Dans l'imagerie in vivo de Optic Nerve Fiber intégrité par IRM de contraste amélioré chez la souris

Résumé

Cette vidéo illustre un procédé, en utilisant un T scanner clinique 3, pour l'imagerie RM de renforcement du contraste de la projection visuelle de la souris naïve et pour des études répétitives et longitudinaux in vivo de la dégénérescence du nerf optique associés à une lésion du nerf optique à l'écrasement aiguë et de la dégénérescence du nerf optique chronique dans souris knock-out ^(KO p50).

Résumé

Le système visuel de rongeur englobe les cellules ganglionnaires de la rétine et de leurs axones qui forment le nerf optique pour entrer centres thalamiques et du mésencéphale et projections post-synaptiques dans le cortex visuel. Sur la base de sa structure anatomique distinct et l'accessibilité pratique, il est devenu la structure privilégiée pour les études sur la survie neuronale, la régénération axonale et la plasticité synaptique. Les récents progrès dans l'IRM ont permis la visualisation in vivo de la partie rétino-tectale de cette projection à l'aide de manganèse médiation amélioration du contraste (MEMRI). Ici, nous présentons un protocole MEMRI pour illustration de la projection visuelle chez la souris, que les résolutions de (200 um) ³ peuvent être obtenus en utilisant communes à 3 Tesla. Nous montrons comment l'injection intravitréenne d'une dose unique de 15 nmol _MnCI2 conduit à une amélioration saturé de la projection intact dans les 24 heures. A l'exception de la rétine, des changements dans l'intensité du signal sont indédent de la stimulation visuelle coïncidé ou vieillissement physiologique. Nous appliquons en outre cette technique pour suivre longitudinalement dégénérescence axonale suite à une lésion du nerf optique aiguë, un paradigme qui Mn ^{2 +} transport complètement arrestations sur le site de la lésion. Inversement, Mn ^{2 +} transport actif est quantitativement proportionnelle à la viabilité, le nombre et l'activité électrique des fibres axonales. Pour cette analyse, nous illustrons Mn ^{2 +} cinétique de transport le long du trajet optique dans un modèle de souris transgénique (NF-kB p50 ^KO) l'affichage de l'atrophie spontanée sensorielle, notamment visuelle, des projections. Chez ces souris, MEMRI indique réduite mais non retardé Mn ^{2 +} transport par rapport aux souris de type sauvage, révélant ainsi des signes de dégradations structurales et / ou fonctionnelles des mutations par NF-kB.

En résumé, MEMRI comble bien des essais in vivo et post mortem histologie pour la characterizatisur l'intégrité et l'activité des fibres nerveuses. Il est très utile pour les études longitudinales sur la dégénérescence et la régénération axonale, et les enquêtes de souris mutantes pour phénotypes authentiques ou inductibles.

Introduction

Sur la base de sa structure neuro-anatomique favorable du système visuel rongeur offre des possibilités uniques pour évaluer les composés pharmacologiques et leur capacité à servir de médiateur neuroprotection ¹ ou effets pro-régénératives ^2,3. En outre, il permet des études sur les caractéristiques fonctionnelles et neuro-anatomique de mutants de souris, comme l'a récemment illustré pour les souris dépourvues de la protéine d'échafaudage présynaptique Basson ^4. En outre, un large éventail d'outils complémentaires offre supplémentaire comportant des cellules rétiniennes ganglionnaires (GRC) et le nombre d'axones RGC ainsi que l'activité RGC, par exemple, par électrorétinographie et des tests de comportement, et la détermination des réarrangements corticales par imagerie optique des signaux intrinsèques. Les derniers développements techniques de microscopie laser permettent la visualisation in situ de RGC régénération de tissu profond imagerie de fluorescence dans des spécimens entiers de montage de nerf optique (ON) et le cerveau. Dans ce histologapproche ical, tétrahydrofuranne base compensation des tissus en combinaison avec la lumière microscopie à fluorescence de la feuille permet la résolution des fibres simples qui ré-entrer dans le ON déafférenté et des voies optiques ^5. Bien que de telles techniques pourrait être supérieure à la résolution et la détermination de profils de croissance, ils ne permettent pas d'analyses répétitives et longitudinaux des événements de croissance individuels, qui sont particulièrement souhaités pour évaluer le processus de régénération à long terme.

