In vivo imaging di Optic Nerve Fiber Integrity by MRI Contrast-Enhanced nei topi

Riepilogo

Questo video illustra un metodo, utilizzando un clinico 3 scanner T, per contrasto-enhanced RM del mouse ingenua proiezione visiva e per studi ripetitivi e longitudinali in vivo di degenerazione del nervo ottico associati a lesioni acute ottico schiacciamento del nervo e la degenerazione del nervo ottico cronica topi knock-out (p50 ^KO).

Abstract

Il sistema visivo roditore comprende cellule gangliari della retina e dei loro assoni che formano il nervo ottico per entrare nei centri talamo e mesencefalo, e proiezioni postsinaptici alla corteccia visiva. Sulla base della sua struttura anatomica distinta e comoda accessibilità, è diventato la struttura preferita per gli studi sulla sopravvivenza neuronale, rigenerazione assonale, e la plasticità sinaptica. Recenti progressi in RM hanno permesso la visualizzazione in vivo della parte retino-tectal di questa proiezione utilizzando manganese mediata aumento del contrasto (MEMRI). Qui vi presentiamo un protocollo MEMRI per l'illustrazione della proiezione visiva nei topi, da cui risoluzioni (200 micron) ³ possono essere raggiunti utilizzando comuni 3 scanner Tesla. Dimostriamo come l'iniezione intravitreale di una singola dose di 15 nmol MnCl ₂ porta ad un miglioramento saturo della proiezione intatto entro 24 ore. Con eccezione della retina, cambiamenti di intensità del segnale sono indisidente della coincisa stimolazione visiva o invecchiamento fisiologico. Applichiamo ulteriormente questa tecnica per monitorare longitudinalmente degenerazione assonale in risposta al danno del nervo ottico acuto, un paradigma con il quale Mn ^{2 +} trasporto completamente arresti presso il sito di lesione. Al contrario, attivo Mn ^{2 +} trasporto è quantitativamente proporzionale alla vitalità, il numero e l'attività elettrica delle fibre assoni. Per tale analisi, rappresentiamo Mn ^{2 +} cinetiche di trasporto lungo il percorso visivo in un modello di topo transgenico (NF-kB p50 ^KO) visualizzando atrofia spontanea di sensoriali, tra cui visivi, proiezioni. In questi topi, MEMRI indica ridotta ma non ritardato Mn ^{2 +} trasporto rispetto ai topi wild type, rivelando così segni di alterazioni strutturali e / o funzionali da mutazioni NF-KB.

In sintesi, MEMRI ponti comodamente in vivo e post mortem istologia per il characterizatisu integrità e l'attività delle fibre nervose. E 'molto utile per studi longitudinali sulla degenerazione assonale e rigenerazione, e ricerche di topi mutanti per fenotipi originali o inducibili.

Introduzione

Sulla base della sua struttura neuro-anatomica favorevole il sistema visivo roditore offre possibilità uniche per valutare composti farmacologici e la loro capacità di mediare neuroprotezione ¹ o effetti pro-rigenerativi ^2,3. Inoltre, per studi sulle caratteristiche funzionali e neuro-anatomica di mutanti di topo, come recentemente esemplificato per topi privi della proteina ponteggio presinaptica Bassoon ^4. Inoltre, un ampio spettro di strumenti supplementari permette supplementare con delle cellule gangliari retiniche (RGC) e numeri assoni RGC nonché attività RGC, ad esempio, da elettroretinografia e test comportamentali, e la determinazione di riarrangiamenti corticali mediante imaging ottico di segnali intrinseci. Gli ultimi sviluppi tecnici in microscopia laser consentono di visualizzazione situ di RGC rigenerazione profonda dei tessuti imaging di fluorescenza in interi esemplari di montaggio delle nervo ottico (ON) e il cervello. In questo histologapproccio iCal, tetraidrofurano basato radura del tessuto in combinazione con foglio leggero microscopia a fluorescenza permette la risoluzione delle singole fibre che ri-entrare nel deafferented ON e tratto ottico ^5. Mentre tali tecniche possono essere superiori in risoluzione e determinazione della curva di crescita, non consentono analisi ripetitive e longitudinali di eventi di crescita individuali, particolarmente desiderati per valutare il processo di rigenerazione lungo termine.

