رسم الخرائط على أساس فؤاد للخصائص مطاطا جدران الخلايا: في الأنسجة، الخلوية، وقرارات التحت خلوية

Summary

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Abstract

نحن تصف طريقة تم تطويرها مؤخرا لقياس الخواص الميكانيكية للأسطح الأنسجة النباتية باستخدام القوة الذرية المجهري (AFM) الصغيرة / نانو المسافات البادئة، لJPK فؤاد. على وجه التحديد، في هذا البروتوكول نقيس معامل يونغ واضحة من جدران الخلايا في قرارات التحت خلوية عبر المناطق تصل إلى 100 ​​× 100 ميكرومتر ميكرومتر في الخلايا الإنشائية الأزهار، hypocotyls، والجذور. هذا يتطلب إعدادا دقيقا من العينة، واختيار الصحيح من indenters الصغيرة وأعماق المسافة البادئة. لحساب خصائص جدار الخلية فقط، يتم تنفيذ القياسات في حلول مركزة للغاية من مانيتول ليحل الجبلة الخلايا، وبالتالي إزالة مساهمة ضغط تورم الخلية.

وعلى النقيض من تقنيات موجودة الأخرى، وذلك باستخدام indenters مختلفة وأعماق المسافة البادئة، وهذه الطريقة تسمح قياسات متعددة النطاقات في وقت واحد، ومع ذلك، لا تزال هناك العديد من القيود: لا يمكن إلا أن طريقة استخدامها على عينات صغيرة نسبيا (حوالي 100 ميكرون في القطر) وفقط على الأنسجة الخارجية؛ طريقة حساسة للتضاريس الأنسجة؛ فهو يقيس جوانب معينة فقط من الخواص الميكانيكية المعقدة الأنسجة و. ويجري تطوير هذه التقنية بسرعة وأنه من المرجح أن معظم هذه القيود سيتم حلها في المستقبل القريب.

Introduction

ويتحقق النمو في النباتات عن طريق التوسع المنسق لجدران الخلايا الجامدة التي تحيط كل خلية من خلايا الكائن الحي. تراكم الأدلة تشير إلى أنه من خلال تعديل الكيمياء جدار الخلية أن النباتات السيطرة محليا هذا التوسع. ويعتقد أن توسع لتكون مدفوعة أساسا عن طريق الضغط على جدران الخلايا، والناجمة عن ارتفاع ضغط تورم الخلية؛ ويخضع هذا الرد سلالة لضغوط تورم من قبل الخواص الميكانيكية للجدران الخلايا ^1. لا يعرف الا القليل من هذه الخصائص الميكانيكية وكيف تتغير خلال التنمية. وعلاوة على ذلك والقليل المعروف عن كيفية التحكم في هذه الخصائص الميكانيكية وعما إذا كانت الاصداء يسهم في تغيير كيمياء جدار الخلية بطريقة ما يبدو أن يتم تنسيق عبر الأنسجة. إذا أردنا أن نفهم العلاقة بين التغيرات الكيميائية والميكانيكية في جدران الخلايا النباتية خلال التنمية، وفي نهاية المطاف كيف تحكم هذه التفاعلات المجهرية مصنعمطلوب النمو 'ق العيانية، وهو الأسلوب الذي يمكن رصد الخصائص الميكانيكية للجدران الخلايا في تطوير الأجهزة على المستوى الخلوي أو الأنسجة.

أسلوب القوة الذرية المجهري (فؤاد) وصفها هنا، والتي تقوم على ميكرومتر أو نانومتر الضغط على الأنسجة أو المسافات البادئة، وقد وضعت على وجه التحديد لقياس الخواص الميكانيكية للجدران الخلايا في تطوير أجهزة في وقت واحد في قرارات التحت خلوية وعبر مناطق بأكملها من الأنسجة. أساليب أخرى إما قرارا منخفضة جدا أو مرتفعة جدا: على التمدد هو فقط قادرة على قياس متوسط ​​الخواص الميكانيكية للأنسجة كلها في نطاق ملليمتر ^2-4، وهو النطاق الذي هو على سبيل المثال كبيرة جدا لقياس الأحداث في وقت مبكر من توالد؛ وmicroindenter يمكن أخذ القياسات في قرار التحت خلوية على مقياس متناهي الصغر، لكنه يقتصر على قياس خلايا معزولة وليس مجموعات من الخلايا أو الأجهزة ^5-7. مع فؤاد، وتتطلبد الأنسجة الخلوية، وقرارات التحت خلوية ويمكن تحقيق ^8-10. في الآونة الأخيرة تم تطوير العديد من البروتوكولات خصيصا لقياس اليات الأنسجة النباتات التي يمكن أن تستخدم أيضا ^{11 و 12.}

سنستعرض هنا كيفية تقييم مرونة الأنسجة من خلال قياس معامل الظاهر يونغ ^13.

