Imagem in vivo da fibra óptica Nerve Integrity por ressonância magnética com contraste em Ratos

Resumo

Este vídeo ilustra um método, usando um scanner T clínica 3, por MR com contraste de imagem da projeção visual ingênuo do mouse, para estudos in vivo repetitivos e longitudinais de degeneração do nervo óptico associados com lesão por esmagamento do nervo óptico aguda e degeneração do nervo óptico crônica em camundongos knock-out ^(KO p50).

Resumo

O sistema visual de roedores engloba células ganglionares da retina e seus axônios que formam o nervo óptico para entrar centros tálamo e mesencéfalo, e projeções pós-sinápticos para o córtex visual. Com base na sua estrutura anatómica distinta e acessibilidade conveniente, tornou-se a estrutura preferida para estudos sobre a sobrevivência neuronal, regeneração axonal, e plasticidade sináptica. Os recentes avanços na ressonância magnética permitiram a visualização in vivo da parte retino-tectal dessa projeção usando manganês mediada realce de contraste (MEMRI). Aqui, apresentamos um protocolo MEMRI para ilustração da projeção visual em camundongos, pelo qual resoluções de (200 mm) ³ pode ser conseguido usando scanners comuns 3 Tesla. Demonstramos como injecção intravítrea de uma única dose de 15 nmol de _MnCl2 conduz a um acessório saturada de projecção intacto dentro de 24 horas. Com exceção da retina, alterações na intensidade do sinal são indedente de estimulação visual coincidiu ou envelhecimento fisiológico. Aplicamos ainda mais essa técnica para monitorar longitudinalmente degeneração axonal em resposta à lesão do nervo óptico aguda, um paradigma pelo qual Mn ^{2 +} transporte completamente prisões no local da lesão. Por outro lado, Mn ^{2 +} transporte ativo é quantitativamente proporcional à viabilidade, número e atividade elétrica das fibras de axônio. Para tal análise, exemplificamos Mn ^{2 +} cinética de transporte ao longo do caminho visual em um modelo de camundongo transgênico (NF-kB p50 ^KO) exibindo atrofia espontânea de sensorial, incluindo visuais, projeções. Nestes ratos, MEMRI indica reduzida mas não retardada de Mn ^{2 +} transporte, em comparação com ratinhos de tipo selvagem, revelando sinais de deficiências estruturais e / ou funcionais, por mutações de NF-kB.

Em resumo, MEMRI convenientemente pontes ensaios in vivo e post mortem histologia para o characterizatina de integridade e atividade de fibras nervosas. É muito útil para estudos longitudinais sobre degeneração e regeneração axonal e investigações de ratos mutantes para fenótipos genuínos ou induzidas.

Introdução

Com base na sua estrutura neuro-anatômica favorável do sistema visual de roedores oferece possibilidades únicas para avaliar compostos farmacológicos e sua capacidade de mediar neuroproteção ¹ ou efeitos pró-regenerativas ^2,3. Além disso, ele permite que os estudos sobre as características funcionais e neuro-anatômica de mutantes do rato, como recentemente exemplificado para camundongos sem a proteína andaimes pré-sináptico Fagote ^4. Além disso, um amplo espectro de ferramentas complementares proporciona adicional que caracteriza de células da retina gânglio (RGC) e os números de axónios RGC, bem como a actividade das CGR, por exemplo, por electrorretinografia e testes comportamentais, e a determinação de rearranjos corticais por imagiologia óptica de sinais intrínsecos. Os últimos desenvolvimentos técnicos em microscopia a laser permitem a visualização em situ de RGC regeneração por tecidos profundos imagens de fluorescência em amostras inteiras de montagem de nervo óptico (ON) e cérebro. Neste histológicoabordagem iCal, tetra baseado compensação tecido em combinação com a microscopia de fluorescência de luz folha permite a resolução de fibras individuais que re-entrar no ON desaferentada e trato óptico ^5. Enquanto tais técnicas pode ser superior na resolução e determinação de padrões de crescimento, eles não permitem análises repetitivas e longitudinais de acontecimentos individuais de crescimento, as quais são particularmente desejados para avaliar o processo de regeneração a longo prazo.

