בהדמית vivo של יושרה סיבי עצב הראייה על ידי contrast-enhanced MRI בעכברים

Summary

סרטון זה מדגים שיטה, באמצעות סורק T קליני 3, לMR הדמיה משופר לעומת זאת, של ההשלכה החזותית העכבר הנאיבית ובמחקרי vivo חוזר על עצמו ואורך של ניוון עצב ראייה קשור עם פציעה למחוץ עצב ראייה חריפה וניוון עצב ראייה כרוני ב עכברים עקום החוצה (p50 ^KO).

Abstract

מערכת הראייה של המכרסמים כוללת תאי רשתית גנגליון והאקסונים שלהם היוצרים את עצב הראייה להיכנס למרכזי thalamic והמוח התיכונים, ותחזיות postsynaptic לקליפת המוח הראייתית. בהתבסס על המבנה שלה שונה אנטומיים ונגישות נוחה, זה הפך את המבנה המועדף ללימודים על הישרדות עצבית, התחדשות אקסון ופלסטיות הסינפטית. הפיתוחים אחרונים בתחום ההדמיה MR אפשרו להדמיה vivo של חלק retino-tectal של היטל זה באמצעות שיפור מנגן בתיווך ניגוד (ממר"י). כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממר"י להמחשה של ההשלכה החזותית בעכברים, שבו החלטות (200 מיקרומטר) ³ יכולות להיות מושגות באמצעות 3 סורקי טסלה משותפים. אנו מדגימים כיצד הזרקת זגוגית של מינון יחיד של 15 nmol MnCl ₂ מובילה לשיפור רווי של ההקרנה ללא פגע בתוך 24 שעות. עם יוצא מן הכלל של הרשתית, שינויים בעוצמת אות הם באופן עצמאישקע של גירוי חזותי בקנה אחד או הזדקנות פיזיולוגית. בנוסף, אנו ליישם את טכניקה לאורכים לפקח ניוון אקסון בתגובה לפציעת עצב ראייה חריפה, הפרדיגמה שבי Mn ^{2 +} תחבורת מעצרים לחלוטין באתר הנגע. לעומת זאת, תחבורה ⁺ פעילה Mn ² היא כמותית יחסי לקיומה, המספר, ופעילות חשמלית של סיבי האקסון. לניתוח מסוג זה, אנו מדגימים Mn ^{2 +} קינטיקה תחבורה בדרך החזותית במודל של עכברים הטרנסגניים (p50 NF-κB ^KO) בו מוצגות ניוון ספונטני של חושי, כולל חזותיות, תחזיות. בעכברים אלו, ממר"י מציין מופחת אך לא עיכב Mn ^{2 +} הובלה בהשוואה לעכברי סוג בר, ובכך חושפים את הסימנים של ליקויים מבניים ו / או תפקודיים על ידי מוטציות NF-κB.

לסיכום, ממר"י מגשר בנוחות במבחני vivo ולפרסם היסטולוגיה מורטם לcharacterizatiעל יושרה סיבי עצב והפעילות. זה שימושי מאוד עבור מחקרים ארוכי טווח על ניוון אקסון והתחדשות, וחקירות של עכברים שעברו מוטציה לפנוטיפים אמיתיים או מושרה.