يتم استخدام معامل يونغ عادة لوصف صلابة من المواد. خلال تشويه صغيرة القوة المطلوبة لتشوه مادة يتناسب مع مجال المسافة البادئة. معامل يونج هو هذا معامل. في حالة وجود مواد متجانسة المستمر سيتم قياس معامل نفسه بغض النظر عن نوع المسافة البادئة (الحجم والشكل) ولكن سوف يتغير مع سرعة القياس. في حالة من بنية معقدة من أنسجة النباتات، وقد لاحظنا حتى الآن أن القوة تتناسب مع تشوه السماح تحديدمعامل التناسب أننا اسم "معامل الشباب على ما يبدو". في المقابل من وسائط الإعلام المستمر في النباتات، وهذا واضح معامل الشباب حساس لحجم المسافة البادئة. أنها لا تتوافق مع معاملات الرجوعية الشباب من جدار الخلية نقية. فهو يصف أفضل مرونة من السقالات من خلايا جدار الأنسجة.

Protocol

1. إعداد الشرائح الزجاجية لتركيب عينة

1. إعداد الطمر وسائل الإعلام الاغاروز: 0.7٪ انخفاض ذوبان الاغاروز في 10٪ مانيتول (في الماء).
2. باستخدام أداة معدنية قوية (مثل الحفر طرف، والجير)، حفر خارج المنطقة 0.5 سم × 0.5 في وسط شريحة زجاجية مجهرية. أو بدلا من ذلك، الغراء قطعة صغيرة من الزجاج لاميلا (حوالي 20 × 200 ميكرون) إلى شريحة زجاجية باستخدام الغراء Araldite. ملاحظة: هذا roughens السطح من أجل تسهيل التصاق الاغاروز لضمان أن العصي وسائل الإعلام الاغاروز أو الإصلاحات إلى الشريحة. يمكن إعادة استخدامها هذه الشريحة.
3. وضع قطرات من حوالي 20 ميكرولتر من وسائل الإعلام الطمر الاغاروز على المنطقة محفورا من شريحة زجاجية. وهذا يعطي طبقة رقيقة من الاغاروز.
4. تخزين شريحة زجاجية في مربع الرطبة وانتظر الإعلام لترسيخ الاغاروز.

2. تشريح وتركيب عينات النسيج الإنشائي

1. Microdissect الخلايا الإنشائية لimagi متحد البؤرنانوغرام: إزالة البراعم الزهرية واحدا تلو الآخر من جذع عن طريق سحب عليهم مع ملاقط غرامة فائقة. فمن المهم لإزالة جميع البراعم الزهرية حتى البراعم التي لا تظهر كأسية (أي براعم P1 ^14).
2. باستخدام شفرة حلاقة أو غيض من ملاقط، وقطع النسيج الإنشائي بعيدا عن الجذع. وينبغي أن يكون خفض مواز للمنطقة من سطح النسيج الإنشائي الذي سيتم قياس مع فؤاد. وينبغي أن تكون قمة حصل بين 300 ميكرون و 600 ميكرون عالية لتناسب تحت غيض فؤاد.
3. دفع قمة في الفيلم من وسائل الإعلام الاغاروز أعدت في الخطوة 1.1.4. اختيار الموقف على شريحة زجاجية / الاغاروز ودفع مثل هذه بلطف أن النسيج الإنشائي على حد سواء على اتصال مباشر مع شريحة زجاجية ويبرز الخروج من الاغاروز. فمن الأهمية بمكان لوضع النسيج الإنشائي في الاغاروز في غضون بضع ثوان التي تتبع خفض من الجذع. ملاحظة: هذا هو من أجل منع النسيج الإنشائي من التجفيف. في هذه المرحلة، سيتم النسيج الإنشائي واقفا في CRACك لأن الاغاروز بكسر على تطبيق الضغط.
4. إعداد العديد من الخلايا الإنشائية لهذا الطريق لدفعة التصوير، وتوفير أنهم من نفس الارتفاع ويتم وضع أقل من 500 ميكرون من بعضها البعض على الشريحة. الحفاظ على الخلايا الإنشائية أعدت في مربع الرطبة بينما تشريح عينات أخرى.
   ملاحظة: إنه يحد من الاختلاف يأتي من المعايرة. من الناحية المثالية 2 عينات من كل شرط يمكن إعداد وقياس عشوائيا. حتى الآن ليس هناك أي تأثير لوحظ من التصوير دفعة على القياس (الاجهاد الناجم الاستجابة). هذا يمكن أن يكون ذلك بفضل التخفيف من الإجهاد يشير الجزيئات في أجار و / أو الحل في تصاعد مستمر. بدلا من الاستجابة للضغط النفسي هو نفسه بغض النظر عن كمية من العينة مستعدة.
5. قبل الانتقال إلى الخطوة التالية، تأكد من أن الحدود بين النسيج الإنشائي وبراعم الأزهار جافة. إن لم يكن، وإزالة الماء الزائد بلطف باستخدام ورق الترشيح. هذا ينبغي أن يمنع في المرحلة المقبلة أن ذابتالاغاروز الفيضانات العينة بسبب القوى الشعرية.
6. مع ماصة 20 ميكرولتر، إضافة ما يكفي من ذاب تصاعد الاغاروز لملء في صدع إنشاؤها في الخطوة 1.2.3. وتحيط بكل النسيج الإنشائي. الاغاروز ينبغي أن تصل إلى مستوى ندبة من برعم زهرة إزالتها (منشم). لتحقيق هذا، قد يكون من الضروري إضافة الاغاروز في نهاية كل من الكراك.
7. عند إضافة الاغاروز، وسوف تغرق بسرعة في صدع؛ باستخدام ماصة، تمتص قبالة جزء من ذاب تصاعد الاغاروز لضمان أن النسيج الإنشائي هو أعلى نقطة على الشريحة. هذا على إصلاح النسيج الإنشائي بحيث لا يمكن أن تتحرك خلال التصوير.