Contraste l'IRM a été utilisée pour la visualisation invasive de la projection rétino-tectale chez la souris et le rat ^6,7. Ceci peut être réalisé par dépôt intra-oculaire directe des ions paramagnétiques (par exemple, Mn ^{2 +)} à des cellules de la rétine. Comme un analogue de calcium, Mn ^{2 +} est incorporé dans RGC soma via des canaux calciques voltage-dépendants et transporté activement le long du cytosquelette axonal de l'ON intacte et des voies optiques. Bien qu'il s'accumule dans les noyaux du cerveaude la projection visuelle, c'est à dire le corps genouillé latéral (CGL) et colliculus supérieur (SC), propagation transsynaptique dans le cortex visuel primaire semble négligeable ^8,9, mais il peut se produire ^10,11. Sous séquençage MR, paramagnétique Mn ^{2 +} augmente M. contraste principalement en raccourcissant T ₁ spin-réseau temps de relaxation ^12. Cette Mn ^{2 +} amélioré IRM (MEMRI) a été appliquée avec succès dans diverses études neuro-anatomiques et fonctionnelles des rats, y compris l'évaluation de la régénération axonale et la dégénérescence après ON blessures ^13,14, la cartographie anatomique précise de la projection ¹⁵ rétino-tectale , ainsi que la détermination des caractéristiques de transport axonal après le traitement pharmacologique ^16. Améliorations récentes dans les doses, la toxicité, et la cinétique des protocoles IRM neuronales Mn ^{2 +} absorption et le transport, ainsi que l'amélioration ont étendu son application à des études sur transgénique⁹ souris en utilisant 3 Tesla, couramment utilisés dans la pratique clinique ^17.

Ici, nous présentons un protocole approprié pour MEMRI longitudinal imagerie in vivo de la projection rétino-tectale souris et illustrons son applicabilité en évaluant Mn ^{2 +} amélioration du signal dépend des conditions de neurodégénérescence naïfs et divers. Notre protocole met l'accent spécifique sur l'acquisition de données MR dans un champ magnétique modéré 3 T qui est généralement plus accessibles que les scanners pour animaux dédiés. Chez les souris naïves, nous illustrons comment intensité de signal spécifique à l'appareil peut être sensiblement et de façon reproductible devenir augmenté après intravitréenne (ivit) Mn ^{2 +} application. Quantitativement, Mn ^{2 +} propagation le long de la projection visuelle se produit indépendamment du processus normal de vieillissement (mesurée entre les souris de 3 et 26 mois) et l'augmentation est réfractaire à une stimulation visuelle et de l'adaptation à l'obscurité. En revanche, Mn 2 + enrichissement dans les centres thalamiques et du mésencéphale est diminuée suivant aiguë ON écrasement blessures ¹⁸ ainsi que dans les souris knock-out NFKB1 (p50 ^KO) souffre de la mort spontanée RGC apoptotique et sur ​​la dégénérescence ^19. Ainsi, l'expansion à l'analyse histologique conventionnelle, analyse MEMRI longitudinal de chaque animal permet le profilage de la cinétique uniques de processus neurodégénératifs. Cela devrait s'avérer utile pour des études sur la neuroprotection et la régénération axonale associés aux interventions pharmacologiques ou génétiques.

Protocole

Toutes les interventions sur les animaux sont effectuées en conformité avec la Convention européenne pour la protection des animaux et l'utilisation des animaux de laboratoire et de la Déclaration ARVO pour l'utilisation d'animaux dans ophtalmique et Vision Research. Toutes les expériences sont approuvés par le comité d'éthique local. La procédure de ON blessures chez les souris est décrit ailleurs ^9.

