Imágenes in vivo de Óptica de Fibras Nerviosas Integridad de la RM con contraste en ratones

Resumen

Este video muestra un método, utilizando una clínica 3 T escáner, por contraste mejorado la RM del ratón proyección visual ingenuo y para estudios repetitivos y longitudinales en vivo de la degeneración del nervio óptico asociadas con lesión por aplastamiento del nervio óptico aguda y degeneración del nervio óptico crónica en ratones knock-out ^(KO p50).

Resumen

El sistema visual roedor abarca las células ganglionares de la retina y sus axones que forman el nervio óptico para entrar en los centros talámicos y del cerebro medio, y proyecciones postsinápticos a la corteza visual. Sobre la base de su estructura anatómica distinta y la accesibilidad conveniente, se ha convertido en la estructura favorecida para los estudios sobre la supervivencia neuronal, la regeneración axonal, y la plasticidad sináptica. Los recientes avances en la RM han permitido la visualización in vivo de la parte retino tectal de esta proyección utilizando manganeso mediada aumento del contraste (MEMRI). A continuación, presentamos un protocolo MEMRI para ilustración de la proyección visual en ratones, mediante el cual las resoluciones de (200 m) ³ se puede lograr utilizando escáneres comunes 3 Tesla. Demostramos cómo la inyección intravítrea de una sola dosis de 15 nmol _MnCl2 conduce a una mejora de la proyección saturada intacta dentro de 24 horas. Con excepción de la retina, se indepen cambios en la intensidad de la señaldente de la estimulación visual coincidió o envejecimiento fisiológico. Aplicamos aún más esta técnica para supervisar longitudinalmente degeneración axonal en respuesta a la lesión aguda del nervio óptico, un paradigma por el que Mn ^{2 +} transporte completamente detenciones en el sitio de la lesión. Por el contrario, el transporte activo de Mn ^{+ 2} es cuantitativamente proporcional a la viabilidad, el número y la actividad eléctrica de las fibras de axones. Para un análisis de este tipo, ejemplificamos Mn ^{2 +} cinética de transporte a lo largo del camino visual en un modelo de ratón transgénico (p50 NF-kB ^KO) mostrando atrofia espontánea de los sentidos, incluyendo visuales, proyecciones. En estos ratones, MEMRI indica reducida pero no retardada Mn ^{2 +} de transporte en comparación con ratones de tipo salvaje, lo que revela signos de alteraciones estructurales y / o funcionales por mutaciones NF-kB.

En resumen, MEMRI puentes convenientemente en ensayos in vivo y post mortem para la histología characterizatisobre la integridad y la actividad de las fibras nerviosas. Es muy útil para los estudios longitudinales sobre la degeneración axonal y la regeneración, y las investigaciones de los ratones mutantes para fenotipos genuinos o inducibles.

Introducción

Sobre la base de su estructura neuro-anatómico favorable el sistema visual del roedor ofrece posibilidades únicas para evaluar compuestos farmacológicos y su capacidad para mediar en la neuroprotección ¹ o efectos pro-regenerativas ^2,3. Por otra parte, permite que los estudios sobre las características funcionales y neuro-anatómico de ratones mutantes, en fecha tan reciente ejemplifica para los ratones que carecen de la proteína de andamiaje presináptico Fagot ^4. Además, un amplio espectro de herramientas complementarias ofrece que ofrece adicional de células de la retina ganglio (RGC) y los números de los axones de CGR así como la actividad de RGC, por ejemplo, por el electrorretinograma y pruebas de comportamiento, y la determinación de los reordenamientos corticales por imagen óptica de señales intrínsecas. Las últimas novedades técnicas en microscopía láser permiten una visualización in situ de regeneración RGC por imágenes de fluorescencia de tejido profundo en el conjunto de montaje de especímenes del nervio óptico (NO) y el cerebro. En este histopatología,enfoque ical, tetrahidrofurano basado claro tejido en combinación con hoja de luz de microscopía de fluorescencia permite la resolución de las fibras individuales que se vuelva a introducir en el SOBRE deafferented y el tracto ⁵ óptica. Si bien tales técnicas pueden ser superiores en la resolución y la determinación de los patrones de crecimiento, que no permiten análisis repetitivos y longitudinales de los eventos individuales de crecimiento, que son particularmente deseables para evaluar el proceso de regeneración a largo plazo.

