在视神经纤维通过诚信小鼠对比增强MRI 活体成像

摘要

该视频演示了一种方法，利用临床3个T的扫描仪，对天真的鼠标视觉投影对比增强磁共振成像和重复性和纵向体内视神经病变的研究，急性视神经挤压伤和慢性视神经变性相关敲除小鼠（P50 ^KO）。

摘要

啮齿动物视觉系统包含形成视神经进入丘脑和中脑中心和突触后投射到视觉皮层的视网膜神经节细胞和它们的轴突。基于其独特的解剖结构和便利的交通，它已成为青睐的结构对神经元的存活，轴突再生，突触可塑性研究。在MR成像的最新发展，使体内使用的可视化介导锰对比度增强（MEMRI）这款投影的眼膜，顶盖部分。在这里，我们提出了一个MEMRI协议说明视觉投影在小鼠中，其中（200微米^）3分辨率可以使用常见的3特斯拉的扫描仪来实现的。我们将演示如何玻璃体腔注射15纳摩尔的MnCl ₂单剂量导致24小时内完整投影的饱和增强。与异常的视网膜，改变信号强度都INDEPEN凹痕恰逢视觉刺激或生理老化。我们还应用此技术来监测纵向轴索变性响应急性视神经损伤，范式其中Mn ^{2 +}的运输完全逮捕的病变部位。相反，有源Mn ^{2 +}的传输是定量相称的生存能力，数量和轴突纤维的电活动。对于这样的分析，我们举例说明的Mn ^{2 +}转运动力学以及在转基因小鼠模型（NF-κBp50的^KO）显示的感官自发萎缩，包括视觉，突出视觉路径。在这些小鼠中，MEMRI表示减少，但不会延迟Mn ^{2 +}的传输相比，野生型小鼠，从而通过NF-κB突变揭示的结构和/或功能障碍的迹象。

综上所述，方便MEMRI桥梁体内试验和验尸组织学的characterizati对神经纤维的完整性和活性。它是在轴突变性和再生，突变小鼠真正的或可诱导的表型调查纵向研究是非常有用的。

引言

基于其良好的神经解剖结构的啮齿动物视觉系统提供了独特的机会，以评估药物的化合物和它们的能力，调解神经保护¹或促再生作用^2,3。此外，它允许对小鼠突变体的功能及神经解剖特点的研究，如最近列举的缺乏突触前支架蛋白巴松管^4只小鼠。此外，辅助工具的广谱提供了额外的视网膜神经节细胞（RGC）和RGC轴突数量，以及研究资助局的活动， 如为特色，通过电图和行为测试，和皮质重排由内在信号光学成像的决心。在激光显微镜的最新技术发展在视神经（ON）和脑整装标本深部组织荧光成像使在研资局再生原位可视化。在这种histologiCal的方法，基于四氢呋喃组织清算与光片荧光显微镜组合允许单纤维的分辨率，重新进入deafferented ON和视束^5。虽然这种技术可能是决心和意志的增长模式优越，他们不使个人成长活动，这是特别理想，以评估长期再生的过程中重复和纵向分析。

对比增强MRI已用于小鼠和大鼠^6,7的眼膜，顶盖投影的微创可视化。这可以通过直接的眼内递送顺磁离子（ 如 Mn ^{2 +}的）的视网膜细胞来实现。作为钙类似物，Mn ^{2 +}的结合到RGC胞体通过电压门控钙通道，并沿着完整ON和视束的轴突细胞骨架的主动转运。虽然它积聚在脑细胞视觉投影， 即在外侧膝状体（LGN）和上丘（SC），跨突触传播到初级视觉皮层出现^8,9可以忽略不计，虽然它可能会出现^10,11。在MR测序，顺Mn ^{2 +}的增强磁共振造影主要是通过缩短_Ŧ1自旋-晶格弛豫时间^12。该Mn ^{2 +}增强磁共振成像（MEMRI）已在大鼠的各种神经解剖和功能的研究，包括轴突再生和变性受伤^13,14后的评估中得到成功应用，将眼膜-顶盖突起¹⁵的精确解剖标测，以及轴突转运特性的药物治疗¹⁶后的决心。在剂量，毒性和神经元Mn ^{2 +}的吸收和运输，以及改进的MRI方案动力学近期的改进已经扩大其应用到转基因研究⁹小鼠用3特斯拉的扫描仪在临床实践¹⁷常用。

