Cartográficas basadas en AFM de las propiedades elásticas de las paredes celulares: en tejido, celular, y las Resoluciones Subcelulares

Resumen

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Resumen

Se describe un método recientemente desarrollado para medir las propiedades mecánicas de las superficies de los tejidos vegetales utilizando microscopía de fuerza atómica (AFM) micro / nano-indentaciones, para un JPK AFM. En concreto, en este protocolo se mide el módulo aparente de Young de las paredes celulares en resoluciones subcelulares entre regiones de hasta 100 m x 100 m en los meristemos florales, hipocotilos y raices. Esto requiere una cuidadosa preparación de la muestra, la correcta selección de los micro-penetradores y profundidades sangría. Para tener en cuenta las propiedades de la pared celular sólo, las mediciones se realizan en soluciones altamente concentradas de manitol con el fin de plasmolizar las células y por lo tanto eliminar la contribución de la presión de turgencia de la célula.

En contraste con otras técnicas existentes, mediante el uso de diferentes penetradores y profundidades de indentación, este método permite mediciones multiescala simultánea, Sin embargo, varias limitaciones siguen siendo: el método sólo se puede utilizar en bastante pequeñas muestras (alrededor de 100 m de diámetro) y sólo en los tejidos externos; el método es sensible a la topografía de tejido; mide sólo algunos aspectos de las propiedades mecánicas complejas del tejido. La técnica se está desarrollando rápidamente y es probable que la mayoría de estas limitaciones se resolverán en un futuro próximo.

Introducción

El crecimiento de las plantas se logra por la expansión coordinada de las paredes celulares rígidas que rodean a cada célula del organismo. La acumulación de pruebas indica que es a través de la modificación de la química de la pared celular que las plantas locales controlan esta expansión. La expansión se piensa que es impulsado principalmente por la tensión en las paredes de las células, causados ​​por la alta presión de turgencia de la célula; Esta respuesta cepa a la presión de turgencia se rige por las propiedades mecánicas de las paredes celulares ^1. Poco se sabe de estas propiedades mecánicas y la forma en que cambia durante el desarrollo. Además, se sabe poco de cómo se controlan estas propiedades mecánicas y si evaluaciones contribuyen a alterar la química de la pared celular de una manera que está aparentemente coordinados a través de un tejido. Si vamos a entender la conexión entre los cambios químicos y mecánicos en las paredes celulares de las plantas durante el desarrollo, y en última instancia, cómo estas interacciones microscópicas gobiernan una plantaSe requiere 's crecimiento macroscópico, un método que puede controlar las propiedades mecánicas de las paredes celulares en el desarrollo de órganos en la escala celular o tisular.

El método de microscopía de fuerza atómica (AFM) descrito aquí, que se basa en micrómetros o nanómetros compresiones de tejido o indentaciones, fue desarrollado precisamente para medir las propiedades mecánicas de las paredes celulares en el desarrollo de órganos simultáneamente en resoluciones subcelulares y a través de regiones enteras de tejido. Otros métodos tienen ya sea una resolución que es demasiado bajo o demasiado alto: el extensómetro sólo es capaz de medir las propiedades mecánicas medias de un tejido completo en la escala milimétrica ^2-4, una escala que sea, por ejemplo, demasiado grande para medir los primeros eventos en organogénesis; la microindenter puede efectuar mediciones en resolución subcelular en la escala nanométrica, pero se limita a la medición de las células aisladas y no grupos de células u órganos ^5-7. Con la AFM, la requierend tejido, celular, y las resoluciones subcelulares se pueden alcanzar ^8-10. Recientemente, varios protocolos han sido desarrollados específicamente para medir la mecánica de los tejidos de plantas que también se podrían utilizar ^{11, 12.}

Vamos a presentar aquí la forma de evaluar la elasticidad del tejido a través de la medición del módulo de Young de la aparente ^13.

