마우스의 조영 증강 MRI에 의한 시신경 섬유 무결성의 생체 내 이미징

요약

이 동영상은 순진 마우스 시각 투사의 조영 증강 자기 공명 영상과 급성 시신경 압박 손상 및 만성 시신경 변성과 관련된 시신경 변성의 반복 및 종 생체 내 연구에, 임상 3 T 스캐너를 사용하는 방법을 보여줍니다 녹아웃 마우스 (P50 ^KO).

초록

설치류의 시각 시스템은 시각 피질에 시상과 중뇌 센터, 시냅스 돌기를 입력 시신경을 형성하는 망막 신경절 세포와 축색 돌기를 포함한다. 그것의 독특한 해부학 적 구조와 편리한 접근성을 바탕으로, 그것은 생존의 연결, 축삭 재생 및 시냅스 가소성에 대한 연구에 대한 선호 구조로되어있다. MR 영상에서의 최근 발전은 망간 매개 대비 향상 (MEMRI)를 사용하여이 돌기의 레티노-tectal 부분의 생체 내 시각화를 사용할 수있다. 여기, 우리는 (200 ㎛)의 ³ 해상도는 일반적인 3 테슬라 스캐너를 사용하여 달성 할 수있는 생쥐의 시각 투영의 그림 MEMRI 프로토콜을 제시한다. 우리는 15 nmol의 MnCl _2의 단일 투여 량의 유리체 강내 주입은 24 시간 안에 그대로 투영 포화 향상에 이르게하는 방법을 보여줍니다. 망막의 제외, 신호 강도의 변화는 각각 C1됩니다일치 시각적 인 자극 또는 생리적 노화의 함몰. 우리는 더 심각한 시신경 손상에 대한 응답으로 축삭 변성을 모니터링 종에이 기술을 적용, 패러다임 병변 사이트에있는 망간 ^{2 +} 교통 완전히 체포하여. 반대로, 활성 망간 ^{2 + 수송} 가능성, 수, 축삭 섬유의 전기적 활동을 정량적으로 비례한다. 이러한 분석을 위해, 우리는 시각, 전망 등의 감각의 자연 위축을 표시하는 형질 전환 마우스 모델 (NF-κB의 P50 ^KO)의 시각 경로를 따라 미네소타 ^{2 +} 전송 반응 속도를 예시. 이 마우스에서 MEMRI이 감소하지만, 따라서 NF-κB의 돌연변이에 의해 구조 및 / 또는 기능 장애의 징후를 드러내는, 야생형 마우스에 비해 망간 ^{2 +} 전송을 지연 나타냅니다.

요약하면, MEMRI 편리 생체 분석에 다리와 characterizati 대한 해부 조직학을 게시신경 섬유의 무결성과 활동에. 그것은 축삭 변성과 재생, 및 정품 또는 유도 표현형에 대한 돌연변이 생쥐의 조사에 종 연구에 매우 유용합니다.

서문

유리한 신경 해부학 적 구조를 기반으로 설치류의 시각 시스템은 신경 보호 ¹ 프로 재생 효과 ^2,3를 중재하는 약물 화합물 및 이들의 능력을 평가하는 독특한 가능성을 제공합니다. 또한, 최근에 연접 비계 단백질 바순 ⁴ 부족한 생쥐에 예시 된 바와 같이, 마우스 돌연변이의 기능과 신경 해부학 적 특성에 대한 연구를 할 수 있습니다. 또한, 보조 도구의 광범위한 스펙트럼은 전위도 및 행동 테스트 및 고유 신호의 광학 영상에 의한 대뇌 피질의 재 배열의 결정에 의해, 예를 들어 망막 신경절 세포 (RGC) 및 RGC 축삭 번호뿐만 아니라 RGC 활동의 특색 추가로 제공한다. 레이저 현미경의 최신 기술 개발은 시신경 (ON)과 뇌의 전체 마운트 표본 깊은 조직의 형광 이미징에 의해 RGC 재생의 현장 시각화를 가능하게한다. 이 histolog에서iCal의 접근 방식, 빛 시트 형광 현미경과 함께 테트라 히드로 푸란을 기반으로 조직의 청산은 deafferented ON 및 광학 기관 ^(5)에 다시 입력 한 섬유의 해상도를 허용합니다. 이러한 기술은 해상도와 성장 패턴의 결정이 뛰어나 수도 있지만, 그들은 특히 장기 재생의 과정을 평가하기 위해 원하는 개별 성장 이벤트의 반복 및 종 분석을 사용하지 마십시오.