Introduction

בהתבסס על מבנה נוירו אנטומיים החיובי שלה מערכת הראייה המכרסם מציעה אפשרויות ייחודיות כדי להעריך תרכובות תרופתי ויכולתם לתווך neuroprotection ¹ או השפעות פרו משובי ^2,3. יתר על כן, היא מאפשרת מחקרים על המאפיינים הפונקציונליים ונוירו האנטומי של מוטנטים עכבר, כפי שהודגם לאחרונה לעכברים חסרים את חלבון פיגומי presynaptic ⁴ בסון. יתר על כן, מגוון רחב של כלים משלימים מקנה נוסף שמציעה של תאים ברשתית גנגליון (RGC) ומספרי האקסון RGC, כמו גם פעילות RGC, למשל, על ידי electroretinography ובדיקות התנהגותיות, והנחישות של שחלופים בקליפת המוח על ידי הדמיה אופטית של אותות פנימיים. ההתפתחויות טכניות האחרונות במיקרוסקופ לייזר תאפשר בהדמיה באתרו של התחדשות RGC ידי דימות פלואורסצנטי רקמות העמוקה בדגימות הר שלמות של עצב ראייה (ON) ומוח. בhistolog זהגישת iCal, סליקת רקמת tetrahydrofuran מבוססת בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי גיליון האור מאפשרת רזולוציה של סיבים יחיד שמחדש להיכנס לON deafferented והדרכים אופטיות ^5. בעוד טכניקות כזה עשויות להיות מעולה ברזולוציה וקביעת דפוסי צמיחה, הם לא יאפשר לניתוחים חוזרים ואורכים של אירועי צמיחה בודדים, שבעיקר הם רצויים להעריך את התהליך של התחדשות לטווח ארוך.

MRI ניגודיות משופרת כבר מועסק להדמיה פולשנית המינימלית של הקרנת retino-tectal בעכברים ובחולדות ^6,7. זו יכולה להיות מושגת על ידי משלוח תוך עיני ישיר של יוני פאראמגנטיים (למשל, Mn ^{2 +)} לתאי רשתית. כאנלוגי סידן, Mn ^{2 +} הוא שולב somata RGC דרך ערוצי סידן תלוי מתח ומועברים באופן פעיל לאורך שלד תא אקסון של ON שלם ומערכת ראייה. בזמן שהוא מצטבר בגרעין המוחשל ההשלכה החזותית, כלומר הגרעין לרוחב הברכיתיים (LGN) וcolliculus מעולה (SC), התפשטות transsynaptic לקליפת הראייה העיקרית מופיעה זניחה ^8,9, למרות שהיא עשויה להתרחש ^10,11. תחת רצף MR, פאראמגנטיים Mn ^{2 +} מרחיב ניגוד MR בעיקר על ידי קיצור T ספין סריג זמן רגיעה ₁ ^12. כגון Mn ^{2 +} משופר MRI (ממר"י) כבר מיושם בהצלחה במחקרים שונים נוירו אנטומיות ותפקודיים של חולדות, כוללים ההערכה של התחדשות אקסון והתנוונות לאחר פציעת ON ^13,14, המיפוי האנטומי המדויק של ¹⁵ הקרנת retino-tectal , כמו גם קביעת מאפייני תחבורת אקסון לאחר טיפול תרופתי ^16. החידודים אחרונים במינון, רעיל, וקינטיקה של פרוטוקולי MRI עצביים Mn ² ספיגות והובלה ^+, כמו גם שיפור בהרחיבו את היישום שלה ללימודים במהונדסיםעכברים ⁹ באמצעות 3 סורקי טסלה בשימוש נפוץ בפרקטיקה קלינית ^17.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממר"י מתאים לאורכים בתחום ההדמיה vivo של הקרנת retino-tectal העכבר ומדגימים את תחולתה על ידי הערכת Mn ^{2 +} שיפור אות תלוי בתנאי ניוון מוחיים נאיביים ושונים. הפרוטוקול שלנו שם דגש ספציפי על רכישת נתונים MR בשדה מתון 3 T מגנטי שהוא בדרך כלל נגיש יותר מסורקי חיה ייעודיים. בעכברים נאיביים, אנו ממחישים כיצד עוצמת אות בדרכי ספציפיות יכולה להיות משמעותי וreproducibly להיות מוגבר לאחר הזגוגית (ivit) Mn ^{2 +} יישום. כמותית, Mn ^{2 +} התפשטות לאורך ההקרנה החזותית מתרחשת באופן עצמאי של התהליך הנורמלי ההזדקנות (נמדד בין עכברים בן 3 ו26 חודש) וההגדלה היא עקשן לגירוי ויזואלי והסתגלות לחשכה. לעומת זאת, Mn 2 + העשרה במרכזי thalamic והמוח התיכונים היא פחתה הבא חריף על פגיעה למחוץ ¹⁸ כמו גם בעכברים עקום החוצה nfkb1 (p50 ^KO) הסובל ממות RGC אפופטוטיים ספונטני ועל ניוון ^19. כך, בהרחבה לניתוח היסטולוגית קונבנציונלי, ניתוח ממר"י אורך של בעלי חיים בודדים מאפשר אפיון של קינטיקה הייחודית של תהליכי ניוון עצבי. זה צריך להיות שימושי עבור מחקרים על neuroprotection והתחדשות אקסון קשורים התערבויות תרופתיים או גנטיות.