RM contrastada tem sido empregada para a visualização minimamente invasiva da projeção retino-tectal em camundongos e ratos ^6,7. Isto pode ser conseguido por entrega intra-ocular directa de iões paramagnéticos (por exemplo, Mn ^{2 +)} para as células da retina. Como um análogo de cálcio, Mn ^{2 +} é incorporada RGC somata através de canais de cálcio dependentes da voltagem e ativamente transportado ao longo do citoesqueleto axonal do ON intacta e trato óptico. Enquanto se acumula nos núcleos do cérebroda projecção visual, isto é, o núcleo geniculado lateral (LGN) e colículo superior (SC), a propagação transsináptica no córtex visual primário parece insignificante ^8,9, embora possa ocorrer ^10,11. Sob MR seqüenciamento, paramagnética Mn ^{2 +} aumenta MR contraste principalmente pelo encurtamento _T1 spin-rede tempo de relaxamento ^12. Tal Mn ^{2 +} reforçada MRI (MEMRI) tem sido aplicado com sucesso em vários estudos neuro-anatômicas e funcionais de ratos, incluindo a avaliação da regeneração axonal e degeneração após ON lesão ^13,14, o mapeamento anatômico preciso da ¹⁵ projeção retino-tectal , bem como a determinação das características de transporte axonal após o tratamento farmacológico ^16. Refinamentos recentes na dosagem, toxicidade e cinética de protocolos de ressonância magnética neuronais Mn ^{2 +} absorção e transporte, bem como melhorados têm estendido a sua aplicação aos estudos sobre transgênicosratinhos ⁹ utilizando 3 scanners Tesla vulgarmente utilizados na prática clínica ^17.

Aqui, apresentamos um protocolo adequado para MEMRI longitudinal in vivo de imagens da projeção retino-tectal rato e exemplificar sua aplicabilidade avaliando Mn ^{2 +} aumento do sinal dependente em condições neurodegeneração ingênuos e vários. Nosso protocolo coloca especial ênfase para a aquisição de dados em um MR 3 T campo magnético moderado que geralmente é mais acessível do que os scanners de animais dedicados. Em camundongos ingênuos, que ilustram como a intensidade do sinal específico do trato pode ser substancialmente e reproduzível tornar aumentou após intravítrea (ivit) Mn ^{2 +} aplicação. Quantitativamente, Mn ^{2 +} propagação ao longo da projeção visual ocorre independentemente do processo de envelhecimento normal (medido entre os ratos 3 e 26 meses de idade) e de aumento é refratário a estimulação visual e adaptação à escuridão. Em contraste, Mn ^{2 + enriquecimento em centros tálamo e mesencéfalo é diminuída seguinte aguda ON lesão por esmagamento 18, bem como em NFKB1 camundongos knock-out (KO p50) que sofrem de morte espontânea RGC apoptose e na degeneração 19. Assim, em expansão para análise histológica convencional, análise MEMRI longitudinal de animais individuais permite perfis de cinética únicas de processos neurodegenerativos. Isso deve ser útil para estudos sobre a neuroproteção e regeneração axonal associados com intervenções farmacológicas ou genéticas.}

Protocolo

Todas as intervenções animais são realizados em conformidade com a Convenção Europeia para a Animal Care e Uso de Animais de Laboratório ea Demonstração ARVO para o uso de animais em Ophthalmic and Vision Research. Todos os experimentos foram aprovados pelo comitê de ética local. O procedimento de lesão ON em ratos é descrito em outra parte ^9.