조영 증강 MRI는 생쥐와 쥐 ^6,7의 레티노-tectal 투사의 최소 침습 시각화를 위해 사용되어왔다. 이는 망막 세포에 상자성 이온 (예를 들어, Mn이 ^{2 +)의} 직접 안내 전달함으로써 달성 될 수있다. 칼슘 아날로그로, 미네소타 ^{2 +는} 전압 게이트 칼슘 채널을 통해 RGC의 인 somata에 통합하고 적극적으로 그대로 ON 및 광학 기관의 축삭 세포 골격을 따라 운반. 이는 뇌의 핵에 축적하면서그것은 ^{10, 11을} 발생할 수 있지만 시각적 투영, 옆 무릎 모양 관절이 핵 (LGN)와 우수한 둔덕 (SC)를 즉, 일차 시각 피질에 transsynaptic 전파, ^8,9 무시할 나타납니다. MR의 순서에 따라, 성체 미네소타 ^{2 +는} 주로 T ₁ 스핀 - 격자 완화 시간 ^(12)을 단축하여 MR의 명암을 보완. 이러한 망간 ^{2 +} MRI (MEMRI)가 성공적으로 부상 ^{13, 14} 후 축삭 재생과 퇴보의 평가를 포함하여 쥐의 다양한 신경 해부학 적 및 기능적 연구에 적용된 강화, 레티노-tectal 돌기 ^(15)의 정확한 해부학 적 매핑 뿐만 아니라, 약물 치료 ^{16 일} 후 축삭 전송 특성의 결정 등. 미네소타 ^{2 +} 통풍 관 및 교통의 연결뿐만 아니라, 향상된 MRI 프로토콜의 투여 량, 독성 및 역학의 최근 분류는 유전자 변형에 대한 연구에의 응용 프로그램을 확장 한일반적으로 임상 실습 ^17에 사용 된 3 테슬라 스캐너를 사용하여 마우스 ^9.

여기, 우리는 마우스 레티노-tectal 투사의 생체 내 이미징에 세로에 적합한 MEMRI 프로토콜을 제시하고 순진 다양한 신경 변성 조건에서 망간 ^{2 +} 종속 신호 향상을 평가하여 그 적용 가능성을 예시. 우리의 프로토콜은 일반적으로 전용 동물 스캐너보다 더 액세스 할 수있는 적당한 3 T 자기장에서 MR 데이터 수집에 특정 중점을두고 있습니다. 순진 마우스, 우리는 기관 고유의 신호 강도가 실질적으로 재현성 강내 (ivit) 미네소타 ^{2 +} 신청 후 증가 될 수있는 방법을 보여줍니다. 정량적으로, 시각적 투사 따라 미네소타 ^{2 +} 전파 (3, 26 개월 된 생쥐 사이에서 측정) 정상적인 노화 과정과 독립적으로 발생 증가는 어둠에 시각적 인 자극과 적응에 내화물입니다. 반대로, Mn이 2 + 농축은 호감 부상 ¹⁸ 급성뿐만 아니라 nfkb1 녹아웃 마우스에서 자연 사멸 RGC의 죽음과 변성 ¹⁹ 고통 (P50 ^KO) 다음 감소한다. 따라서, 기존의 조직 학적 분석에 확장에, 각각의 동물의 종 MEMRI 분석은 신경 퇴행성 과정의 독특한 역학의 프로파일 링을 사용합니다. 이 약물 또는 유전자 개입과 관련된 신경 보호 및 축삭 재생에 대한 연구에 유용합니다.

프로토콜

모든 동물의 개입은 실험 동물의 동물 관리 및 사용에 대한 유럽 협약 및 안과 및 비전 연구에서 동물의 사용에 대한 ARVO 정책에 따라 수행된다. 모든 실험은 지역 윤리위원회에 의해 승인됩니다. 마우스에서 ON 부상의 절차는 다른 곳에서 ^구 설명한다.

