في الجسم الحي التصوير من الألياف البصرية النزاهة العصب عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي تعزيز التباين في الفئران

Summary

يوضح هذا الفيديو طريقة، وذلك باستخدام الماسح الضوئي السريرية 3 T، مقابل تعزيز النقيض MR التصوير من الفأرة البصرية والسذاجة الإسقاط لفي الدراسات المجراة المتكررة والطولي للانحطاط العصبية البصرية المرتبطة الحادة إصابة العصب البصري سحق والمزمنة الضمور في العصب البصري الفئران خروج المغلوب (P50 ^KO).

Abstract

النظام البصري القوارض يشمل خلايا الشبكية العقدة والمحاور العصبية الخاصة التي تشكل العصب البصري لدخول مراكز مهادي والدماغ المتوسط، والتوقعات بعد المشبكي إلى القشرة البصرية. بناء على بنيتها التشريحية متميزة ومريحة للمعاقين، فقد أصبح الهيكل المفضل للدراسات على بقاء الخلايا العصبية، وتجديد محور عصبي، واللدونة متشابك. وقد مكنت التطورات الأخيرة في MR التصوير والتصور في الجسم الحي من الجزء retino سقفي هذا الإسقاط باستخدام المنغنيز بوساطة تعزيز النقيض (ميمري). هنا، نقدم بروتوكول اورده من أجل التوضيح من الإسقاط البصرية في الفئران، الذي لا يمكن أن يتحقق قرارات (200 ميكرون) ³ 3 المشتركة باستخدام الماسحات الضوئية تسلا. ونحن لشرح كيفية حقن intravitreal من جرعة واحدة من 15 نانومول MnCl ₂ يؤدي إلى تعزيز المشبعة من الإسقاط سليمة في غضون 24 ساعة. مع استثناء من شبكية العين، وindepen التغيرات في كثافة إشارةدنت من التحفيز البصري وتزامن أو الشيخوخة الفسيولوجية. نحن مزيد من تطبيق هذه التقنية لرصد طوليا تنكس محور عصبي ردا على الحادة إصابة العصب البصري، وهو النموذج الذي المنغنيز ^{2 +} النقل الاعتقالات تماما في موقع الآفة. على العكس، ونشط المنغنيز ^{2 +} النقل يتناسب كميا لبقاء، العدد، والنشاط الكهربائي من الألياف محور عصبي. لمثل هذا التحليل، ونحن مثالا المنغنيز ^{2 +} حركية النقل على طول المسار البصري في نموذج الفأر وراثيا (NF-P50 كيلوبايت ^KO) عرض ضمور عفوية من الحسية، بما في ذلك المرئية والتوقعات. في هذه الفئران، اورده يشير إلى انخفاض ولكن لا تتأخر المنغنيز ^{2 +} النقل بالمقارنة مع الفئران نوع البرية، وبذلك تكشف علامات ضعف الهيكلية و / أو وظيفية عن طريق الطفرات NF كيلوبايت.

باختصار، اورده الجسور مريح في الجسم الحي المقايسات والأنسجة بعد الوفاة لcharacterizatiعلى النزاهة الألياف العصبية والنشاط. ومن المفيد للغاية لدراسات طولية على تنكس محور عصبي والتجديد، والتحقيقات في فئرانا معدلة وراثيا لالظواهر حقيقية أو محرض.