3. تركيب الجذر أو عينات التحتفلقي

1. لجذور وhypocotyls، لا تشريح ضروري. في الفيلم رقيقة من الاغاروز على شريحة زجاجية استعداد، وجعل أخدود إما مباشرة فوق لحفر في الزجاج أو على طول الصفيحة الزجاجية. ضع الجذر أو التحتفلقي في هذا الأخدود ضمان أنه في اتصال معالزجاج على طوله كله.
2. قبل الانتقال إلى الخطوة التالية، تأكد من أن العينة الجافة في سطحه. إن لم يكن، وإزالة بلطف وفائض من المياه باستخدام ورق الترشيح.
3. إضافة ذاب تصاعد الاغاروز حول عينة كما في الخطوة 1.2.6.

4. إعداد فؤاد وحساسية معايرة (لو NanoWizard JPK فؤاد)

1. جبل ناتئ على فؤاد. يجب أن يتم تنظيمها ناتئ مع إندينتر على شكل مستدير. فإن نصف قطرها تحديد س، ص، ض القرار وعمق المسافة البادئة في القياس الدقيق الذي يمكن أرشفة.
   1. لأخذ القياسات ميزو النانوية على سطح البشرة، واستخدام إندينتر الجولة 50 نانومتر نصف قطرها؛ لأخذ القياسات المتوسطة المدى، واستخدام 0.5 ميكرومتر إندينتر الجولة دائرة نصف قطرها؛ لأخذ القياسات الميكروسكيل (2-3 عبر الخلايا)، واستخدام إندينتر الجولة دائرة نصف قطرها 2.5 ميكرومتر.
2. وضع الليزر على طرف ناتئ. محاذاة الليزر إلى منتصفمن الآسر باستخدام مرآة.
3. وضع كوب نظيف تحت فؤاد.
   ملاحظة: يتم تعيين التالية لتحويل إشارة لموقف الليزر على مستقبلات فؤاد إلى تشوه ناتئ، وتقييم مستمر ربيع ناتئ، لترجمته إلى قوة.
4. النهج مع قوة الهدف "نقطة مجموعة" من 1 V.
5. حدد "التحليل الطيفي القوة". القيام المسافة البادئة من خلال تحديد الحد الأقصى "نقطة مجموعة النسبية" ل2 V، و "تمديد السرعة" إلى 40 ميكرون / ثانية، و "طول ض" إلى 5 ميكرون.
6. من القائمة "المعايرة مدير"، حدد الخطية جزء من منحنى إلى الأمام لتناسب حساسية باستخدام زر "اختيار مجموعة مناسبة". "نقطة مجموعة النسبية" يجب أن تتحول من "فولت" إلى "متر".
7. من القائمة "مدير المعايرة"، حدد "ربيع دائم" لتقييم ايلasticity من ناتئ باستخدام التقلبات الحرارية. اضغط على "تشغيل" للحصول على المؤامرة الكثافة الطيفية للناتئ. العثور على ذروة صدى مع أدنى تردد. أنها تناسب باستخدام زر "اختيار مجموعة مناسبة".
   ملاحظة 1: للحصول على مزيد من التفاصيل على ضبط التقلبات الحرارية، وقراءة كوك ¹⁵ آخرون.
   ملاحظة 2: يفضل استخدام الطريقة المباشرة لتقييم مرونة ناتئ باستخدام ناتئ المرجعية (أو المواد مع صلابة المعروفة). وقد تبرعت تلك المستخدمة هنا تفضلت عاطف Asnacios ^16.
8. إضافة 200 ميكرولتر من 10٪ محلول مانيتول تحت طرف ناتئ. إعادة تنظيم الليزر لمنتصف الآسر باستخدام مرآة.
9. إعادة ضبط حساسية: من القائمة "المعايرة مدير"، انقر على زر "غير معروف"؛ كرر الخطوات من 2.3 إلى 2.5 خلال.

