マウスにおける造影MRIによる視神経線維の整合性in vivoイメージング

要約

このビデオでは、ナイーブマウス視覚投影の造影MRイメージングのための急性視神経挫滅損傷および慢性視神経変性に関連視神経変性の繰り返しと縦のin vivo試験では、臨床3 Tスキャナを使用して、方法を示しているノックアウトマウス（P50 ^KO）。

要約

齧歯類の視覚システムは、視床と中脳の中心を入力する視神経を形成する網膜神経節細胞とその軸索を包含し、視覚野のシナプス後予測。その明確な解剖学的構造、便利なアクセス可能性に基づいて、ニューロンの生存、軸索再生、およびシナプス可塑性の研究のために好ま構造となっています。 MRイメージングにおける最近の進歩は、マンガン媒介コントラスト強調（MEMRI）を使用して、この突起のレチノ-視蓋部分のin vivo可視化を可能にした。ここでは、（200ミクロン^）3の解像度は一般的な3テスラスキャナを用いて達成することが可能なマウスにおける視覚投影、MEMRIを説明するためのプロトコルを提供する。私たちは、15ナノモルのMnCl ₂の単回投与量の硝子体内注射は24時間以内で完全な投影の飽和向上につながる方法を示しています。網膜を除いて、信号強度の変化が独立しているその一致視覚刺激または生理的老化の凹み。私たちは、縦方向に、この手法をさらに適用する軸索急性視神経損傷を受けて変性症はMn ^{2 +}輸送によるパラダイム病変部位で完全に逮捕を監視します。逆に、活性^の Mn ^{2 +}輸送は、生存率、数、および軸索線維の電気的活性に定量的に比例する。このような分析のために、我々は視覚的な突起を含む感覚の自発的な萎縮を表示するトランスジェニックマウスモデル（NF-κB活性P50 ^KO）での視覚的なパスに沿って^の Mn ^{2 +}輸送動態を例示している。これらのマウスでは、MEMRIは減少したが、このようにしてNF-κBの突然変異により、構造および/ ​​または機能障害の徴候を明らかにし、野生型マウスと比較して^の Mn ^{2 +}輸送を遅延しないことを示します。

要約すると、MEMRIは便利in vivoアッセイを橋渡しし、characterizatiための死後の組織学を投稿神経線維の完全性と活動の上。これは、縦方向の軸索変性と再生に関する研究、本物または誘導性表現型変異マウスの調査のために非常に有用である。

概要

その有利な神経解剖学的構造に基づいて、げっ歯類の視覚系は、神経保護¹又はプロ再生効果^2,3を媒介するために、薬理学的化合物およびそれらの能力を評価するためにユニークな可能性を提供しています。また、最近では、シナプス前足場タンパク質ファゴット^4を欠損したマウスで例示したように、マウスの突然変異体の機能的および神経解剖学的特性の研究を可能にします。さらに、補助的なツールの広いスペクトルが電図および行動試験、および固有信号の光イメージングによる皮質再配列の決定により、 例えば 、網膜神経節細胞（RGC）とのRGC軸索番号だけでなく、RGC活性の特色に追加与える。レーザー顕微鏡の最新技術開発が視神経（ON）と脳のホールマウント標本の深い組織蛍光イメージングによってRGC再生の現場での可視化を可能にする。このhistolog中iCalのアプローチは、光シート蛍光顕微鏡と組み合わせて、テトラヒドロフランに基づく組織のクリアをONに求心路遮断および視索⁵に再入力する単繊維の解像度を可能にします。このような技術は、解像度と成長パターンの決定に優れているかもしれませんが、彼らは、特に長期的な再生過程を評価することが望まれている個々の成長の節目、の繰り返しと縦の分析を有効にしないでください。