1. 유리체 강내 주입 망간

1. 이전의 MR은 조수의 도움으로 스캔에 미네소타 ^{2 +} 주입 24 시간을 수행합니다. (멸균 PBS에서 420-450 ㎎ / kg 체중) 5 % 클로 랄 하이드레이트 용액을 복강 내 주사하여 동물을 마취. 추가로 국소 마취를 위하여 눈 구멍에 각막에 액체 conjuncain 한 방울 (0.4 % oxybuprocaine 염산염)를 적용한다. 15 nmol의 망간을 주입하는 ^{2 +} 아이 당 예를 들면, 132 LH _{2 <1} M MnCl ₂ 원액 1 ℓ를 희석하여, 7.5 mM의 MnCl ₂ 용액을 제조/ 서브> O. 34 G 작은 허브 이동식 바늘 (RN 바늘)에 연결된 5 μL 해밀턴 주사기에 최종 솔루션의로드 5 μL.
2. 오른쪽 눈으로 시작할 때, 쌍안 현미경으로 부드럽게 열려 양면 마우스를 놓고 왼쪽 손의 엄지 손가락과 집게 손가락 사이에 오른쪽 눈을 고정합니다. 오른손으로 주사기를 들고 끝 가까이에 바늘을 잡아. 눈 전구의 atraumatic 천자를 들어,주의하여 공막 혈관을 살려주는 각막 윤부에 약 1mm 원심 infero - 시간 주위에서 유리체에 바늘을 삽입합니다.
3. 해밀턴 주사기의 규모를 제어하면서 다음, 보조 천천히 2 μL의 총 부피를 적용합니다. 이 절차를 수행하는 동안, 현미경 최적의 바늘 위치를 모니터링하고 액체의 렌즈 또는 유출의 구멍을 피하십시오. 정적으로 추가로 30 초 동안 삽입 된 바늘을 유지하고 액체를 최소화하기 위해 천천히 철회주사 부위에서 누출.
4. 절차를 통해, 특별한주의가 눈에 압력을 피하기 위해주의해야한다. 마찬가지로, 눈 전구를 천공 거칠거나 많은 시도를하지 마십시오. 미네소타가 ^{2 +} 망막 신경절 및 ON 따라 전송에 통풍 관이 이미 15 nmol의 MnCl ₂ 포화되어 있기 때문에,이 약간 부정확 사출 볼륨에 의해 신호의 변화를 최소화 할 수 있습니다. 카메라 돌기의 양측 신호 향상을 위해, 왼쪽 눈을위한 주입 절차를 반복한다.
5. 적용 플록 사신 함유 (3 ㎎ / ㎖) 안약과 절차는 안구 감염과 눈의 건조를 방지하기 위해 한 후 판테놀 함유 연고. MR 스캔의 시작 때까지 일반 주택 조건에서 자신의 새장에 마우스를 반환합니다.

MRI 2. 동물 준비

1. 2 % / 98 % 이소 플루 란 / 산소 가스 혼합물을 투여하여 마우스를 마취. 거의 수평, 꼬임 위치에 마우스 홀더에 마우스를 장착합니다. 기능다음 MR 스캐너 내부 조정 MR 코일에 ERT 그것. 해당 시스템에 의해 호흡과 심장 박동을 모니터링합니다. 기술적 인 세부 사항, 헤르만 외 ^(20)를 참조하십시오.
2. 동안 MRI, 통합 관에 의해 마우스 헤드 홀더에 연결된 증발기를 통해 초기에 1.5 % / 98.5 % 이소 플루 란 / 산소 혼합 가스의 취입에 의한 연속적인 공급 마취. 스캔하는 동안 기록 된 중요한 매개 변수 (예 : 분당 40 호흡의 안정된 호흡의 비율을 목표)에 따라 마취의 깊이를 조정합니다. 가열 장치를 사용하여 마우스의 복강 사이트에 위치하는 온도 센서에 의해 측정 한, 35 및 37 ° C 사이의 안정적인 신체 표면 온도를 유지한다. 기술적 인 세부 사항, 헤르만 외 ^17을 참조하십시오.
3. 스캔 후, 홀더에서 마우스를 해방하고 마취에서 회복을 가속화하기 위해 순수한 산소를 공급한다. 또한 사용하여 안정된 체온을 유지붉은 빛이 가열 원.

3. MRI 프로토콜

1. 프로토콜은 35mm × 38 mm 직경의 뷰의 효과적인 필드 전용, SNR 효율, 작은 동물 코일 (선형 편광 리츠 코일)를 장착 한 3 테슬라 스캐너에 대해 유효성이 검사됩니다. 송수신 모드에서 코일을 사용하십시오.
2. 최종 위치에있는 동물로, 주파수 분석기의 도움으로 코일의 튜닝 및 매치를 조정한다. 수동 이미지 균질성과 품질을 최적화하는 송신기 기준 전압과 전류를 조정 심.
3. T에게 계획에 대한 시상 및 횡단 뷰에서 0.5 mm × 2mm × 0.5 mm의 해상도를 가진 ₁ 차원 가중 TSE 이미지를 획득. 계획 MR 스캔을 사용하여 코로나 둘레 방향 MEMR 화상을 취득, 좌우 방향의 위상 인코딩을 가진 동물의 머리 평행하게 회전된다. 획득 시간을 최소화하기 위해 조정 보이는 직사각형 필드를 사용실제 머리 크기. 위상 인코딩 방향으로 뷰의 93.8 % 직사각형 필드를 사용하여, 기본 매트릭스 256, 시야 14.08 mm × 50.65 mm × 54mm, 0.11-mm의 128 조각 : 다음 매개 변수를 사용하여 버릇 3D 플래시 시퀀스 (VIBE 3D)를 사용 슬라이스 해상도 슬라이스 두께는 61 %로 설정합니다.
4. 0.18 mm × 0.21 mm × 0.21 mm의 유효 해상도 (0.1 mm × 0.1 mm × 0.09 mm 보간), 에코 시간 (T) _E = 6.51 밀리를 제공하고, 512 × 480 × 128으로 최종 이미지를 만들 수있는 평면 보간을 활성화, 반복 시간 T의 _R = 16 밀리 초, 대역폭 = 160 Hz에서 / PX, 플립 각도 = 22 °. 약 30 분의 총 획득 시간 _(T)를 달성하기 위해 두 개의 평균과 세 개의 반복을 적용합니다.