Contrasto-enhanced MRI è stata impiegata per la visualizzazione minima invasività della proiezione retino-tectal in topi e ratti ^6,7. Ciò può essere ottenuto mediante consegna intraoculare diretta di ioni paramagnetici (ad esempio, Mn ^{2 +)} di cellule retiniche. Come un analogo calcio, Mn ^{2 +} è incorporato in RGC somata tramite i canali del calcio voltaggio-dipendenti e attivamente trasportati lungo il citoscheletro assonale della ON intatta e tratto ottico. Mentre si accumula nei nuclei cerebralidella proiezione visiva, cioè il nucleo genicolato laterale (LGN) e collicolo superiore (SC), la propagazione transsynaptic nella corteccia visiva primaria appare trascurabile ^8,9, anche se può verificarsi ^10,11. Sotto MR sequenziamento, paramagnetica Mn ^{2 +} Potenziati MR contrasto principalmente accorciando T ₁ spin-reticolo tempo di rilassamento ^12. Tale Mn ^{2 +} migliorato MRI (MEMRI) è stato applicato con successo in diversi studi neuro-anatomici e funzionali di ratti, compresa la valutazione della rigenerazione assonale e la degenerazione dopo sul pregiudizio ^13,14, la precisa mappatura anatomica della proiezione ¹⁵ retino-tectal , nonché la determinazione delle caratteristiche trasporto assonale dopo il trattamento farmacologico ^16. Recenti ricerche nel dosaggio, tossicità, e la cinetica dei protocolli MRI neuronali Mn ^{2 +} assorbimento e il trasporto, nonché il miglioramento hanno esteso la sua applicazione agli studi sui transgenicitopi ⁹ con 3 scanner Tesla comunemente utilizzati nella pratica clinica ^17.

Qui vi presentiamo un protocollo MEMRI adatto longitudinale imaging in vivo del mouse retino-tectal proiezione ed esemplificare la sua applicabilità valutando Mn ^{2 +} dipendente potenziamento del segnale in condizioni di neurodegenerazione ingenue e vari. Il nostro protocollo pone particolare enfasi sulla acquisizione dati MR in un moderato 3 T campo magnetico che è generalmente più accessibile rispetto agli scanner di animali dedicati. Nei topi naive, illustriamo come intensità di segnale specifico tratto può essere sostanzialmente e riproducibile diventare aumentata dopo intravitreale (ivit) Mn ^{2 +} applicazione. Quantitativamente, Mn ^{2 +} propagazione lungo la proiezione visiva si verifica indipendentemente dal normale processo di invecchiamento (misurata tra 3 e 26 mesi di età topi) e aumento è refrattario alla stimolazione visiva e l'adattamento all'oscurità. Al contrario, Mn ^{2 + arricchimento nei centri talamo e mesencefalo è diminuita a seguito acuta ON lesione da schiacciamento 18, così come in NFKB1 topi knock-out (p50 KO) affetti da spontanea morte apoptotica RGC e sulla degenerazione 19. Così, in espansione per analisi istologica convenzionale, longitudinale analisi MEMRI singoli animali ha la profilatura della cinetica uniche di processi neurodegenerativi. Questo dovrebbe rivelarsi utile per gli studi sulla neuroprotezione e rigenerazione assonale associati a interventi farmacologici o genetici.}

Protocollo

Tutti gli interventi di animali vengono eseguite in conformità con la Convenzione europea per la cura degli animali ed uso di animali da laboratorio e la Dichiarazione ARVO per l'uso di animali in Oftalmica e Vision Research. Tutti gli esperimenti sono approvate dal comitato etico locale. La procedura di lesioni ON nei topi è descritto altrove ^9.