1. Intravítrea Manganês Injeção

1. Realize o Mn ^{2 +} injeção 24 horas antes do MR varredura com a ajuda de um assistente. Anestesiar os animais, por injecção intraperitoneal de uma solução de hidrato de cloral a 5% (420-450 mg / kg de peso corporal em PBS estéril). Para anestesia tópica adicional, aplicar uma gota de conjuncain líquido (0,4% de cloridrato de oxibuprocaína) à córnea antes da punção olho. Para injectar 15 nmol de Mn ^{2 +} por olho preparar uma mM _de MnCl2 solução 7,5, por exemplo, por diluição de 1 L de uma solução ₂ M de MnCl estoque em 132 LH _{2 <}/ Sub> O. Carga 5 ul da solução final numa seringa de 5 mL de Hamilton ligada a um 34 L pequeno cubo de agulha amovível (agulha RN).
2. Ao iniciar com o olho direito, posicione o mouse-esquerda lado sob um microscópio binocular e gentilmente aberta e fixar o olho direito entre o polegar eo dedo indicador de sua mão esquerda. Pegar a seringa com a mão direita e segure a agulha perto da ponta. Por punção atraumática da lâmpada olho, inserir cuidadosamente a agulha para dentro do corpo vítreo a circunferência ínfero-temporal aproximadamente, 1 mm distal do limbo, poupando assim os vasos da esclera.
3. Em seguida, o assistente aplica-se lentamente o volume total de 2 mL, enquanto controla a escala da seringa Hamilton. Durante este procedimento, monitorizar a colocação da agulha óptima sob o microscópio e evitar a perfuração da lente ou o derramamento do líquido. Mantenha a agulha inserida estaticamente para um adicional de 30 segundos, em seguida, retirá-la lentamente para minimizar líquidoperda no local da injeção.
4. Durante todo o processo, deve ser tomado cuidado especial para evitar a pressão no olho. Da mesma forma, evitar tentativas hostis ou numerosas para perfurar o bulbo ocular. Desde Mn ^{2 +} captação no CGR e transporte ao longo da ON já está saturado em 15 nmol _MnCl2, isso minimiza as variações de sinal por volumes de injeção um pouco imprecisas. Para o aumento do sinal bilateral da projeção visual, repita o procedimento de injeção para o olho esquerdo.
5. Aplicar ofloxacina contendo (3 mg / ml), as gotas oculares e pomadas contendo pantenol uma vez após o procedimento para evitar infecções oculares e secagem do olho. Retorne os ratos para suas gaiolas em condições normais de habitação até o início da digitalização MR.

2. Preparação Animal para MRI

1. Anestesiar o rato pela administração de uma mistura de gás isoflurano / oxigênio 2% / 98%. Monte o mouse sobre um suporte de rato em, uma posição quase horizontal sem torção. Insert-o na bobina de MR, que é ajustado, em seguida, no interior do scanner de MR. Monitore a respiração ea frequência cardíaca em sistemas apropriados. Para obter detalhes técnicos, consulte Herrmann et al ^20.
2. Durante MRI, anestesia oferta por insuflação contínua de um 1,5% / 98,5% mistura de gás inicialmente isoflurano / oxigênio através de um evaporador ligado ao suporte da cabeça do rato por um tubo integrado. Durante a verificação, ajustar a profundidade da anestesia de acordo com os parâmetros vitais gravados (ou seja, apontar para uma taxa de respiração estável de cerca de 40 respirações por minuto). Usando um dispositivo de aquecimento de manter a temperatura da superfície do corpo estável entre 35 e 37 ° C, como medido por um sensor de temperatura posicionado no local abdominal do rato. Para obter detalhes técnicos, consulte Herrmann et al ^17.
3. Após a verificação, libertar o rato do suporte e abastecer com oxigênio puro para acelerar a recuperação da anestesia. Para além disso, manter a temperatura do corpo estável usandouma fonte de aquecimento da luz vermelha.

3. Protocolo de MRI

1. O protocolo é validado por um scanner de 3 Tesla equipado com um, SNR-eficiente, pequena bobina animais dedicada (polarizada linearmente bobina Litz) com um campo de visão efetivo de 35 mm x 38 mm de diâmetro. Operar a bobina no modo de transmissão-recepção.
2. Com o animal na sua posição final, ajustar o tom e fósforo da bobina com o auxílio de um analisador de frequência. Ajustar manualmente a tensão de referência do transmissor e as correntes de calços para otimizar a homogeneidade ea qualidade da imagem.
3. Adquirir T ₁ ponderados imagens 2D TSE com uma resolução de 0,5 mm x 0,5 mm x 2 mm de vista longitudinal e transversal para o planejamento. Usando os exames de RM de planejamento, adquirir as imagens MEMR em direção medição coronal, girada para ser paralela à cabeça do animal com a codificação de fase ao longo da direção esquerda-direita. Para minimizar o tempo de aquisição, use um campo retangular de vista ajustado aodimensões da cabeça reais. Empregar uma seqüência FLASH 3D mimada (VIBE 3D), utilizando os seguintes parâmetros: matriz de base 256, campo de visão 54 milímetros × 50,65 milímetros × 14,08 milímetros, utilizando 93,8% de campo de visão retangular na direção de codificação de fase, e 128 fatias de 0,11 mm espessura de corte com a resolução definida fatia para 61%.
4. Ative a interpolação no plano para criar imagens finais com 512 × 480 × 128, proporcionando uma resolução efetiva de 0,21 mm x 0,21 milímetros × 0,18 milímetros (0.1 mm x 0,1 mm x 0,09 milímetros interpolado), tempo de eco T _E = 6,51 ms, tempo de repetição T _R = 16 ms, largura de banda = 160 Hz / px, ângulo de inclinação = 22 °. Aplicar duas médias e três repetições para obter um tempo de aquisição total (T _A) de cerca de 30 min.