在这里，我们提出了适用于纵向一MEMRI协议在鼠标眼膜-顶盖投影的体内成像和评估天真和各种神经退行性变的条件下Mn ^{2 +}的依赖性信号增强体现了它的适用性。我们的协议的地方特别强调磁共振数据采集在一个温和的3个T磁场通常比动物专用扫描仪更加方便。在天真的小鼠中，我们说明了如何系特有的信号强度可以大大而重复地成为后玻璃体（ivit）Mn ^{2 +}的应用增加。定量，Mn ^{2 +}的传播沿着视觉投影独立地发生正常的老化过程（3和26个月大的小鼠之间测得）和增强是难治的视觉刺激和适应黑暗。与此相反，锰 2 +富集丘脑和中脑中心是减少急性上挤压伤¹⁸以及在NFKB1敲除小鼠（P50 ^KO）从自发凋亡RGC的死亡和ON变性¹⁹痛苦。因此，在扩大传统的组织学分析，动物个体的纵向MEMRI分析，可以为神经变性过程的独特的动力学分析。这应该证明与药物或基因干预相关的神经保护和轴突再生的研究很有用。

研究方案

所有动物的干预按照欧洲公约动物保护实验动物和使用以及ARVO声明在眼科和视觉研究用动物进行的。所有的实验都是由当地伦理委员会批准。对损伤的小鼠中的程序是在别处⁹所述。

1，玻璃体内注射锰

1. 执行中Mn ^{2 +}注射24小时的MR扫描与助手的帮助之前。腹腔注射5％水合氯醛溶液（420-450毫克/千克体重在无菌PBS中）麻醉动物。有关其他局部麻醉，应用一滴液体conjuncain（0.4％奥布卡因盐酸盐）来之前，眼睛穿刺角膜。注入15纳摩尔Mn ^{2 +}的每只眼睛准备一个7.5毫米的MnCl ₂溶液， 例如 ，通过稀释1升1米的MnCl ₂原液在132 LH _{2 <}/ SUB> O。负载5微升的最终解决方案到5微升汉密尔顿注射器连接到34 g小枢纽可拆卸针（RN针）的。
2. 当与右眼开始，请将鼠标左键双面双目显微镜下，轻轻打开并修复你的左手的拇指和食指之间的右眼。拿起注射器用你的右手，并采取针靠近尖端的保持。为眼部灯泡无创伤穿刺，小心将针刺入玻璃体在infero颞周长大约1mm远端的角膜缘，从而不遗余力巩膜血管。
3. 接着，助手慢慢适用的2微升的总体积，同时控制Hamilton注射器的刻度。在此过程中，监测在显微镜下最优的针的位置，并避免液体的透镜或溅出的穿刺。保持静态地插入另外的30秒的针，然后撤回它慢慢地减少液体从注射部位的泄漏。
4. 在整个过程中，特别应注意避免压到眼球。同样，避免恶劣或多次试图刺破眼球灯泡。因为Mn ^{2 +}摄取到视网膜神经节细胞，并沿对运输已经饱和在15纳摩尔的MnCl _2，这稍微不精确的进样量最小化的信号变化。对于视觉投影的双边信号增强，重复注射过程用于左眼。
5. 申请氧氟沙星的含（3毫克/毫升）滴眼液和含有泛醇-软膏后，一旦程序，以防止眼部感染和眼干燥。返回小鼠正常居住条件下它们的笼子，直到MR扫描的开始。

2，动物准备的MRI

1. 由2％/ 98％异氟烷/氧气气体混合物的施用麻醉小鼠。安装鼠标鼠标持有人在一个几乎水平，无捻位置。插件ERT成的MR线圈，然后将其在MR扫描仪内进行调整。监测呼吸和心脏率合适的系统。有关技术详情，请参阅赫尔曼等人 ^20。
2. 在MRI，供给麻醉经由由集成管连接到鼠标头部保持器的蒸发器的最初的1.5％/ 98.5％异氟烷/氧气气体混合物的连续吹入。在扫描过程中，根据记录的重要参数（ 即目标为约每分钟40次呼吸平稳呼吸速率）调整麻醉深度。使用加热装置保持在35和37℃下的体表温度稳定的，如通过定位于小鼠的腹腔内有热传感器测量。有关技术详情，请参阅Herrmann 等^[17]。
3. 扫描之后，从支架释放鼠标和纯氧供应，以加速从麻醉中恢复。另外，通过使用保持体温稳定红灯加热源。