1. Intravitreali Manganese Injection

1. Eseguire la Mn ^{2 +} iniezione di 24 ore prima della MR scansione con l'aiuto di un assistente. Anestetizzare gli animali mediante iniezione intraperitoneale di una soluzione di cloralio idrato 5% (420-450 mg / kg di peso corporeo in PBS sterile). Per ulteriori anestesia topica, applicare una goccia di liquido conjuncain (0,4% ossibuprocaina cloridrato) alla cornea prima puntura occhio. Per iniettare 15 nmol Mn ^{2 +} per occhio preparare una MnCl mM soluzione 7.5 _2, ad esempio, diluendo 1 L di 1 M MnCl ₂ stock soluzione in 132 LH _{2 <}/ Sub> O. Carico 5 microlitri della soluzione finale in una siringa da 5 microlitri Hamilton collegato ad un piccolo mozzo dell'ago rimovibile 34 G (RN ago).
2. Quando si avvia con l'occhio destro, posizionare il mouse a sinistra lati sotto un microscopio binoculare e delicatamente aperto e fissare l'occhio destro tra il pollice e l'indice della mano sinistra. Raccogliete la siringa con la mano destra e prendere in mano l'ago vicino alla punta. Per puntura atraumatica del bulbo oculare, inserire con attenzione l'ago nel corpo vitreo alla circonferenza infero-temporale di circa 1 mm distale al limbus, risparmiando quindi i vasi sclerali.
3. Successivamente, l'assistente applica lentamente il volume totale di 2 ml controllando la scala della siringa Hamilton. Durante questa procedura, controllare il posizionamento dell'ago ottimale sotto il microscopio ed evitare la puntura della lente o fuoriuscita del liquido. Tenere l'ago staticamente inserito, per altri 30 sec, quindi estrarre lentamente per minimizzare liquidofuoriuscite dal sito di iniezione.
4. Durante tutta la procedura, particolare attenzione deve essere presa per evitare la pressione per l'occhio. Allo stesso modo, evitare i tentativi aggressivi o numerosi per bucare il bulbo oculare. Dal Mn ^{2 +} assorbimento in RGC e di trasporto lungo l'ON è già saturo a 15 nmol MnCl _2, questo riduce al minimo le variazioni di segnale da volumi di iniezione leggermente imprecisi. Per il potenziamento del segnale bilaterale della proiezione visiva, ripetere la procedura di iniezione per l'occhio sinistro.
5. Applicare ofloxacina contenenti (3 mg / ml) collirio e pomata-pantenolo contenente una volta dopo la procedura per prevenire le infezioni oculari e asciugatura dell'occhio. Restituire i topi nelle loro gabbie ma in condizioni normali fino all'inizio della scansione MR.

2. Preparazione degli animali MRI

1. Anestetizzare il mouse mediante somministrazione di una miscela di gas isoflurano / ossigeno 2% / 98%. Montare il mouse su un supporto per mouse in una posizione torti quasi orizzontale. Insert in bobina MR, e viene modificata all'interno dello scanner MR. Monitorare la respirazione e la frequenza cardiaca da sistemi adeguati. Per i dettagli tecnici, consultare Herrmann et al ^20.
2. Durante MRI, deposito di anestesia mediante insufflazione continua di un 1,5% / 98,5% miscela di gas inizialmente isoflurano / ossigeno tramite un evaporatore collegato al supporto della testina di topo da un tubo integrato. Durante la scansione, regolare la profondità di anestesia in base ai parametri vitali registrati (cioè puntare ad una frequenza respiratoria stabile di circa 40 respiri al minuto). Utilizzando un dispositivo di riscaldamento a mantenere la temperatura della superficie corporea stabile tra 35 e 37 ° C, come misurato da un sensore termico posizionato al sito addominale del mouse. Per i dettagli tecnici, consultare Herrmann et al ^17.
3. Dopo la scansione, di liberare il mouse dal supporto e la fornitura di ossigeno puro per accelerare il recupero dall'anestesia. Inoltre, mantenere la temperatura corporea stabile utilizzandouna fonte di calore luce rossa.

3. MRI protocollo

1. Il protocollo è validato per un Tesla scanner 3, dotata di una SNR-efficiente, piccola bobina animale dedicato (bobina Litz linearmente polarizzata) con un campo efficace di vista di 35 mm × 38 mm di diametro. Azionare la bobina in modalità di trasmissione-ricezione.
2. Con l'animale nella sua posizione finale, regolare la sintonia e corrispondenza della bobina con l'ausilio di un analizzatore di frequenza. Regolare manualmente la tensione di riferimento del trasmettitore e le correnti spessori per ottimizzare l'omogeneità di immagine e qualità.
3. Acquisire T ₁ pesate immagini 2D TSE con una risoluzione di 0,5 mm × 0,5 millimetri × 2 mm di vista sagittale e trasversale per la pianificazione. Utilizzando i pianificazione esami di risonanza magnetica, acquisire le immagini MEMR in direzione di misura coronale, ruotato di essere parallela alla testa dell'animale con la codifica di fase lungo la direzione sinistra-destra. Per minimizzare il tempo di acquisizione, utilizzare un campo rettangolare di vista adeguato allaDimensioni della testina reali. Impiegare una sequenza FLASH 3D viziato (VIBE 3D) utilizzando i seguenti parametri: matrice di base 256, campo visivo 54 millimetri × 50,65 millimetri x 14,08 millimetri, con il 93,8% del campo rettangolare di vista in fase di direzione codificare, e 128 fette di 0,11 mm spessore della fetta con una risoluzione fetta impostata a 61%.
4. Attivare l'interpolazione nel piano per creare immagini finali con 512 × 480 × 128, fornendo una risoluzione effettiva di 0,21 mm x 0,21 millimetri × 0,18 millimetri (0.1 mm × 0,1 millimetri × 0,09 millimetri interpolati), tempo di eco T _E = 6.51 msec, tempo di ripetizione T _R = 16 msec, larghezza di banda = 160 Hz / px, flip angle = 22 °. Applicare due medie e tre ripetizioni per ottenere un tempo totale di acquisizione (T _A) di circa 30 min.