造影MRIは、マウスおよびラット^6,7における網膜視蓋投影の最小侵襲的可視化のために採用されています。これは、網膜細胞の常磁性イオン（ 例えば 、Mnが^{2 +）}の直接眼内送達によって達成することができる。カルシウムアナログとしてはMn ^{2 +が}電位依存性カルシウムチャネルを経由して、RGC細胞体に組み込まれ、積極的に無傷で、ONと視神経管の軸索細胞骨格に沿って搬送。それは脳核内に蓄積しながら、それが^10,11発生することがありますが、視覚的投影、外側膝状核（LGN）と上丘（SC） すなわち 、一次視覚野への経シナプス伝達は、無視できる程度の^8,9が表示されます。 MR配列決定の下、常磁性^の Mn ^{2 +は、T} ₁スピン-格子緩和時間^12を短くすることにより、主にMRコントラストを増強する。例えばMn ^{2 +、MRI（MEMRI）}が正常に傷害^13,14後の軸索再生および変性の評価を含めたラットの様々な神経解剖学的および機能的研究に適用されている強化され、レチノ-視蓋投影¹⁵の正確な解剖学的マッピング薬物治療¹⁶後の軸索輸送特性だけでなく、決定。 ^の Mn ^{2 +の}取り込み及び輸送神経細胞だけでなく、改善されたMRIプロトコルの投与量、毒性、および動力学における近年の改良により、トランスジェニックの研究への適用を拡大してきた一般的に臨床現場で使用される¹⁷ 3テスラスキャナを用いて、マウス^9。

ここでは、マウスの網膜視蓋投影のインビボ画像化に適した長手MEMRIプロトコルを提示し、ナイーブおよび種々の神経変性条件下で^の Mn ^{2 +}依存性のシグナル増強を評価することにより、その適用性を例示する。我々のプロトコルは、一般的に、専用の動物のスキャナよりもアクセスすることが適度な3 Tの磁場でMRデータ収集上の特定の重点を置きます。ナイーブマウスでは、腸管固有の信号強度が、実質的にかつ再現性硝子（ivit） ^の Mn ^{2 +}アプリケーションの後に増加になることができる方法を示しています。定量的には、視覚投影に沿って^の Mn ^{2 +}伝播が（3と26カ月齢のマウスの間で測定される）正常な老化プロセスとは独立して発生し、増加は暗闇に視覚刺激と適応に難治性である。対照的に、マンガン 2 +上視床および中脳センターの濃縮は、自発的アポトーシスRGC死からおよび変性^19日苦しんでノックアウトマウス（P50 ^KO）挫滅¹⁸急性だけでなく、NFKB1で以下に減少する。このように、従来の組織学的分析による膨張で、個々の動物の縦MEMRI分析は、神経変性プロセスのユニークな反応速度のプロファイリングを可能にします。これは、薬理学的または遺伝的な介入に関連した神経保護および軸索再生の研究のために有用であることを証明する必要があります。

プロトコル

全ての動物介入は実験動物の動物実験のための欧州条約および眼と視覚研究における動物の使用に関するARVO声明に従って行われる。全ての実験は、地元の倫理委員会によって承認されています。マウスにおけるON損傷の手順は、他の場所に記載されている^9。