4. RM Análise de Dados

1. Analisar os dados usando o software fastView syngo. Para o aumento do sinal quantitativa, selecione regiões definidas of interesse em gravações de ressonância magnética planares 2D e determinar a intensidade do sinal (SI) da estrutura de reforço da (SI _MEMRI), o fundo do tecido _(Fundo SI), e o desvio padrão do ruído (SD _N). Quando necessário, use um atlas do cérebro do rato para facilitar a orientação neuro-anatômica para LGN e estruturas SC. Calcula-se a razão de contraste-ruído (CNR) usando a fórmula:
2. CNR = (SI _MEMRI - SI _Fundo) / SD _N
3. Quantificar três imagens consecutivas para o cálculo CNR média para cada amostra. Em animais injectados bilateralmente, analisar cada hemisfério independentemente.
4. Para representação de imagens horizontais, coronal e sagital, calcule reconstruções multiplanares do conjunto original de dados de MRI 3D. Estas imagens processadas não são recomendados para análise quantitativa. Para criar reconstruções 3D animadas (projeções de intensidade máxima, MIPS) da retinoProjeção tectal, use um módulo de software de pós-processamento de angiografia.

5. Mn ^{2 +} Autometallography (TIMM Coloração)

1. Para TIMM coloração de Mn ^{2 +} estruturas cerebrais traçadas seguinte MEMRI, injetar uma dose de 15-150 nmol Mn ^{2 +} ivit 24 horas antes da imagem.
2. Depois do MR varredura, perfuse os animais com 30 ml gelada 0,325% Na ₂ S em PBS (pH 7,4). Dissecar retina e amostras congeladas na seção de congelados.
3. Corte seqüenciais, seções equatoriais da espessura 15 mM em um cryotome.
4. Realização da coloração TIMM ^21, na ausência de agente fixador e crioprotecção de acordo com ANGENSTEIN et al ^22.

6. Statistical Analysis

Realizar análises estatísticas usando o teste t de Student para comparações individuais, seguido pelo post hoc ANOVA. Os dados são apresentados como média ± erro padrão. Números individuais de N sãodeterminado separadamente para cada experimento. Resultados atingindo P ≤ 0,05 são considerados estatisticamente significativa (P ≤ 0,05, *, P ≤ 0,01, **, P ≤ 0,001, ***).

Resultados

A capacidade desta técnica de imagem para avaliar com precisão a vitalidade ea funcionalidade da projeção visual depende a aplicação precisa de um atóxico Mn ^{2 +} dosagem para o corpo vítreo e sua absorção pelas CGR. Este pressuposto importante é testado na Figura 1, onde específica Mn ^{2 +} absorção camada é demonstrada por autometallography (coloração TIMM) ^21. Secções da retina foram analisados ​​às 24 h após a aplicação de ivit ou 15 ...

Discussão

MEMRI do sistema visual estende técnicas neurobiológicas convencionais para avaliar a funcionalidade em condições ingênuos e patológicos. Além de oferecer uma perspectiva única sobre a integridade de um isolado CNS trato fibra, MEMRI pode ser facilmente complementada com testes comportamentais, por exemplo, optometria e tarefas de água com base visualmente, para investigar as conseqüências imediatas de um determinado paradigma para a percepção visual. Ela também liga eletrofisiológico e investiga...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI contrast reagent
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol	Jenapharm, Jena, Germany	PZN 3524531
Chloral hydrate	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	C8383	420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder			custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	6502	tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106346	for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
Gum arabic	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
Citric acid (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106448
Silver nitrate (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908