Une. Injection intravitréenne de manganèse

1. Effectuer le Mn ^{2 +} injection 24 heures avant le MR scanner à l'aide d'un assistant. Anesthésier les animaux par injection intrapéritonéale d'une solution d'hydrate de chloral à 5% (420 à 450 mg / kg de poids corporel dans du PBS stérile). Pour une anesthésie topique supplémentaire, appliquer une goutte de liquide conjuncain (0,4% de chlorhydrate de oxybuprocaïne) de la cornée avant ponction œil. Pour injecter 15 nmol Mn ^{2 +} par oeil préparer une mM MnCl solution 7,5 _2, par exemple, en diluant 1 L de 1 M _MnCI2 solution stock dans 132 LH _{2 <}/ Sub> O. Charge 5 ul de la solution finale dans une seringue de Hamilton de 5 ul relié à un petit moyeu amovible aiguille 34 G (aiguille RN).
2. Lors du démarrage de l'œil droit, placez la souris du côté gauche sous un microscope binoculaire et ouvrez-le délicatement et fixer l'œil droit entre le pouce et l'index de votre main gauche. Prenez la seringue avec votre main droite et s'emparer de l'aiguille près de la pointe. Pour ponction atraumatique de l'ampoule d'oeil, insérer délicatement l'aiguille dans le corps vitré à la circonférence de inféro-temporal environ 1 mm distale du limbe, épargnant ainsi les navires scléral.
3. Ensuite, l'assistant applique lentement le volume total de 2 pi tout en contrôlant l'échelle de la seringue Hamilton. Au cours de cette procédure, surveiller le placement optimal de l'aiguille sous le microscope et d'éviter la perforation de la lentille ou de déversement du liquide. Gardez l'aiguille insérée statiquement pour un supplément de 30 secondes, puis retirer lentement pour minimiser liquidedes fuites provenant du site d'injection.
4. Tout au long de la procédure, une attention particulière doit être prise pour éviter la pression de l'œil. De même, éviter les tentatives difficiles ou nombreuses à percer l'ampoule d'oeil. Depuis Mn ^{2 +} absorption dans les CGR et le transport le long de la ON est déjà saturé à 15 nmol _MnCI2, ce qui minimise les variations de signal par des volumes d'injection légèrement imprécises. Pour le signal amélioration bilatérale de la projection visuelle, répétez la procédure d'injection pour l'oeil gauche.
5. Appliquer ofloxacine contenant (3 mg / ml) collyre et pommade contenant du panthénol-fois après la procédure de prévenir les infections oculaires et le séchage de l'œil. Remettre les souris dans leurs cages, dans des conditions normales de logement jusqu'à ce que le début de l'examen IRM.

2. Préparation des animaux pour l'IRM

1. Anesthésier les souris par administration d'un mélange à 2% / 98% d'isoflurane gaz / oxygène. Montez la souris sur un support de la souris dans une position presque horizontale sans torsion. Insert-la dans la bobine de MR, qui est ensuite ajustée à l'intérieur de l'appareil d'IRM. Surveillance de la respiration et du rythme cardiaque par des systèmes appropriés. Pour plus de détails techniques, voir Herrmann et al ^20.
2. Au cours de l'IRM, l'anesthésie par insufflation d'alimentation en continu d'un mélange gazeux initialement 1,5% / 98,5% d'isoflurane / oxygène par l'intermédiaire d'un évaporateur relié au support de la tête de la souris par un tube intégré. Lors de l'analyse, ajuster la profondeur de l'anesthésie en fonction des paramètres vitaux enregistrés (c. viser un taux de respiration stable d'environ 40 respirations par minute). L'utilisation d'un dispositif de chauffage à maintenir la température de surface du corps stable entre 35 et 37 ° C, telle que mesurée par un capteur thermique placé à l'emplacement de l'abdomen de la souris. Pour plus de détails techniques, voir Herrmann et al ^17.
3. Après le scan, libérer la souris de son support et fournir de l'oxygène pur à accélérer la reprise de l'anesthésie. En outre, maintenir la température corporelle stable en utilisantune source de chauffage de la lumière rouge.

3. Protocole IRM

1. Le protocole est validé pour une Tesla scanner 3 équipé d'une bobine dédié, SNR efficace petit animal (bobine Litz polarisée linéairement) avec un champ de vue effectif de 35 mm × 38 mm de diamètre. Actionner la bobine en mode d'émission-réception.
2. Avec l'animal dans sa position finale, ajuster la mise au point et la partie de la bobine à l'aide d'un analyseur de fréquence. Ajuster manuellement la tension de référence de l'émetteur et les courants cales afin d'optimiser l'image homogénéité et la qualité.
3. Acquérir T ₁ pondérés images 2D EST avec une résolution de 0,5 mm x 0,5 mm x 2 mm en vue sagittale et transversale de la planification. Utilisation des examens IRM de planification, d'acquérir les images MEMR en direction de mesure coronale, tourné pour être parallèle à la tête de l'animal avec codage de phase dans le sens gauche-droite. Pour réduire le temps d'acquisition, utiliser un champ rectangulaire de vue adaptée à laDimensions de la tête réels. Employer une séquence FLASH 3D gâté (VIBE 3D) en utilisant les paramètres suivants: la matrice de base 256, champ de vision 54 mm x 50.65 mm x 14.08 mm, utilisant un champ rectangulaire de 93,8% de vue en direction de codage de phase, et 128 tranches de 0,11 mm l'épaisseur de la tranche à la résolution de la tranche fixée à 61%.
4. Activer l'interpolation dans le plan pour créer des images finales avec 512 × 480 × 128, offrant une résolution effective de 0,21 mm x 0,21 mm x 0,18 mm (0,1 mm x 0,1 mm x 0,09 mm interpolés), temps d'écho T _E = 6,51 ms, temps de répétition T _R = 16 ms, bande passante = 160 Hz / px, angle de bascule = 22 °. Appliquer deux moyennes et trois répétitions pour obtenir un temps d'acquisition total (T _A) d'environ 30 min.