1。硝子体内注射マンガン

1. アシスタントの助けを借りて、スキャン前にMRにマンガン^{2 +}注入24時間後に行う。 （滅菌PBS中で420〜450 mg / kg体重）5％抱水クロラール溶液の腹腔内注射により動物を麻酔。追加の局所麻酔のため、前目の穿刺に角膜に液体conjuncain一滴（0.4％塩酸オキシブプロカイン）を適用。目ごとに15ナノモル^の Mn ^{2 +を}注入するには、132のLH _{2 <}中1MのMnCl ₂ストック溶液1リットルに希釈することによって、 例えば 、7.5のMnCl ₂溶液を調製/サブ> O。 34gの小さなハブリムーバブルニードル（RN針）に接続されている5μLハミルトンシリンジに最終溶液の負荷5μL。
2. 右目で始まる場合には、双眼顕微鏡下で、ゆっくりと開いた左側のマウスを置き、左手の親指と人差し指の間に右目を修正。右手で注射器を手に取り、先端に近い針を手に取る。眼球の非外傷性穿刺については、慎重に、それ​​によって強膜血管を温存、角膜輪部の遠位にinfero時空周り約1ミリメートルで硝子体に針を挿入します。
3. ハミルトンシリンジの規模を制御しながら、次の、アシスタントが徐々に2μLの総容量が適用されます。この手順の間、顕微鏡下での最適な針の配置を監視し、液体のレンズやこぼれの穿刺を避ける。液体を最小限に抑えるため、ゆっくりとそれを撤回して、静的にさらに30秒間挿入された針を保つ注射部位からの漏れ。
4. 手順では、特別なケアは、目に圧力を避けるために注意すべきである。同様に、眼球を穿刺する過酷なまたは多くの試みを避ける。 ^の Mn ^{2 +}をONに沿ってのRGCや輸送への取り込みはすでに15ナノモルのMnCl ₂で飽和しているので、これは少し不正確注入量によって信号の変動を最小限に抑えることができます。視覚投影の二国間の信号増強のために、左眼用の注入手順を繰り返します。
5. 適用さオフロキサシン含有（3 mg / ml）を点眼し、手順は、眼感染症や目の乾燥を防ぐために、一回の後にパンテノール含有軟膏。 MRスキャンを開始するまでの通常の住宅の条件の下でケージにマウスを返します。

MRI用2。動物の準備

1. 2％/ 98％イソフルラン/酸素ガス混合物の投与によりマウスを麻酔。ほぼ水平、ねじられていない位置にマウスのホルダーにマウスをマウントします。インその後、MRスキャナ内部で調整されたMRコイル内へERTこと。適切なシステムによって呼吸と心拍数を監視します。技術的な詳細については、ハーマンら ^20を参照してください。
2. MRI、統合された管によってマウスヘッドホルダに接続された蒸発器を介して、最初に1.5％/ 98.5％イソフルラン/酸素ガス混合物の連続注入による供給麻酔中。スキャン中に、記録された重要なパラメータ（ すなわち 、毎分約40回の呼吸の安定した呼吸数を目標）によると、麻酔の濃さ ​​を調整します。加熱装置を使用すると、マウスの腹部部位に位置する温度センサにより測定される、35〜37°Cの間の安定した体表面温度を維持する。技術的な詳細については、ハーマンら ^17を参照してください。
3. スキャン後、ホルダーからマウスを解放し、麻酔からの回復を加速する純酸素を供給しています。さらに、使用して、安定した体温を保つ赤色光加熱源。

3。のMRIプロトコル

1. プロトコルは、35ミリメートル×38ミリメートル直径の有効視野に専用の、SNR効率、小動物コイル（直線偏光リッツコイル）を装備した3テスラスキャナのために検証されます。送受信モードでコイルを動作させてください。
2. その最終的な位置にある動物と、周波数分析器を用いてコイルの曲との一致を調整します。手動で画像の均一性および品質を最適化するために、送信機基準電圧とシム電流を調整する。
3. 計画のための矢状および横表示で0.5ミリメートル×0.5ミリメートル×2ミリメートルの解像度で、T ₁加重2D東証画像を取得する。計画MRスキャンを使用して、冠状測定方向にMEMR画像を取得、左右方向に沿って位相エンコードを動物の頭部に平行になるように回転される。取得時間を最小限にするために調整ビューの長方形のフィールドを使用実際のヘッドの大きさ。位相エンコード方向の画93.8％長方形のフィールドを使用して、ベースマトリックス256、視野14.08ミリメートル×50.65ミリメートル×54ミリメートル、および0.11 mmの128スライス：次のパラメータを使用して、甘やかされて育った3D点滅シーケンス（VIBE 3D）を採用スライス解像度のスライス厚は61％に設定する。
4. 、0.21ミリメートル×0.21ミリメートル×0.18ミリメートル（補間0.09ミリメートル×0.1ミリメートル×0.1ミリメートル）、エコー時間T _E = 6.51ミリ秒の有効分解能を提供し、512×480×128で、最終的なイメージを作成する面内補間をアクティブにする繰り返し_時間 t r = 16ミリ秒、帯域幅= 160 Hzの/ PX、フリップ角は= 22°。約30分の合計取得時間（T _A）を達成するために2つの平均値と3繰り返しを適用します。