Protocol

כל ההתערבויות בבעלי החיים בוצעו בהתאם לאמנה האירופית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בחי מעבדה והצהרת ארוו לשימוש בבעלים חיים ברפואת עיניים וחזון מחקר. כל הניסויים אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית. ההליך של פגיעה בעכברים מתואר במקומות אחרים ^9.

הזרקת 1. מנגן הזגוגית

1. בצע HR Mn ^{2 +} הזרקת 24 לפני MR לסרוק בעזרת עוזרו. להרדים את בעלי החיים על ידי זריקת intraperitoneal של פתרון 5% זקוקים לסם (420-450 מ"ג / קילוגרם משקל גוף בסטרילי PBS). להרדמה מקומית נוספת, להחיל טיפה אחת של conjuncain הנוזלי (0.4% hydrochloride oxybuprocaine) לקרנית לפני ניקור עיניים. להזריק 15 nmol Mn ^{2 +} לכל עין להכין פתרון ₂ מ"מ MnCl 7.5, למשל, על ידי דילול 1 ליטר של 1 פתרון ₂ מניות M MnCl ב132 LH _{2 <}/ Sub> O. טען 5 μl של הפתרון הסופי לתוך מזרק 5 μl המילטון מחובר למחט 34 G רכזת קטנה נשלפת (מחט RN).
2. כאשר מתחיל עם עין ימין, מקם את העכבר צדדי עזב תחת מיקרוסקופ משקפת ועדינות פתוחה ולתקן את עין ימין בין האגודל והאצבע של יד שמאל. להרים את המזרק עם יד הימין שלך ולאחוז במחט הקרובה לקצה. ללנקב atraumatic של הנורה העין, הכנס בזהירות את המחט לתוך הגוף הזגוגי בהיקף infero-זמני כ 1 מ"מ דיסטלי לימבוס, ובכך חוסכים כלי scleral.
3. בשלב בא, העוזר חל לאט הנפח הכולל של 2 μl תוך שליטה על הסולם של מזרק המילטון. במהלך הליך זה, לעקוב אחר מיקום מחט אופטימלי מתחת למיקרוסקופ ולמנוע ניקור של העדשה או שפיכה של הנוזל. שמור את המחט באופן סטטי מוכנסת ל30 שניות נוספות, ואז למשוך את זה לאט כדי למזער את הנוזלדליפה מאתר ההזרקה.
4. לאורך כל ההליך, יש לנקוט באמצעי זהירות מיוחדת כדי למנוע לחץ בעין. כמו כן, להימנע מניסיונות קשים או רבים כדי לנקב את הנורה העין. מאז Mn ² ספיגים לRGCs והובלה לאורך ON ⁺ כבר רווי ב15 nmol MnCl _2, זה ממזער וריאציות אות על ידי כרכי הזרקה מעט לא מדויקים. להגברת אות דו צדדית של ההשלכה החזותית, לחזור על הליך ההזרקה לעין השמאל.
5. החל המכיל ofloxacin (3 מ"ג / מיליליטר) טיפות עיניים ומשחה המכיל פנטנול פעם אחת לאחר ההליך כדי למנוע זיהומים וייבוש של העין עיניות. להחזיר את העכברים לכלובים שלהם בתנאי דיור רגילים עד לתחילת סריקת MR.