El módulo de Young se usa comúnmente para describir la rigidez de un material. Durante pequeña deformación la fuerza requerida para deformar un material es proporcional al área de indentación. El módulo de Young es este coeficiente. En el caso de un material homogéneo continua el mismo coeficiente se mide independientemente del tipo de indentación (tamaño y forma), pero va a cambiar con la velocidad de la medición. En el caso de la compleja estructura del tejido de las plantas, hemos observado hasta el momento que la fuerza es proporcional a la deformación que permite la determinación deun coeficiente de proporcionalidad que denominamos "módulo de elasticidad aparente". En contraste a partir de medios continuos en las plantas, este módulo de Young aparente es sensible al tamaño de la indentación. No corresponde a la joven módulos de una pared celular pura. Es mejor describe la elasticidad del andamiaje de la pared celular del tejido.

Protocolo

1. Preparar cristal diapositivas para la Muestra de montaje

1. Preparar imbedding medios de agarosa: 0,7% de agarosa de bajo punto de fusión en el 10% de manitol (en agua).
2. El uso de un instrumento de metal fuerte (por ejemplo, la punta de perforación, cal), grabar un área de 0,5 x 0,5 cm en el centro de un portaobjetos de vidrio microscopía. O en lugar, pegar un pequeño trozo de lámina de vidrio (aproximadamente 20 x 200 m) a la lámina de vidrio con pegamento Araldite. NOTA: Este hace rugosa la superficie a fin de facilitar la adhesión de la agarosa para garantizar que los palos de los medios de comunicación de agarosa o correcciones a la diapositiva. Esta diapositiva se puede reutilizar.
3. Coloque una gota de aproximadamente 20 l de imbedding medios de agarosa en la región grabada al agua fuerte de la lámina de vidrio. Esto da una película delgada de agarosa.
4. Guarde la placa de vidrio en una caja húmeda y esperar a que los medios de comunicación de agarosa para solidificar.

2. Disecante y montaje Muestras de meristemas

1. Microdissect meristemos para imagi confocalng: quitar las yemas florales, uno por uno desde el tallo tirando hacia abajo con pinzas ultrafinas. Es importante eliminar todas las yemas florales hasta los brotes que no presentan sépalos (es decir, los primordios P1 ^14).
2. Uso de una hoja de afeitar o la punta de las pinzas, cortar el meristemo de distancia desde el vástago. El corte debe ser paralelo a la región de la superficie meristemo que se va a medir con el AFM. El ápice obtenido debe estar entre 300 my 600 m de alto para caber debajo de la punta del AFM.
3. Empuje el ápice en la película de los medios de agarosa preparado en el paso 1.1.4. Elija una posición sobre el portaobjetos de vidrio / agarosa y empuje suavemente de forma que el meristemo es tanto directamente en contacto con el portaobjetos de vidrio y sobresale hacia fuera de la agarosa. Es crucial para posicionar el meristemo en la agarosa dentro de los pocos segundos que siguen a su corte del tallo. NOTA: Este es con el fin de evitar que el meristemo de secado. En esta etapa, el meristemo será de pie en un CRACk debido a que la agarosa se fracturó en la aplicación de presión.
4. Preparar varios meristemas de esta manera para formación de imágenes por lotes, siempre que sean de la misma altura y están posicionados de menos de 500 micras una de otra en la diapositiva. Mantenga los meristemos preparados en la caja húmeda mientras la disección de más muestras.
   NOTA: Se limita la variación procedente de la calibración. Idealmente 2 muestras de cada condición se podrían preparar y medidos al azar. Hasta el momento no hay efecto observado de imágenes por lotes en la medición (el estrés inducido por la respuesta). Esto podría ser gracias a la dilución de las moléculas de señalización de estrés en el agar y / o la solución de montaje. Alternativamente, la respuesta de estrés es la misma independientemente de la cantidad de muestra preparada.
5. Antes de pasar al siguiente paso, asegúrese de que la frontera entre el meristemo y las yemas florales es seco. Si no es así, retire suavemente el exceso de agua con papel de filtro. Esto debe evitar que en la siguiente etapa de que el derretidoagarosa inunda la muestra debido a las fuerzas de capilaridad.
6. Con una pipeta de 20 l, añadir una cantidad suficiente de montaje de agarosa derretida para rellenar la grieta creada en el paso 1.2.3. y para rodear cada meristemo. La agarosa debe alcanzar el nivel de la cicatriz de la yema floral eliminado (primordio). Para lograr esto, puede ser necesario añadir agarosa en cada extremo de la grieta.
7. Cuando se añade la agarosa, se inundará de forma rápida dentro de la grieta; con la pipeta, chupar parte del fundido de montaje de agarosa para asegurar que el meristemo es el punto más alto en la diapositiva. Esto fija el meristemo de manera que no se pueda mover durante la exploración.