Introduction

على أساس هيكلها العصبية التشريحية مواتية النظام البصري القوارض يقدم إمكانيات فريدة من نوعها لتقييم المركبات الدوائية وقدرتها على التوسط العصبية ¹ أو الآثار المؤيدة ^لل2،3 التجدد. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح دراسات عن الخصائص الوظيفية والعصبية التشريحية للالمسوخ الماوس، كما يتضح في الآونة الأخيرة لالفئران التي تفتقر إلى البروتين السقالات قبل المشبكي الباسون ^4. علاوة على ذلك، مجموعة واسعة من الأدوات التكميلية يتيح إضافية يضم من الشبكية العقدة الخلية (RGC) وأرقام محوار RGC وكذلك النشاط RGC، على سبيل المثال، من خلال تخطيط كهربية الشبكية والاختبارات السلوكية، وتحديد إعادة ترتيب القشرية عن طريق التصوير الضوئي الإشارات الجوهرية. أحدث التطورات التقنية في الفحص المجهري ليزر تمكين التصور الموضع من RGC التجديد في الأنسجة العميقة عن طريق التصوير مضان في عينات جبل بأكمله من العصب البصري (ON) والدماغ. في هذا histologنهج كال، رباعي هيدرو الفوران أساس المقاصة الأنسجة في تركيبة مع ضوء مضان المجهري ورقة يسمح القرار من الألياف واحد أن إعادة إدخال في ON deafferented والجهاز البصري ^5. بينما مثل هذه التقنيات قد تكون متفوقة في القرار وتحديد أنماط النمو، فإنها لا تمكن التحليلات المتكررة وطولية من الأحداث نمو الفرد، والتي يتم المطلوب وخاصة لتقييم عملية التجديد على المدى الطويل.

واستخدمت تعزيز التباين التصوير بالرنين المغناطيسي لتصور الغازية الحد الأدنى من إسقاط retino سقفي في الفئران والجرذان ^6،7. ويمكن تحقيق هذا عن طريق التسليم المباشر العين أيونات ممغطس (على سبيل المثال، المنغنيز ^{2 +)} إلى خلايا الشبكية. كما التناظرية الكالسيوم، وهو مدرج المنغنيز ^{2 +} في RGC somata عبر قنوات الكالسيوم الجهد بوابات ونقلها بنشاط على طول محور عصبي الهيكل الخلوي للON سليمة والجهاز البصري. في حين أنه يتراكم في الدماغ نوىمن الإسقاط المرئي، أي في النواة الركبية الجانبية (LGN) وأكيمة متفوقة (SC)، ونشر عبر التشابك في القشرة البصرية الأولية تظهر ضئيلة ^8،9، على الرغم من أنه قد تحدث ^10،11. تحت MR التسلسل، ممغطس المنغنيز ^{2 +} تقوي MR النقيض أساسا بتقصير _T-1 تدور شعرية وقت الاسترخاء ^12. مثل المنغنيز ^{2 +} تعزيز التصوير بالرنين المغناطيسي (ميمري) قد تم تطبيقها بنجاح في مختلف الدراسات العصبية التشريحية والوظيفية من الفئران، بما في ذلك تقييم تجدد المحاور والضمور بعد الإصابة ON ^13،14، ورسم الخرائط التشريحية الدقيقة لإسقاط ¹⁵ retino سقفي ، فضلا عن تحديد خصائص النقل محور عصبي بعد العلاج الدوائي ^16. قمنا بمد التحسينات الأخيرة في الجرعة والسمية، وحركية العصبية المنغنيز ^{2 +} امتصاص والنقل، فضلا عن تحسين بروتوكولات التصوير بالرنين المغناطيسي تطبيقه على الدراسات المتعلقة المعدلة وراثيا⁹ الفئران باستخدام الماسحات الضوئية 3 تسلا التي يشيع استخدامها في الممارسة السريرية ^17.

هنا، نقدم بروتوكول اورده مناسبة للطولية في الجسم الحي التصوير من إسقاط retino سقفي الماوس وتجسد تطبيقه من خلال تقييم المنغنيز ^{2 +} تعتمد تعزيز إشارة في ظل ظروف تنكس عصبي السذاجة ومختلف. يضع بروتوكول لدينا التركيز بوجه خاص على الحصول على البيانات MR في 3 T المجال المغناطيسي المعتدلة التي هي عموما أكثر سهولة من الماسحات الضوئية الحيوان مخصص. في الفئران السذاجة، نحن لتوضيح كيف يمكن أن يكون المسالك محددة كثافة إشارة كبيرة وبتكاثر تصبح زادت بعد intravitreal (ivit) المنغنيز ^{2 +} التطبيق. كميا، المنغنيز ^{2 +} الانتشار على طول الإسقاط المرئي يحدث بشكل مستقل عن عملية الشيخوخة الطبيعية (قياس بين الفئران 3 و 26 شهرا من العمر) وزيادة غير الحرارية إلى التحفيز البصري والتكيف مع الظلام. في المقابل، المنغنيز 2 + تخصيب في مراكز مهادي والدماغ المتوسط ​​التالية الحاد على سحق اصابة ¹⁸ وكذلك في nfkb1 الفئران خروج المغلوب (P50 ^KO) يعاني من عفوية الموت RGC أفكارك وON الضمور ^19. وهكذا، في التوسع إلى التحليل النسيجي التقليدية، وتحليل اورده طولية من الحيوانات الفردية تمكن من التنميط حركية فريدة من عمليات الاعصاب. وهذا ينبغي أن تكون مفيدة لدراسات عن العصبية وتجدد المحاور المرتبطة التدخلات الدوائية أو وراثية.