Mejorada de contraste de RM ha sido empleado para la visualización mínima invasiva de la proyección retino-tectal en ratones y ratas ^6,7. Esto puede lograrse mediante la entrega intraocular directa de iones paramagnéticos (por ejemplo, Mn ^{2 +)} a células de la retina. Como un análogo de calcio, Mn ^{2 +} se incorpora en RGC somata a través de canales de calcio dependientes de voltaje y transportados activamente a lo largo del citoesqueleto axonal del EN intacto y tracto óptico. Mientras se acumula en núcleos cerebralesde la proyección visual, es decir, el núcleo geniculado lateral (LGN) y colículo superior (SC), la propagación transsynaptic en la corteza visual primaria parece insignificante ^8,9, aunque puede ocurrir ^10,11. Bajo secuenciación MR, paramagnético Mn ^{2 +} aumenta el contraste MR principalmente por el acortamiento _T1 spin-red tiempo de relajación ^12. Tal Mn ^{2 +} mejorado MRI (MEMRI) ha sido aplicado con éxito en varios estudios de neuro-anatómicas y funcionales de las ratas, incluida la evaluación de la regeneración axonal y degeneración después de la lesión SOBRE ^13,14, el mapeo anatómico preciso de la proyección ^{de 15} retino tectal , así como la determinación de las características de transporte axonal después del tratamiento farmacológico ^16. Mejoras recientes en la dosis, la toxicidad, y la cinética de los protocolos de RM neuronales Mn ^{2 +} captación y el transporte, así como la mejora han extendido su aplicación a los estudios sobre transgénicos⁹ ratones utilizando escáneres de 3 Tesla de uso común en la práctica clínica ^17.

Aquí, se presenta un protocolo adecuado para MEMRI longitudinal de imágenes in vivo del ratón proyección retino tectal y ejemplificar su aplicación mediante la evaluación de mejora de la señal de Mn ^{2 +} dependientes en condiciones de neurodegeneración ingenuos y varios. Nuestro protocolo pone especial énfasis en la adquisición de datos de RM en un campo magnético moderado 3 T, que generalmente es más accesible que los escáneres de los animales dedicados. En los ratones no tratados previamente, se expone cómo la intensidad de señal del tracto específico puede ser sustancialmente y reproducible convertirse aumentado después intravítrea (ivit) Mn ^{2 +} aplicación. Cuantitativamente, Mn ^{2 +} de propagación a lo largo de la proyección visual se produce independientemente del proceso de envejecimiento normal (medida entre los ratones 3 y 26 meses de edad) y el aumento es refractario a la estimulación visual y la adaptación a la oscuridad. En contraste, Mn 2 + enriquecimiento en los centros talámicos y cerebro medio se reduce siguientes efectos agudos EN lesión por aplastamiento ^18, así como en NFKB1 ratones knock-out ^(KO p50) que sufren de la muerte de las CGR apoptosis espontánea y la degeneración de ^19. Por lo tanto, en la expansión a análisis histológico convencional, el análisis de MEMRI longitudinal de animales individuales permite perfiles de la cinética únicas de procesos neurodegenerativos. Esto puede ser muy útil para los estudios sobre la neuroprotección y la regeneración axonal asociada con las intervenciones farmacológicas o genéticas.

Protocolo

Todas las intervenciones de los animales se realizaron de acuerdo con el Convenio Europeo para la Atención Animal y Uso de Animales de Laboratorio y la Declaración de ARVO para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research. Todos los experimentos son aprobados por el comité de ética local. El procedimiento de la lesión en ON en los ratones se describe en otro ^9.