4。のMRIデータ解析

1. ソフトウェアsyngo fastViewを使用してデータを分析します。定量的な信号増強のため、定義された領域Oを選択Fの2次元平面のMRIの録音への関心と強化された構造（SI _MEMRI）、組織のバックグラウンド（のSI _backgr）とノイズ（のSD _N）の標準偏差の信号強度（SI）を決定する。必要に応じて、LGNとSC構造のための神経解剖学的向きを容易にするために、マウス脳アトラスを使用しています。 ：式を用いて、コントラスト対雑音比（CNR）を算出
2. CNR =（SI _MEMRI - SI _backgr）/ SD _N
3. 各サンプルの平均のCNR計算のための3つの連続した​​画像を定量化する。両側性に注入された動物では、独立して各半球を分析。
4. 水平冠状および矢状画像の描写のために、オリジナルの3D MRIデータセットから多断面再構成を計算します。これらの処理された画像は、定量分析にはお勧めできません。レチノの生気に満ちた3D再構成（最大強度の予測、MIPの）を作成するには- 視蓋投影は、血管造影後処理ソフトウェアモジュールを使用しています。

5。 ^の Mn ^{2 +}オートメタログラフィー（TIMM染色）

1. MEMRI以下^の Mn ^{2 +}をトレース脳構造のTIMM染色のために、15〜150ナノモル^の Mn ^{2 +} ivit 24時間前画像への投与量を注入する。
2. MRスキャンした後、PBS中で30ミリリットルの氷冷0.325パーセントのNa ₂ S（pH7.4）で動物を灌流。凍結切片に網膜凍結サンプルを分析。
3. クライオトーム上で15μmの厚さの連続した​​、赤道部分をカット。
4. Angenstein ら ²²によると、固定剤および凍結保護がない状態でTIMM染色^21を実行します。

6。統計解析

事後分散分析に続いて、単一の比較のためのスチューデントのt検定を用いた統計分析を実行。データは平均±標準誤差として提示されている。個々のN番号は各実験ごとに個別に与えられた。 （; P≤0.01、**、P≤0.001、*** P≤0.05、*）0.05≤Pに達した結果は統計的に有意であると考えている。

結果

正確に視覚投影の活力と機能性を評価するために、このイメージング技術の能力は、硝子体とのRGCによるその取り込みに非毒性^の Mn ^{2 +}投与量の正確なアプリケーションに依存している。この主要な仮定は、層の特定^の Mn ^{2 +}取り込みがオートメタログラフィー（TIMM染色^）21によって実証されている図1にテストされています。網膜切片を対?...

ディスカッション

視覚系のMEMRIはナイーブおよび病理学的条件下での機能性を評価するための従来の神経生物学の手法を拡張します。離れて孤立した中枢神経系の線維トラクトの整合性にユニークな洞察を提供するから、MEMRIを簡単に視覚に指定されたパラダイムの即時の影響を調査するために、行動試験、 例えば 、検眼、視覚ベースの水作業を補充することができます。また、電気生理学的および...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI contrast reagent
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol	Jenapharm, Jena, Germany	PZN 3524531
Chloral hydrate	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	C8383	420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder			custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	6502	tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106346	for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
Gum arabic	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
Citric acid (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106448
Silver nitrate (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908