Protocol

يتم تنفيذ جميع التدخلات الحيوانية وفقا للاتفاقية الأوروبية لرعاية الحيوان واستخدام الحيوانات المختبرية وبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في العيون والبحوث الرؤية. تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل لجنة الأخلاق المحلية. يوصف الإجراء الإصابة على الفئران في مكان آخر ^9.

1. Intravitreal المنغنيز حقن

1. أداء ساعة المنغنيز ^{2 +} حقن 24 قبل MR مسح بمساعدة مساعد. تخدير الحيوانات عن طريق الحقن داخل الصفاق من 5٪ محلول الكلورال هيدرات (420-450 ملغ / كغ من وزن الجسم في برنامج تلفزيوني العقيمة). للتخدير الموضعي إضافية، وتطبيق قطرة واحدة من conjuncain السائل (0.4٪ oxybuprocaine هيدروكلوريد) إلى القرنية قبل ثقب العين. لحقن 15 نانومول المنغنيز ^{2 +} في العين يعد 7.5 ملي MnCl ₂ الحل، على سبيل المثال، عن طريق تمييع 1 لتر من 1 M MnCl حل ₂ الأسهم في 132 LH _{2 <}/ الفرعية> O. تحميل 5 ميكرولتر من الحل النهائي في حقنة 5 ميكرولتر هاميلتون متصلة G 34 مركزا الصغيرة القابلة للإزالة إبرة (إبرة RN).
2. عندما بدءا من العين اليمنى، ضع الماوس جانب اليسار تحت المجهر مجهر ومفتوحة بلطف وإصلاح العين اليمنى بين الإبهام والسبابة من يدك اليسرى. التقط حقنة بيدك اليمنى واتخاذ اجراء من الإبرة على مقربة من الحافة. للثقب ارضحي لمبة العين، إدراج بعناية الإبرة في الجسم الزجاجي في محيط-infero الزمنية البعيدة حوالي 1 ملم إلى حوف، وبالتالي تجنيب السفن الصلبة.
3. المقبل، مساعد ينطبق ببطء الحجم الكلي لل2 ميكرولتر في حين تسيطر على حجم حقنة هاميلتون. خلال هذا الإجراء، ومراقبة موضع إبرة تحت المجهر الأمثل وتجنب ثقب العدسة أو إراقة السائل. الحفاظ على إبرة تدخل بشكل ثابت لمدة 30 ثانية إضافية، ثم سحبها ببطء لتقليل السائلالتسرب من موقع الحقن.
4. في جميع أنحاء الداخلي، ينبغي إيلاء عناية خاصة لتجنب الضغط على العين. وبالمثل، وتجنب محاولات عديدة لقاسية أو ثقب لمبة العين. منذ المنغنيز ^{2 +} امتصاص في RGCs والنقل على طول ON مشبعة بالفعل في 15 نانومول MnCl _2، وهذا يقلل من الاختلافات إشارة من كميات الحقن غير دقيقة قليلا. لتعزيز إشارة الثنائية من الإسقاط المرئي، كرر إجراء الحقن للعين اليسرى.
5. تنطبق-أوفلوكساسين تحتوي على (3 ملغ / مل) قطرات العين والتي تحتوي على مرهم بانثينول مرة واحدة بعد العملية لمنع التهابات العين وجفاف العين. العودة الفئران لأقفاصها تحت ظروف السكن العادي حتى بداية الفحص MR.