5 الحصول على البيانات: ولي يونغ معامل رسم الخرائط

1. وضع العينات التي شنت تحت فؤاد وإضافة قطرات 500 ميكرولتر من 10٪ محلول مانيتول على العينة. الحل مانيتول plasmolyzes الخلايا في غضون دقائق.
2. النهج مع قوة الهدف ("نقطة تعيين") 20 ن ن ("تعيين نقطة" لا ينبغي أن يكون أكثر من 3 V)
3. المسافة البادئة مع "نقطة التحديد النسبي" 200 ن ن، وهو "تمديد السرعة" من 40 ميكرون / ثانية، و "طول ض" من 5 ميكرون.
4. ضبط "نقطة مجموعة النسبية" من أجل الحصول على المسافة البادئة من 100 نانومتر ل200 نانومتر شنت ناتئ أو 0.5 ميكرومتر ل1 ميكرون / 5 ميكرون شنت ناتئ.
5. في وضع "خرائط القوة"، حدد لمسح المنطقة: لالخلايا الإنشائية، و 70 ميكرومتر × 70 ميكرون مع قرار ("بكسل") 64 × 64؛ لhypocotyls والجذور، 100 ميكرون × 100 ميكرون مع قرار من 64 × 64.
6. الصحافة مسح لإطلاق التجارب. حفظ الإخراج.

6 تحليل البيانات: حسابات معامل ولي يونغ

1. فتح ملف البيانات في البرنامج وتحليل البيانات.
2. حدد "تجهيز الدفعات" لتطبيق نفس التحليل لجميع منحنيات خريطة واحدة.
3. حدد "تصحيح الارتفاع لالانحناء للناتئ" لذلك لاستخراج عمق المسافة البادئة.
4. حدد "معامل تناسب وظيفة يونغ" التي ستتولى القوة يتناسب مع مجال المسافة البادئة. تعيين "شكل نصيحة" إلى مكافئ لنفترض أن المسافة البادئة هو شكل قطع مكافئ.
5. وتشير دائرة نصف قطرها من الحافة.
6. حدد تفضيلي "التراجع" منحنى لتحليل لأنها أقل حساسية للتضاريس من منحنى "تمديد". ومع ذلك، إذا كان هناك خلاف كبير من التحقيق خلال "التراجع"، استخدم منحنى "تمديد"، والتي هي حساسة للالتصاق.
7. مجموعةنسبة بواسون إلى 0.5. الصحافة على تحليل وحفظ الإخراج.

النتائج

في الشكل 1 نقدم نموذجية معاملات الرجوعية الخرائط الشباب من الخلايا الإنشائية الأزهار (أرقام 1A و 1B)، hypocotyls الصغار والكبار (أرقام 1C-F)، والنسيج الإنشائي الجذر (الشكل 1G و1H). في جميع التجارب إندينتر هو نصف كروية، ولكن نصف قطرها ...

Discussion

في النباتات، وتغيير الخواص الميكانيكية تلعب دورا رئيسيا في توجيه النمو والتشكل. حتى الآن لم يكن هناك تقدم كبير في كشف شبكات الوراثية والكيميائية التي تتحكم في نمو النبات، ولكن معرفتنا لكيفية مساهمة هذه الشبكات إلى وتتأثر التغيرات في الخواص الميكانيكية بدائية. يجب أ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM	JPK	NanoWizard	All the 3-generation are able to do the work with the same preferment.
AFM stage	JPK	CellHesion	Required for sample with low topography (less than 11 µm between the lowest and the highest point in the area of force scanning).
AFM optics	JPK	Top View Optics	Very important in order to position the sample. Could be replaced by long range binoculars or a microscope.
Stereo microscope	Leica	M125	Any type of stereo microscope could do.
150 nm mounted cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	R150-NCL-10	To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use.
1 µm mounted cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	SD-Sphere-NCH-S-10	To measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis.
Tipless cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	TL-NCH-20	To measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5 µm mounted cantilever. We attached a 5 µm borosilicate bead to a tipless cantilever.
5 µm silicon microspheres	Corpuscular	C-SIO-5
Araldite	Bartik S.A. 77170 Coubet, France		Araldite for fixing the bead to the tipless cantilever.
Low melting agarose	Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410	BP160-100	34-45 °C gelation temperature
D-Mannitol	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA	M4125-500G
2 Stainless Steel No. 5 Tweezers	Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland	951199