2. הכנת בעלי החיים לבדיקת MRI

1. להרדים את העכבר על ידי ממשל של תערובת גז isoflurane / חמצן 2% / 98%. הר את העכבר על בעל עכבר בעמדה כמעט אופקית, untwisted. InsERT אותו לסליל MR, אשר לאחר מכן מותאם בתוך סורק MRI. לפקח על נשימה וקצב לב על ידי מערכות מתאימות. לפרטים טכניים, ראה הרמן ואח' ^20.
2. במהלך בדיקת MRI, הרדמה אספקה ​​על ידי ניפוח מתמשך של תחילה 1.5% / 98.5% תערובת גז isoflurane / חמצן באמצעות מאייד מחובר למחזיק ראש העכבר על ידי צינור משולב. במהלך הסריקה, להתאים את העומק של הרדמה על פי הפרמטרים החיוניים שנרשמו (כלומר לכוון לקצב נשימה יציב של כ -40 נשימות לדקה). שימוש במכשיר חימום לשמור על טמפרטורת פני השטח הגוף היציבה בין 35 ו37 מעלות צלזיוס, כפי שהיא נמדדת על ידי חיישן תרמי מוצב באתר הבטן של העכבר. לפרטים טכניים, ראה הרמן ואח' ^17.
3. לאחר הסריקה, לשחרר את העכבר מהבעל ולספק לך חמצן טהור כדי להאיץ את ההתאוששות מן ההרדמה. בנוסף, לשמור על טמפרטורת הגוף יציב על ידי שימושמקור חימום אור אדום.

3. MRI פרוטוקול

1. פרוטוקול תוקף לסורק טסלה 3 מצוידים בסליל ייעודי, יחס אות לרעש יעיל, קטן בבעלי חיים (סליל יץ מקוטב ליניארי) בתחום יעיל מבט של 35 מ"מ × 38 קוטר מ"מ. להפעיל את הסליל במצב שידור-מקבל.
2. עם בעלי החיים במצב הסופי שלו, להתאים את המנגינה והתאמה של הסליל בעזרת מנתח תדר. באופן ידני להתאים את מתח ייחוס משדר וזרמי הפחית כדי לייעל את ההומוגניות תמונה ואיכות.
3. רכישת T ₁ תמונות 2D TSE משוקללות עם רזולוציה של 0.5 מ"מ × 0.5 מ"מ × 2 מ"מ בתצוגת sagittal ורוחבי לתכנון. שימוש בסריקות MR מתכננת, לרכוש את תמונות MEMR בכיוון מדידת העטרה, לסובב כדי להיות מקביל לראש של החיה עם קידוד שלב לאורך הכיוון של השמאל וימין. כדי למזער את זמן רכישה, להשתמש בשדה מלבני של תצוגה מותאמת לממדי ראש בפועל. מעסיק רצף מפונק FLASH 3D (VIBE 3D) באמצעות הפרמטרים הבאים: מטריצת בסיס 256, שדה הראייה 54 מ"מ × 50.65 מ"מ × 14.08 מ"מ, באמצעות 93.8% שדה מלבני של נוף בכיוון לקודד שלב, ו128 פרוסות 0.11 מ"מ עובי פרוס עם רזולוציה הפרוסה מוגדר 61%.
4. הפעל את אינטרפולציה במטוס כדי ליצור תמונות סופיות עם 512 × 480 × 128, מתן ברזולוציה אפקטיבית של 0.21 מ"מ × 0.21 מ"מ × 0.18 מ"מ (0.1 מ"מ × 0.1 מ"מ × 0.09 מ"מ אינטרפולציה), זמן הד T _E = 6.51 אלפיות שנייה, _R T זמן החזרה = 16 אלפיות = זווית, רוחב פס 160 הרץ / px, להעיף = 22 °. תחול שני ממוצעים ושלוש חזרות כדי להשיג זמן רכישה כולל (T) של כ 30 דקות.