2. إعداد الحيوان للتصوير بالرنين المغناطيسي

1. تخدير الماوس عن طريق الإدارة من خليط الغاز isoflurane و/ الأكسجين 2٪ / 98٪. جبل الماوس على حامل الماوس في موقف مبرومة أفقي تقريبا. الإضافيةERT عليه في لفائف MR، والتي يتم بعد ذلك تعديل داخل الماسح الضوئي MR. مراقبة التنفس ومعدل ضربات القلب من خلال النظم الملائمة. لمزيد من التفاصيل التقنية، انظر هيرمان وآخرون ^20.
2. خلال التصوير بالرنين المغناطيسي، التخدير إمدادات الطاقة عن طريق نفخ المستمر من البداية 1.5٪ / 98.5٪ خليط الغاز isoflurane و/ الأكسجين عن طريق جهاز تبخير متصلا صاحب الرأس الماوس عن طريق أنبوب المتكاملة. أثناء الفحص، وضبط عمق التخدير وفقا لمعلمات الحيوية المسجلة (أي تهدف لمعدل التنفس مستقرة من حوالي 40 نفسا في الدقيقة). باستخدام جهاز التدفئة حفاظ على درجة حرارة سطح الجسم مستقرة بين 35 و 37 درجة مئوية، كما تم قياسها عن طريق جهاز استشعار الحراري وضعه في موقع البطن من الفأرة. لمزيد من التفاصيل التقنية، انظر هيرمان وآخرون ^17.
3. بعد الفحص، وتحرير الماوس من حامل وتوريد مع الأكسجين النقي لتسريع الشفاء من التخدير. بالإضافة إلى ذلك، والحفاظ على درجة حرارة الجسم ثابتة باستخداممصدر التدفئة الضوء الأحمر.

3. بروتوكول التصوير بالرنين المغناطيسي

1. يتم التحقق من صحة بروتوكول ل3 تسلا الماسح الضوئي مجهزة، SNR كفاءة، لفائف حيوان صغير مخصص (الاستقطاب خطيا يتز لفائف) مع حقل فعالة نظر 35 مم × 38 مم. تعمل لفائف في وضع الإرسال والاستقبال.
2. مع الحيوان في موقفها النهائي، وضبط اللحن ومباراة لفائف مع المعونة من محلل تردد. ضبط يدويا الارسال إشارة الجهد والتيارات الرقائق لتحسين تجانس الصورة وجودتها.
3. اكتساب T ₁ المرجحة الصور 2D بورصة طوكيو مع قرار من 0.5 مم × 0.5 مم × 2 مم في ضوء السهمي ومستعرضة للتخطيط. باستخدام التخطيط بمسح MR، الحصول على الصور MEMR في اتجاه وقياس الاكليلية، استدارة لتكون موازية لرأس الحيوان مع ترميز المرحلة على طول اتجاه بين اليسار واليمين. لتقليل اكتساب الوقت، استخدم حقل مستطيل نظر تعديلها لأبعاد الرئيس الفعلي. توظيف مدلل تسلسل FLASH 3D (VIBE 3D) باستخدام المعلمات التالية: قاعدة المصفوفة 256، مجال الرؤية 54 مم × 50.65 مم × 14.08 مم، وذلك باستخدام الحقل مستطيلة 93.8٪ من رأي في المرحلة ترميز الاتجاه، و 128 شرائح من 0.11 ملم شريحة سمك لقرار تعيين شريحة إلى 61٪.
4. تفعيل الاستيفاء في الطائرة لخلق صور النهائي مع 512 × 480 × 128، وتوفير حل فعال من 0.21 ملم × 0.21 ملم × 0.18 ملم (0.1 ملم × 0.1 ملم × 0.09 ملم محرف)، والوقت صدى تي _E = 6.51 ميللي ثانية، الوقت التكرار T _R = 16 ميللي ثانية، عرض النطاق الترددي = 160 هرتز / بكسل، وزاوية الوجه = 22 درجة. تطبيق متوسطين وثلاثة التكرار لتحقيق ما مجموعه اكتساب الوقت (T _A) ما يقرب من 30 دقيقة.