1. Intravítreas de manganeso Inyección

1. Realice el Mn ^{2 +} de la inyección de 24 horas antes de la MR scan con la ayuda de un asistente. Se anestesia a los animales mediante inyección intraperitoneal de una solución de hidrato de cloral 5% (420-450 mg / kg de peso corporal en PBS estéril). Para la anestesia tópica adicional, aplique una gota de conjuncain líquido (0,4% de clorhidrato de oxibuprocaína) a la córnea antes de la punción de los ojos. Para inyectar 15 nmol Mn ^{2 +} por ojo preparar una mM de MnCl solución de 7,5 _2, por ejemplo, mediante la dilución de 1 L de solución ₂ M de MnCl de stock 1 en 132 LH _{2 <}/ Sub> O. Carga 5 l de la solución final en una jeringa de 5 l Hamilton conectado a una aguja extraíble pequeño cubo 34 G (la aguja RN).
2. Al comenzar con el ojo derecho, coloque el ratón del lado izquierdo con un microscopio binocular y suavemente abierta y fijar el ojo derecho entre el pulgar y el dedo índice de su mano izquierda. Tome la jeringa con la mano derecha y sujete la aguja cerca de la punta. Para la punción atraumática del bulbo ocular, insertar cuidadosamente la aguja en el cuerpo vítreo en la circunferencia inferotemporal aproximadamente 1 mm distal al limbo, evitando de ese modo los vasos esclerales.
3. A continuación, el asistente se aplica lentamente el volumen total de 2 l, mientras que el control de la escala de la jeringa Hamilton. Durante este procedimiento, el seguimiento óptimo de colocación de la aguja en el microscopio y evitar la punción de la lente o el derrame del líquido. Mantenga la aguja insertada de forma estática para un 30 sec adicional, a continuación, retirar lentamente para minimizar el líquidopérdidas en el lugar de la inyección.
4. Durante todo el procedimiento, la atención especial se debe tomar para evitar la presión en el ojo. Del mismo modo, evitar tentativas fuertes o numerosas para perforar la bombilla de ojo. Desde Mn ^{2 +} absorción en la CGR y el transporte a lo largo del EN ya está saturado a 15 nmol _MnCl2, esto minimiza las variaciones de la señal por los volúmenes de inyección ligeramente imprecisos. Para mejorar la señal bilateral de la proyección visual, repita el procedimiento de inyección para el ojo izquierdo.
5. Aplicar ofloxacina que contienen (3 mg / ml) colirios y ungüentos que contengan pantenol-una vez después del procedimiento para prevenir las infecciones oculares y secado del ojo. Volver a los ratones a sus jaulas en condiciones normales de alojamiento hasta el inicio de la exploración de RM.

2. Preparación de los animales para la RM

1. Se anestesia el ratón por administración de una mezcla de gas isoflurano / oxígeno 2% / 98%. Monte el ratón sobre un soporte de ratón en una posición casi horizontal, sin torsión. InsERT en la bobina de RM, que se ajusta entonces en el interior del escáner de RM. Monitorear la respiración y la frecuencia cardíaca mediante sistemas adecuados. Para más detalles técnicos, véase Herrmann et al ^20.
2. Durante la RM, la anestesia de suministro por insuflación continua de un inicialmente 1.5% / 98.5% mezcla de gas isoflurano / oxígeno a través de un evaporador conectado a la titular de la cabeza del ratón por un tubo integrado. Durante la exploración, ajustar la profundidad de la anestesia según los parámetros vitales registrados (es decir, aspirar a una tasa de respiración estable de alrededor de 40 respiraciones por minuto). El uso de un dispositivo de calentamiento a mantener la temperatura de la superficie corporal estable entre 35 y 37 ° C, medida por un sensor térmico colocado en el sitio abdominal del ratón. Para más detalles técnicos, véase Herrmann et al ^17.
3. Después de la exploración, liberar el ratón del soporte y suministrándole oxígeno puro para acelerar la recuperación de la anestesia. Además, mantener la temperatura corporal estable mediante el uso deuna fuente de calor la luz roja.

3. Protocolo de resonancia magnética

1. El protocolo es validado por un Tesla escáner 3 equipado con una, bobina dedicada SNR-eficiente de pequeños animales (polarizada linealmente bobina Litz) con un campo de visión efectivo de 35 mm × 38 mm de diámetro. Haga funcionar la bobina en modo de transmisión-recepción.
2. Con el animal en su posición definitiva, ajuste la melodía y el partido de la bobina con la ayuda de un analizador de frecuencias. Ajuste manualmente el voltaje de referencia del transmisor y las corrientes de la calza para optimizar la homogeneidad y calidad de imagen.
3. Adquirir en _T1 imágenes de EET en 2D con una resolución de 0,5 mm × 0,5 mm × 2 mm en vista sagital y transversal para la planificación. El uso de la planificación de resonancia magnética, adquirir las imágenes MEMR en la dirección de medición coronal, girado para ser paralelo a la cabeza del animal con la codificación de fase a lo largo de la dirección izquierda-derecha. Para reducir al mínimo el tiempo de adquisición, utilizar un campo rectangular de vista ajustada a laDimensiones del cabezal de reales. Emplear una secuencia FLASH 3D mimada (VIBE 3D) con los siguientes parámetros: la matriz de base 256, el campo de visión de 54 mm × 50,65 mm x 14,08 mm, con un 93,8% campo rectangular de vista en la dirección de codificación de fase, y 128 láminas de 0,11 mm grosor de corte con la resolución rebanada establece en un 61%.
4. Activar la interpolación en el plano para crear imágenes finales con 512 × 480 × 128, proporcionando una resolución efectiva de 0,21 mm x 0,21 mm x 0,18 mm (0,1 mm × 0,1 mm × 0,09 mm interpolan), tiempo de eco T _E = 6,51 mseg, tiempo de repetición _TR = 16 ms, ancho de banda = 160 Hz / px, flip = ángulo 22 °. Aplicar dos medias y tres repeticiones para lograr un tiempo de adquisición total de _{(T a)} de aproximadamente 30 min.