4. MRI ניתוח נתונים

1. לנתח את הנתונים באמצעות fastView syngo תוכנה. להגברת אות כמותיים, בחר אזורים מוגדרים oעניין F בהקלטות MRI מישוריים 2D ולקבוע עוצמות אות (SI) של המבנה המשופר (SI _ממר"י), רקע רקמה _(backgr SI), וסטיית התקן של הרעש _(N-SD). במידת צורך, השתמש באטלס מוח עכבר כדי להקל על התמצאות נוירו אנטומי לLGN ומבני SC. לחשב את יחס ניגודיות לרעש (CNR) באמצעות הנוסחה:
2. CNR = (SI _ממר"י - _backgr SI) / SD _N
3. לכמת שלוש תמונות רצופות לחישוב CNR ממוצע עבור כל דגימה. בחיות שהוחדרו בילטרלי, לנתח כל חצי הכדור באופן עצמאי.
4. לתיאור של תמונות אופקיים, העטרה ועל sagittal, לחשב שחזורי multiplanar מערכת נתוני 3D MRI המקורית. עיבוד תמונות אלה אינן מומלצים לניתוח כמוני. כדי ליצור שחזורי אנימציה 3D (תחזיות בעוצמה מקסימלית, MIPS) של retino-Tectal הקרנה, להשתמש במודול תוכנה שלאחר עיבוד אנגיוגרפיה.

5. Mn ^{2 +} Autometallography (TIMM מכתים)

1. עבור מכתים TIMM של ² מבנים במוח ⁺ לייחס Mn הבא ממר"י, להזריק מינון של 15-150 nmol Mn ^{2 +} ivit 24 שעות לפני הדמיה.
2. לאחר MR סריקה, ינקב חיות עם 30 מיליליטר 0.325% קרים כקרח S Na ₂ ב PBS (pH 7.4). לנתח רשתיות ודגימות הקפאה בסעיף קפוא.
3. לחתוך קטעים רציפים, קו המשווה של 15 עובי מיקרומטר על cryotome.
4. לבצע מכתים TIMM ²¹ בהעדר מקבע וcryoprotection פי Angenstein et ²² אל.

6. ניתוח סטטיסטי

ביצוע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות מבחן t של הסטודנט להשוואות אחד, ואחריו post hoc ANOVA. הנתונים מוצגים כשגיאה ממוצעת ± סטנדרטי. מספרי N בודדיםניתנו בנפרד לכל ניסוי. תוצאות להגיע P ≤ 0.05 נחשבות משמעותיות מבחינה סטטיסטית (P ≤ 0.05, *, P ≤ 0.01, **, P ≤ 0.001, ***).

תוצאות

היכולת של טכניקת הדמיה זה להעריך את החיוניות ואת הפונקציונליות של ההשלכה החזותית מדויק מסתמכת על יישום מדויק של Mn ^{2 +} במינון רעיל לגוף הזגוגי וספיגתו על ידי RGCs. הנחה גדולה זה נבדק בתרשים 1, שבו Mn ^{2 +} ספיגה ספציפית שכבה מודגמת על ידי autometallography (מכתים TIM...

Discussion

ממר"י של מערכת הראייה משתרע טכניקות הנוירוביולוגי קונבנציונליות להערכה פונקציונליות בתנאים נאיביים ופתולוגיים. מלבד לספק תובנה ייחודית על היושרה של מערכת סיבים של מערכת העצבים המרכזית מבודדת, ממר"י ניתן להשלים בקלות עם בדיקות התנהגותיות, למשל, אופטומטרי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI contrast reagent
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol	Jenapharm, Jena, Germany	PZN 3524531
Chloral hydrate	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	C8383	420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder			custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	6502	tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106346	for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
Gum arabic	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
Citric acid (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106448
Silver nitrate (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908