4. تحليل البيانات التصوير بالرنين المغناطيسي

1. تحليل البيانات باستخدام برنامج برنامج برنامج syngo. لتعزيز إشارة الكمي، حدد مناطق محددة سالفائدة و 2D في مستو تسجيلات التصوير بالرنين المغناطيسي وتحديد شدة إشارة (SI) لهيكل محسن (SI _{ميمري)،} والخلفية الأنسجة (SI _backgr)، والانحراف المعياري للضوضاء (SD _N). حيثما كان ذلك ضروريا، واستخدام الماوس أطلس الدماغ لتسهيل التوجه العصبية التشريحية للLGN والهياكل SC. حساب نسبة التباين إلى الضوضاء (CNR) باستخدام الصيغة:
2. لجنة المصالحة الوطنية = (SI _اورده - SI _backgr) / SD _N
3. تحديد ثلاث صور متتالية لحساب متوسط ​​لجنة المصالحة الوطنية لكل عينة. في الحيوانات حقن ثنائيا، وتحليل كل نصف الكرة بشكل مستقل.
4. لتصوير الصور الأفقية، الاكليلية والسهمي، وحساب إعادة البناء من multiplanar الأصلي مجموعة البيانات 3D التصوير بالرنين المغناطيسي. لا ينصح هذه الصور المجهزة للتحليل الكمي. إعادة البناء لخلق 3D الرسوم المتحركة (إسقاطات كثافة الأقصى، خطط تنفيذ البعثات) من retino-سقفي الإسقاط، استخدم وظيفة تجهيز وحدة تصوير الأوعية البرمجيات.

5. المنغنيز ^{2 +} Autometallography (TIMM تلطيخ)

1. لTIMM تلطيخ من المنغنيز ² هياكل الدماغ ⁺ تتبع التالية ميمري، وضخ جرعة من 15-150 نانومول المنغنيز ^{2 +} ivit 24 ساعة قبل التصوير.
2. بعد تفحص MR، يروي الحيوانات مع 30 مل من الجليد الباردة 0.325٪ نا ₂ S في برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4). تشريح الشبكية وتجميد العينات المجمدة في القسم.
3. قطع، أقسام الاستوائية متتابعة من 15 ميكرون سمك على مبضع بردي.
4. أداء TIMM تلطيخ ²¹ في غياب تثبيتي، وفقا لcryoprotection Angenstein وآخرون ^22.

6. التحليل الإحصائي

أداء التحليلات الإحصائية باستخدام اختبار t للطالب للمقارنات واحدة، تليها آخر مخصص ANOVA. يتم عرض البيانات كما يعني ± الخطأ القياسي. أرقام N الفرديةنظرا منفصل لكل تجربة. وتعتبر النتائج التوصل P ≤ 0.05 ذات دلالة إحصائية (P ≤ 0.05، *؛ P ≤ 0.01، **؛ P ≤ 0.001، ***).

النتائج

قدرة هذه التقنية التصوير لتقييم دقيق حيوية وظيفة الإسقاط المرئي يعتمد على التطبيق الدقيق لغير سام المنغنيز ^{2 +} الجرعة إلى الجسم الزجاجي وامتصاص من قبل RGCs. يتم اختبار هذا الافتراض الرئيسي في الشكل 1، حيث أظهرت طبقة معينة المنغنيز ^{2 +} امتصاص autometallograp...

Discussion

اورده من النظام البصري يمتد تقنيات العصبية الحيوية التقليدية لتقييم الأداء الوظيفي في ظل ظروف السذاجة والمرضية. وبصرف النظر عن تقديم نظرة فريدة من نوعها في سلامة معزولة CNS الألياف المسالك، اورده يمكن استكمال بسهولة مع اختبارات سلوكية، على سبيل المثال، البصريا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI contrast reagent
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol	Jenapharm, Jena, Germany	PZN 3524531
Chloral hydrate	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	C8383	420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder			custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	6502	tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106346	for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
Gum arabic	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
Citric acid (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106448
Silver nitrate (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908