4. MRI 데이터 분석

1. 소프트웨어 syngo의 fastView를 사용하여 데이터를 분석한다. 정량적 인 신호 향상을 위해, O를 정의 영역을 선택F 2 차원 평면 MRI 레코딩에 대한 관심과 개선 된 구조 (SI _MEMRI), 조직 배경 (SI의 _배경,), 소음 (SD의 _N)의 표준 편차의 신호 강도 (SI)를 결정합니다. 필요한 경우, LGN 및 SC 구조에 대한 신경 해부학 적 방향을 용이하게하기 위해 마우스 뇌 아틀라스를 사용합니다. : 수식을 이용한 콘트라스트 - 대 - 잡음비 (CNR)를 계산
2. CNR = (SI _MEMRI - SI의 _배경,) / SD _N
3. 각 샘플에 대한 평균 CNR 계산을위한 세 개의 연속 이미지를 정량화. 양측 주입 동물에서, 각각 독립적으로 반구를 분석합니다.
4. 수평 관상 및 시상 이미지의 묘사를 들어, 원래 3D MRI 데이터 세트에서 다 평면 재구성을 계산합니다. 이러한 처리 된 이미지는 정량 분석​​을하지 않는 것이 좋습니다. 레티노의 애니메이션 3D 재구성 (최대 강도 예측, MIPS의)를 만들려면- tectal 투사, 혈관 조영술 후 처리 소프트웨어 모듈을 사용합니다.

5. 미네소타 ^{2 +} Autometallography (TIMM 염색)

1. MEMRI 다음 미네소타 ^{2 +} 추적 뇌 구조의 TIMM 염색의 경우, 15-150 nmol의 망간 ^{2 +} ivit 24 시간 이전의 영상에의 투여 량을 주입.
2. MR 스캔 한 후, PBS의 30 ML 얼음처럼 차가운 0.325 % 나 ₂ S (산도 7.4)와 함께 동물을 perfuse. 냉동 섹션에서 망막 동결 샘플을 해부하다.
3. cryotome 15 μm의 두께의 연속, 적도 부분을 잘라.
4. Angenstein 등 ^22에 따라 정착 및 cryoprotection의 부재에 TIMM 염색 ^(21)를 수행합니다.

6. 통계 분석

사후 ANOVA 다음에 하나의 비교에 대한 학생의 T-테스트를​​ 사용하여 통계 분석을 수행합니다. 데이터는 평균 ± 표준 오차로 표시됩니다. 개별 N 번호는각 실험에 대해 별도로 없습니다. (***, P ≤ 0.001, **, P ≤ 0.01 *, P ≤ 0.05) 0.05 ≤ P에 도달 한 결과는 통계적으로 유의 한 것으로 간주됩니다.

결과

정확하게 시각적 투사의 활력과 기능을 평가하기 위해이 영상 기술의 능력은 유리체와 망막 신경절로의 흡수에 독성 미네소타 ^{2 +} 복용량의 정확한 응용 프로그램에 의존한다. 이 주요 가정은 계층 별 미네소타 ^{2 +} 흡수가 autometallography (TIMM 염색) ^(21)에 의해 설명된다 그림 1에서 테스트합니다. 망막 섹션은 컨트롤과 같은 15 nmol의 150 nmol의 하나 미네소타 ^{2 +...}

토론

시각 시스템의 MEMRI은 순진하고 병적 인 조건에서 기능을 평가하기위한 기존의 신경 생물학적 기술을 확장합니다. 떨어져 고립 CNS 섬유 기관의 무결성에 독특한 통찰력을 제공에서, MEMRI 쉽게 시각적 인식에 대한 특정 패러다임의 즉각적인 결과를 조사하기 위해, 행동 예를 들어, 테스트, 검안 및 시각 기반의 물 작업으로 보충 할 수있다. 또한 전기 생리학과 생체 내에서 기능 시각적...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI contrast reagent
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol	Jenapharm, Jena, Germany	PZN 3524531
Chloral hydrate	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	C8383	420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder			custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	6502	tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106346	for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
Gum arabic	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
Citric acid (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106448
Silver nitrate (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908