -1)을} 수득 다른 나뭇잎의 질량에 기초하여 발현 데이터를 정규화.
    4. 또한, 스프레드 시트로 "ANOVA"탭 하단에서 '최종 방정식 "의 계수를 내보내고 동일한 데이터 배열을 얻을 수있는 요소 설정의 배열을 곱합니다.
       주 : 장착 모델 방정식 추정에 적합하지 않기 때문에이 배열은, 초기 설계 공간 내에서 계수 값을 포함 할 수있다.
11. 주요 관심의 모델 점에 대한 확인 실험을 실시한다.
    1. "포인트의 예측"(7.11) 선택 조건에서 과도 단백질 발현을 수행합니다. 예를 들어 동일한 온도와 잎 등을 사용
    2. 이 일시적 발현 전자의 단백질 농도를 결정등 (제 6 조) 위의 설명과 모델에 의해 예측 된 값과 비교 xperiment.
    3. 확인 실험에서의 평균 단백질 농도 포인트 예측 동안에 얻어진 반응 표면 모델의 예측 간격 내에 있는지 여부를 확인한다. 매치는 모델의 예측 능력을 확증한다. 불일치가 낮은 모델의 품질과 추가 실행이 필요 할 수 있습니다 나타냅니다.
    4. 주 : 식물 배치 간 변동성 예측 간격을 넓혀 및 식물의 다른 배치로 수행 확인 실험을 평가 절하있다. 그러나 모델을 생성하는 데 사용하지만, 샘플 모델에 포함 된 그 같은 식물 배치에서 유래되지 않은 샘플은 효과적인 제어를 제공 할 수 있습니다.

결과

다른 발기인 및 5'UTRs를 사용하여 일시적 발현시 DsRed를 축적에 대한 설명 모델

잎 추출물의 형광 DsRed를 재조합 단백질의 발현 수준을 나타 내기 때문에 미상 전략에 대한 응답으로 사용되었다 사용 하였다. 우리가 중요한 고려 최소 검출 가능한 차이가 20 ㎍ / ㎖의이었고 시스템의 추정 표준 편차는 초기 실험을 기준으로 13 ㎍ / ㎖의이었다. 일시적 발현 모델?...

토론

자원은 종종 부족하고 비용 때문에 모든 실험은 신중한 계획이 필요합니다. 계획 단계 (예를 들어, 모든 중요한 요소의 상호 작용을 포함하지 않는 기본 모델을 선택)하는 동안 오류가 실질적 결과 모델의 예측 능력을 감소함으로써 전체 실험을 평가 절하 할 수 있기 때문 미상 전략에 특히 사실이다. 그러나 이러한 오류는 쉽게 기본 절차에 따라 피할 수 있습니다.

미상 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.	DoE software
Tryptone	Carl Roth GmbH	8952.2	Media component
Yeast extract	Carl Roth GmbH	2363.2	Media component
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Media component
Ampicillin	Carl Roth GmbH	K029.2	Antibiotic
Agar-Agar	Carl Roth GmbH	5210.2	Media component
Escherichia coli K12 DH5a	Life Technologies	18263-012	Microorganism
pPAM	GenBank	AY027531	Cloning/expression vector;
NucleoSpin Plasmid	MACHEREY-NAGEL GmbH	740588.250	Plasmid DNA isolation kit
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up	MACHEREY-NAGEL GmbH	740609.250	Plasmid DNA purification kit
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	n.a.	Spectrophotometer
NcoI	New England Biolabs Inc.	R3193L	Restrictionendonuclease
EcoRI	New England Biolabs Inc.	R3101L	Restrictionendonuclease
AscI	New England Biolabs Inc.	R0558L	Restrictionendonuclease
NEB 4	New England Biolabs Inc.	B7004S	Restrictionendonuclease buffer
TRIS	Carl Roth GmbH	4855.3	Media component
Disodium tetraborate	Carl Roth GmbH	4403.3	Media component
EDTA	Carl Roth GmbH	8040.2	Media component
Agarose	Carl Roth GmbH	6352.4	Media component
Bromophenol blue	Carl Roth GmbH	A512.1	Color indicator
Xylene cyanol	Carl Roth GmbH	A513.1	Color indicator
Glycerol	Carl Roth GmbH	7530.2	Media component
Mini-Sub Cell GT Cell	BioRad	170-4406	Gel electrophoresis chamber
Agrobacterium tumefaciens strain GV3101:pMP90RK	DSMZ	12365	Microorganism
Electroporator 2510	Eppendorf	4307000.658	Electroporator
Beef extract	Carl Roth GmbH	X975.2	Media component
Peptone	Carl Roth GmbH	2365.2	Media component
Sucrose	Carl Roth GmbH	4621.2	Media component
Magnesium sulfate	Carl Roth GmbH	0261.3	Media component
Carbenicillin	Carl Roth GmbH	6344.2	Antibiotic
Kanamycin	Carl Roth GmbH	T832.3	Antibiotic
Rifampicin	Carl Roth GmbH	4163.2	Antibiotic
FWD primer	Eurofins MWG Operon	n.a.	CCT CAG GAA GAG CAA TAC
REV primer	Eurofins MWG Operon	n.a.	CCA AAG CGA GTA CAC AAC
2720 Thermal cycler	Applied Biosystems	4359659	Thermocycler
RNAfold webserver	University of Vienna	n.a.	Software
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Grodan Rockwool Cubes 10 x10 cm	Grodan	n.a.	Rockwool block
Greenhouse	n.a.	n.a.	For plant cultivation
Phytotron	Ilka Zell	n.a.	For plant cultivation
Omnifix-F Solo	B. Braun	6064204	Syringe
Murashige and Skoog salts	Duchefa	M 0222.0010	Media component
Glucose	Carl Roth GmbH	6780.2	Media component
Acetosyringone	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Phytohormon analogon
BioPhotometer plus	Eppendorf	6132 000.008	Photometer
Osram cool white 36 W	Osram	4930440	Light source
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Centrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuge
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Fluorescence plate reader
Biacore T200	GE Healthcare	n.a.	SPR device
Protein A	Life Technologies	10-1006	Antibody binding protein
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Media component
Tween-20	Carl Roth GmbH	9127.3	Media component
2G12 antibody	Polymun	AB002	Reference antibody