3. Montaje de raíces o hipocótilo Muestras

1. Para raices e hipocotilos, sin disección es necesario. En la película fina de agarosa en el portaobjetos de vidrio preparado, hacer un surco bien directamente por encima de un grabado en el vidrio oa lo largo de una lámina de vidrio. Coloque la raíz o del hipocotilo en esta ranura asegurándose de que está en contacto con lavidrio a lo largo de toda su longitud.
2. Antes de pasar al siguiente paso, asegúrese de que la muestra está seca en su superficie. Si no es así, retire suavemente el exceso de agua con papel de filtro.
3. Añadir derretida montaje agarosa alrededor de la muestra como en el paso 1.2.6.

4. Preparación AFM y Calibración de la sensibilidad (para una JPK Nanowizard AFM)

1. Montar un voladizo en el AFM. El voladizo debe ser montado con penetrador de forma redonda. El radio determinará la x, y, z resolución y la profundidad de penetración en el que la medición precisa podría ser archivada.
   1. Para tomar mediciones de meso-escala nanométrica en la superficie de la epidermis, use un penetrador redondo de 50 NM de radio; para tomar medidas de mesoescala, use un micras radio penetrador ronda 0.5; para tomar mediciones a microescala (a través de 2-3 células), utilice un penetrador ronda 2,5 m de radio.
2. Coloque el láser en la punta del cantilever. Alinear el láser para el mediodel captor con el espejo.
3. Coloque un vaso limpio bajo el AFM.
   NOTA: el siguiente está destinada a transformar la señal de la posición del láser en el receptor AFM en una deformación de la palanca y, mediante la evaluación de la constante elástica del cantilever, para traducirlo en una fuerza.
4. Enfoque con un "punto de ajuste" fuerza objetivo de 1 V.
5. Seleccione "espectroscopia de fuerza". Haga una muesca estableciendo el "punto de referencia relativo" máxima a 2 V, el "ampliar la velocidad" a 40 m / s, y la "longitud z" a 5 micras.
6. En el menú "Calibración de negocios", seleccionar la parte lineal de la curva forward para adaptarse a la sensibilidad con el botón "seleccionar la cocinar". El "punto de ajuste relativa" debe transformarse de "V" en "metros".
7. En el menú "Gestor de calibración", seleccione "constante de resorte" para evaluar la elasticity del cantilever usando las fluctuaciones térmicas. Pulse el botón "Ejecutar" para obtener el diagrama de densidad espectral del cantilever. Encuentre el pico de resonancia con la frecuencia más baja. Ajuste mediante el botón "seleccionar la cocinar".
   NOTA 1: Para más detalles sobre la sintonía fluctuaciones térmicas, leer Cook et al ^15.
   NOTA 2: Es preferible utilizar un método directo para evaluar la elasticidad de la viga en voladizo con una referencia (o material con rigidez conocida). El que se utiliza aquí fue amablemente donada por Atef Asnacios ^16.
8. Añadir 200 l de solución de manitol al 10% debajo de la punta en voladizo. Vuelva a alinear el láser para el medio de la captor usando el espejo.
9. Vuelva a calibrar la sensibilidad: en el menú "Calibración gerente", haga clic en el botón "desconocido"; repita los pasos 2.3 hasta 2.5.