4. MRI Analisi dei dati

1. Analizzare i dati utilizzando il software fastView syngo. Per il potenziamento del segnale quantitativa, selezionare le regioni definite of interesse in 2D planari registrazioni MRI e determinare intensità di segnale (SI) della struttura migliorata (SI _MEMRI), sfondo di tessuto (SI _Priorità), e la deviazione standard del rumore (SD _N). Se necessario, utilizzare un atlante del cervello mouse per facilitare l'orientamento neuro-anatomico per LGN e le strutture SC. Calcolare il rapporto di contrasto-rumore (CNR) mediante la formula:
2. CNR = (SI _MEMRI - SI _Priorità) / SD _N
3. Quantificare tre immagini consecutive per il calcolo della media CNR per ogni campione. Negli animali bilateralmente iniettati, analizzare ogni emisfero indipendente.
4. Per la rappresentazione di immagini orizzontali, coronali e sagittali, calcolare ricostruzioni multiplanari dal set di dati 3D MRI originale. Queste immagini elaborate non sono raccomandati per l'analisi quantitativa. Per creare ricostruzioni 3D animati (proiezioni di massima intensità, MIPS) del retino-Tectal proiezione, utilizzare un modulo software di post-elaborazione angiografia.

5. Mn ^{2 +} Autometallography (TIMM colorazione)

1. Per TIMM colorazione di Mn ² strutture cerebrali ⁺ tracciate seguendo MEMRI, iniettare una dose di 15-150 nmol Mn ^{2 +} ivit 24 ore prima di imaging.
2. Dopo la scansione del MR, profumato gli animali con 30 ml ghiacciata 0,325% Na ₂ S in PBS (pH 7,4). Sezionare retine e congelare i campioni nella sezione congelata.
3. Tagliare sequenziali, sezioni equatoriali di spessore 15 micron su un cryotome.
4. Eseguire TIMM colorazione ²¹ in assenza di fissativo e crioprotezione secondo Angenstein et al ^22.

6. Analisi statistica

Effettuare analisi statistiche utilizzando il test t di Student per singoli confronti, seguita da post hoc ANOVA. I dati sono presentati come media ± errore standard. Numeri individuali N sonoindicati separatamente per ciascun esperimento. Risultati raggiungendo P ≤ 0,05 sono considerati statisticamente significativi (P ≤ 0.05, *; P ≤ 0.01, **; P ≤ 0,001, ***).

Risultati

La capacità di questa tecnica di imaging per valutare con precisione la vitalità e la funzionalità della proiezione visiva si basa su una precisa applicazione di un tossico Mn ^{2 +} dosaggio al corpo vitreo e il suo assorbimento da RGC. Questo importante assunzione viene testato in Figura 1, dove strato specifico Mn ^{2 +} assorbimento è dimostrato dal autometallography (TIMM colorazione) ^21. Sezioni retina sono state analizzate a 24 ore dopo l'applicazione di una

Discussione

MEMRI del sistema visivo si estende tecniche neurobiologiche convenzionali per valutare la funzionalità in condizioni ingenue e patologiche. Oltre ad una visione unica l'integrità di un isolato fibra tratto CNS, MEMRI può essere facilmente integrato con test comportamentali, per esempio, optometria e compiti a base di acqua visivamente, di indagare le conseguenze immediate di un dato paradigma per la percezione visiva. Si collega anche elettrofisiologici e le indagini istologiche con caratterizzazione vi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI contrast reagent
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol	Jenapharm, Jena, Germany	PZN 3524531
Chloral hydrate	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	C8383	420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder			custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	6502	tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106346	for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
Gum arabic	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
Citric acid (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106448
Silver nitrate (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908