4. Análisis de los datos de resonancia magnética

1. Analizar los datos utilizando el fastView syngo software. Para mejorar la señal cuantitativa, seleccione las regiones definidas of interés en grabaciones de resonancia magnética planares 2D y determinar las intensidades de señal (SI) de la estructura reforzada (SI _MEMRI), fondo del tejido (SI _backgr), y la desviación estándar del ruido (DS _N). Cuando sea necesario, utilice un atlas del cerebro del ratón para facilitar la orientación neuro-anatómico para LGN y estructuras SC. Calcular la relación de contraste a ruido (CNR) usando la fórmula:
2. CNR = (SI _MEMRI - SI _backgr) / SD _N
3. Cuantificar tres imágenes consecutivas para cálculo de la media CNR para cada muestra. En los animales inyectados bilateralmente, analizar cada hemisferio de forma independiente.
4. Para la representación de imágenes horizontales, coronal y sagital, reconstrucciones multiplanares cálculo del conjunto de datos 3D MRI inicial. Estas imágenes procesadas no son recomendables para el análisis cuantitativo. Para crear reconstrucciones 3D animados (proyecciones de máxima intensidad, MIP) de la retinopatía-Tectal proyección, utilice un módulo de software de post-procesamiento de la angiografía.

5. Mn ^{2 +} autometalografía (TIMM tinción)

1. Para la tinción de TIMM de Mn ^{2 +} estructuras cerebrales trazadas siguiendo MEMRI, inyecte una dosis de 15 a 150 nmol Mn ^{2 +} ivit 24 horas antes de la proyección de imagen.
2. Después de escanear el MR, perfundir los animales con 30 ml enfriado con hielo 0,325% de Na ₂ S en PBS (pH 7,4). Diseccionar retinas y congelar las muestras en la sección congelada.
3. Cortar secciones secuenciales, ecuatoriales de 15 micras de espesor sobre una cryotome.
4. Realizar tinción TIMM ²¹ en ausencia de fijador y crioprotección de acuerdo con Angenstein et al ^22.

6. Análisis estadístico

Realizar análisis estadísticos utilizando la prueba t de Student para las comparaciones individuales, seguido de correo ANOVA hoc. Los datos se presentan como media ± error estándar. Números individuales de N sondado por separado para cada experimento. Resultados alcanzando P ≤ 0,05 se consideraron estadísticamente significativas (P ≤ 0,05, *, P ≤ 0,01, **, P ≤ 0,001, ***).

Resultados

La capacidad de esta técnica de imagen para evaluar con precisión la vitalidad y funcionalidad de la proyección visual se basa en la aplicación precisa de un no tóxico Mn ^{2 +} dosificación al cuerpo vítreo y su absorción por las CGR. Esta suposición principal se prueba en la Figura 1, donde la capa específica de Mn ^{2 +} captación se demuestra por autometalografía (tinción TIMM) ^21. Retina secciones se analizaron a las 24 horas después de la aplicación de cua...

Discusión

MEMRI del sistema visual se extiende técnicas neurobiológicos convencionales para evaluar la funcionalidad en condiciones no tratados previamente y patológicos. Además de proporcionar una visión única de la integridad de un hecho aislado CNS tracto de fibras, MEMRI puede ser fácilmente complementado con pruebas de comportamiento, por ejemplo, optometría y tareas a base de agua visualmente, para investigar las consecuencias inmediatas de un determinado paradigma de la percepción visual. También vincula...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI contrast reagent
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol	Jenapharm, Jena, Germany	PZN 3524531
Chloral hydrate	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	C8383	420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder			custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	6502	tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106346	for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
Gum arabic	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
Citric acid (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106448
Silver nitrate (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908