4. Analyse des données IRM

1. Analyser les données en utilisant le FastView syngo logiciel. Pour l'amélioration quantitative de signal, sélectionnez régions définies ointérêt de f en 2D planaires enregistrements IRM et déterminer l'intensité du signal (SI) de la structure renforcée (SI _MEMRI), fond de tissu (SI _backgr), et l'écart type du bruit (SD _N). Si nécessaire, utiliser un cerveau de souris atlas pour faciliter l'orientation de neuro-anatomique pour LGN et les structures de SC. Calculer le rapport contraste sur bruit (CNR) selon la formule suivante:
2. CNR = (SI _MEMRI - SI _backgr) / SD _N
3. Quantifier trois images consécutives pour le calcul CNR moyenne pour chaque échantillon. Chez les animaux injectés bilatéralement, analyser chaque hémisphère indépendamment.
4. Pour la représentation des images horizontales, frontal et sagittal, calculer reconstructions multiplanaires de l'ensemble original de données IRM 3D. Ces images traitées ne sont pas recommandés pour l'analyse quantitative. Pour créer des reconstructions 3D animés (projections d'intensité maximale, PMI) de la rétinopathie-Tectale projection, utiliser un module logiciel de post-traitement angiographie.

5. Mn ^{2 +} Autometallography (TIMM coloration)

1. Pour TIMM coloration de Mn ² structures cérébrales ⁺ tracées suivant MEMRI, injecter une dose de 15-150 nmol Mn ^{2 +} ivit 24 heures avant l'imagerie.
2. Après numérisation du MR, perfuser les animaux avec 30 ml glacée 0,325% de Na ₂ S dans du PBS (pH 7,4). Disséquer la rétine et des échantillons de gel dans la section congelés.
3. Couper, sections équatoriales séquentielles de 15 um d'épaisseur sur une cryotome.
4. Effectuer TIMM coloration ²¹ en l'absence de fixateur et de cryoprotection selon Angenstein ²² et al.

6. Analyse statistique

Effectuer des analyses statistiques en utilisant le test t de Student pour les comparaisons simples, suivie par la poste ANOVA hoc. Les données sont présentées comme moyenne ± erreur-type. Des numéros individuels N sontséparément pour chaque expérience. Résultats atteignant P ≤ 0,05 sont considérées comme statistiquement significatives (P ≤ 0,05, *, P ≤ 0,01, **, P ≤ 0,001, ***).

Résultats

La capacité de cette technique d'imagerie afin d'évaluer avec précision la vitalité et la fonctionnalité de la projection visuelle repose sur une application précise de Mn ^{2 +} posologie non toxique pour le corps vitré et son absorption par les CGR. Cette hypothèse majeure est testée à la figure 1, où la couche spécifique Mn ^{2 +} absorption est démontrée par autometallography (TIMM coloration) ^21. Sections de la rétine ont été analysées à 24 heur...

Discussion

MEMRI du système visuel s'étend techniques classiques neurobiologiques pour évaluer la fonctionnalité dans des conditions pathologiques et naïfs. En plus de fournir un aperçu unique de l'intégrité d'un isolé CNS faisceau de fibres, MEMRI peut être facilement complétée par des tests de comportement, par exemple, l'optométrie et des tâches à base d'eau visuellement, pour enquêter sur les conséquences immédiates d'un paradigme donné pour la perception visuelle. Il relie ?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Manganese (II) chloride solution 1 M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI contrast reagent
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol	Jenapharm, Jena, Germany	PZN 3524531
Chloral hydrate	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	C8383	420-450 mg/kg body weight
Hamilton syringe	Hamilton Company, Reno, NV, USA	7634-01	SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	removable needle RN, 34 G, length 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000	Zeiss, Oberkochen, Germany
3 T MRI scanner Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder			custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50	Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany	6502	tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4·H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106346	for sulfide perfusion
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S·9H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
Gum arabic	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
Citric acid (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7·2H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106448
Silver nitrate (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908