3，MRI协议

1. 该协议被验证为3特斯拉扫描器配备专用的，信噪比高效，小动物线圈（线偏振绞线线圈）与视35毫米×38毫米直径的一个有效字段。操作在发射 - 接收模式线圈。
2. 在其最终位置的动物，调节线圈的同一个频率分析仪的辅助下调谐和匹配。手动调整发射机的基准电压和电流的垫片，以优化图像的均匀性和质量。
3. 收购_Ŧ1加权谢2D图像为0.5毫米，分辨率×0.5㎜×2毫米的规划矢状和横向视图。使用规划MR扫描，获取在冠状测量方向上的MEMR图像，旋转成平行于动物的头沿左右方向的相位编码。为了尽量减少采集时间，使用的视图的矩形区域调整到实际的头部尺寸。基础矩阵256，视场54㎜×50.65毫米×14.08毫米，利用相位编码方向的视图93.8％的矩形区域，和128片0.11毫米：使用以下参数采用一个被宠坏的3D FLASH序列（VIBE 3D）切片厚度与片的分辨率设置为61％。
4. 激活平面内插值到512×480×128创建最终图像，提供0.21㎜×0.21毫米* 0.18毫米的有效分辨率（0.1毫米×011㎜×0.09毫米插值），回波时间T _E = 6.51毫秒，重复时间T _R = 16毫秒，带宽= 160赫兹/像素，翻转角= 22°。应用两个平均值和三个重复，实现约30分钟，总采集时间_（T A）。

4，MRI数据分析

1. 使用该软件的syngo fastView分析数据。对于定量信号增强，选择定义的区域Ø在2D平面的MRI录音f兴趣，并决定加强结构（SI _MEMRI），组织背景（SI _backgr），噪音（SD _N）的标准偏差的信号强度（SI）。如有需要，使用鼠标脑图谱，以促进神经解剖定位为外膝体和SC的结构。计算出的对比度噪声比（CNR），使用下式：
2. CNR =（SI _MEMRI - SI _{backgr）/ SDÑ}
3. 量化连续三个图像的平均CNR计算每个样品。在双边注射的动物，独立分析每个半球。
4. 对于水平，冠状面和矢状面图像的描述，计算从原来的3D MRI数据集多平面重建。这些处理过的图像，不建议进行定量分析。要创建眼膜的动画三维重建（最大强度投影，得到的MIP）- 顶盖投影，使用血管造影后处理软件模块。

5，Mn ^{2 +}的自显影技术（TIMM染色）

1. 对于Mn ^{2 +}的跟踪大脑结构的下列MEMRI TIMM染色，注入的15-150纳摩尔Mn ^{2 +}的ivit 24小时前成像剂量。
2. 后的MR扫描，灌注动物用30ml冰冷的0.325％的Na ₂ S的PBS（pH 7.4）中。视网膜解剖，冷冻样品中冰冻切片。
3. 剪下的cryotome 15微米厚的顺序，赤道部分。
4. 根据Angenstein 等^[22]在没有固定剂和冷冻保护的执行TIMM染色^21。

6，统计分析

使用Student-t检验进行单比较，接着事后方差分析进行统计分析。数据以平均值±标准误差。各个N个数字分别为每个实验给出。结果到达压力 ≤0.05顷认为有统计学显著性（P≤0.05，*，P≤0.01，**，P≤0.001，***）。

结果

这种成像技术的准确评估视觉投影的活力和功能的能力依赖于一个无毒的Mn ^{2 +}的用量精准应用的玻璃体，其吸收的视网膜神经节细胞。这主要假设在图1中，其中层具体Mn ^{2 +}的摄取证明了自显影技术（TIMM染色^）21进行测试。视网膜节，在24小时后，无论是15纳摩尔或150纳摩尔的Mn ^{2 +，}或PBS作为对照的ivit的应用进行了分析。在该时间点时，Mn ^{2 +<...}

讨论

视觉系统的MEMRI延伸常规神经生物学技术的幼稚和病理条件下评估功能。除了 ​​提供独特的洞察到一个孤立的中枢神经纤维束的完整性，这种成像方法可以很容易地辅以行为测试， 例如 ，验光和视觉水性任务，调查一个给定的范例视觉感知的直接后果。它还连接电生理和病理调查与体内功能的视觉表征。该技术是高度可靠和可重复使用相同的内群体未成年人的个体差异（参见

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI contrast reagent
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol	Jenapharm, Jena, Germany	PZN 3524531
Chloral hydrate	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	C8383	420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder			custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	6502	tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106346	for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
Gum arabic	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
Citric acid (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106448
Silver nitrate (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908