. 5 Adquisición de Datos: Aparente Módulo de Young Cartografía

1. Coloque las muestras montadas debajo de la AFM y añadir una gota de 500 l de solución de manitol al 10% sobre la muestra. La solución de manitol plasmolyzes las células en cuestión de minutos.
2. Enfoque con una fuerza de objetivo ("punto"), de 20 nN ("punto de ajuste" no debe ser más de 3 V)
3. Sangría con un "punto de referencia relativo" de 200 nN, un "extender velocidad" de 40 m / s, y "longitud z" de 5 micras.
4. Ajuste el "punto de referencia relativo" con el fin de obtener una sangría de 100 nm para la 200 nm montado en voladizo o 0,5 m para el montado en voladizo 1 m / 5 m.
5. En el modo "mapeo de la fuerza", seleccione una región a escanear: para meristemos, 70 micras x 70 micras con una resolución ("píxeles") de 64 x 64; para hipocotilos y raíces, 100 m x 100 m con una resolución de 64 x 64.
6. Pulse SCAN para iniciar los experimentos. Guarde la salida.

. 6 Análisis de Datos: Cálculos aparente módulo de Young

1. Abrir el archivo de datos en el software de análisis de datos.
2. Seleccione "procesamiento por lotes" para aplicar el mismo análisis a todas las curvas de un solo mapa.
3. Seleccionar "corregir la altura de la flexión del voladizo" de modo para extraer la profundidad de penetración.
4. Seleccione "módulo en forma de función de Young" que se asume que la fuerza es proporcional al área de sangría. Ajuste la "plena forma" para parabólicos para suponer que la forma de sangría es una parabólica.
5. Indique el radio de la punta.
6. Seleccionar preferentemente la curva de "retracción" para el análisis, ya que es menos sensible a la topografía de la curva de "extender". Sin embargo, si hay adherencia significativa de la sonda durante la "retracción," utilizar la curva de "extender", que es insensible a pegarse.
7. Conjuntola relación de Poisson de 0,5. Presione en analizar y guardar el resultado.

Resultados

En la Figura 1 se presenta típicos mapas móduli jóvenes de meristemos florales (Figuras 1A y 1B), hipocotilos jóvenes y mayores (figuras 1C-F), y meristemas de la raíz (Figura 1G y 1H). En todos los experimentos el penetrador es semiesférica, pero su radio es diferente por lo que las diferentes resoluciones espaciales se pueden lograr figuras 1C y 1D muestran resultados típicos p...

Discusión

En las plantas, el cambio de propiedades mecánicas juegan un papel importante en dirigir el crecimiento y la morfogénesis. Hasta la fecha no ha habido un gran progreso en el descubrimiento de las redes genéticas y químicas que controlan el crecimiento de las plantas, pero nuestro conocimiento de cómo estas redes contribuyen y se ven afectados por los cambios en las propiedades mecánicas es rudimentaria. Este método nos debería permitir a llenar este vacío, y por lo que debe ser de gran interés para los cientí...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM	JPK	NanoWizard	All the 3-generation are able to do the work with the same preferment.
AFM stage	JPK	CellHesion	Required for sample with low topography (less than 11 µm between the lowest and the highest point in the area of force scanning).
AFM optics	JPK	Top View Optics	Very important in order to position the sample. Could be replaced by long range binoculars or a microscope.
Stereo microscope	Leica	M125	Any type of stereo microscope could do.
150 nm mounted cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	R150-NCL-10	To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use.
1 µm mounted cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	SD-Sphere-NCH-S-10	To measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis.
Tipless cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	TL-NCH-20	To measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5 µm mounted cantilever. We attached a 5 µm borosilicate bead to a tipless cantilever.
5 µm silicon microspheres	Corpuscular	C-SIO-5
Araldite	Bartik S.A. 77170 Coubet, France		Araldite for fixing the bead to the tipless cantilever.
Low melting agarose	Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410	BP160-100	34-45 °C gelation temperature
D-Mannitol	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA	M4125-500G
2 Stainless Steel No. 5 Tweezers	Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland	951199