La cartographie sur-AFM des propriétés élastiques de la paroi cellulaire: au tissu, cellulaire, et des résolutions Subcellular

Résumé

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Résumé

Nous décrivons une méthode récemment développée pour mesurer les propriétés mécaniques des surfaces de tissus végétaux en utilisant microscopie à force atomique (AFM) micro / nano-indentations, pour un JPK AFM. Plus précisément, dans ce protocole, nous mesurons le module de parois cellulaires de Young apparent à des résolutions sub-cellulaires à travers les régions de jusqu'à 100 um x 100 um de méristèmes floraux, hypocotyles et les racines. Cela nécessite une préparation minutieuse de l'échantillon, la sélection correcte de micro-pénétrateurs et des profondeurs d'indentation. Pour tenir compte des propriétés de la paroi cellulaire seulement, les mesures sont effectuées dans des solutions fortement concentrées de mannitol en vue de plasmolyser les cellules et ainsi supprimer la contribution de la pression de turgescence des cellules.

Contrairement à d'autres techniques existantes, en utilisant différents pénétrateurs et les profondeurs d'indentation, cette méthode permet la mesure simultanée de plusieurs échelles, Toutefois, plusieurs limitations persistent: le procédé ne peut être utilisé sur des échantillons relativement petits (autour de 100 um de diamètre) et seulement sur des tissus externes; la méthode est sensible à la topographie de tissu; il ne mesure que certains aspects des propriétés mécaniques complexes du tissu. La technique se développe rapidement et il est probable que la plupart de ces limitations seront résolus dans un proche avenir.

Introduction

La croissance des plantes est obtenue par l'expansion coordonnée des parois cellulaires rigides qui entourent chacune des cellules de l'organisme. L'accumulation de preuves indique que c'est grâce à la modification de la chimie de la paroi cellulaire des plantes qui contrôlent localement cette expansion. L'expansion est pensée pour être entraînée principalement par pression sur les parois des cellules, provoquée par la haute pression de turgescence de la cellule; cette réponse en déformation à la pression de turgescence est régie par les propriétés mécaniques des parois cellulaires ^1. On sait peu de ces propriétés mécaniques et comment ils changent au cours du développement. Par ailleurs on sait peu de la façon dont ces propriétés mécaniques sont contrôlés et si des évaluations contribuent à modifier la chimie de la paroi cellulaire d'une manière qui est apparemment coordonné à travers un tissu. Si nous voulons comprendre le lien entre les changements chimiques et mécaniques dans les parois cellulaires de la plante au cours du développement, et, finalement, comment ces interactions microscopiques régissent une planteDe croissance macroscopique, une méthode qui peut surveiller les propriétés mécaniques des parois cellulaires dans le développement des organes à l'échelle cellulaire ou tissulaire est nécessaire.

La méthode microscopie à force atomique (AFM) décrit ici, qui est basé sur micromètre ou du nanomètre compressions de tissus ou entailles, a été développé précisément pour mesurer les propriétés mécaniques des parois cellulaires dans le développement des organes simultanément à des résolutions sub-cellulaires et dans des régions entières du tissu. D'autres méthodes ont soit une résolution qui est trop bas ou trop élevé: l'extensomètre est seulement capable de mesurer les propriétés mécaniques moyennes d'un tissu tout à l'échelle du millimètre ^2-4, une échelle qui est par exemple trop grande pour mesurer les événements précoces l'organogenèse; la microindenter peut prendre des mesures à la résolution subcellulaire à l'échelle du nanomètre, mais il est limité à la mesure des cellules isolées et non des groupes de cellules ou d'organes ^5-7. Avec l'AFM, le besoind tissulaire, cellulaire et subcellulaire des résolutions peuvent être atteints ^8-10. Récemment, plusieurs protocoles ont été développés spécifiquement pour mesurer la mécanique de plantes tissus qui pourraient également être utilisés ^{11, 12.}

Nous allons présenter ici comment évaluer l'élasticité des tissus grâce à la mesure du module de Young apparent ^13.

Le module d'Young est couramment utilisé pour décrire la rigidité du matériau. Pendant petite déformation de la force requise pour déformer un matériau est proportionnelle à la surface de l'indentation. Le module d'Young est ce coefficient. Dans le cas d'un matériau homogène continu le même coefficient sera mesuré, indépendamment du type d'indentation (de taille et la forme) mais va changer avec la vitesse de la mesure. Dans le cas de la structure complexe de tissus végétaux, nous avons observé que la mesure de la force est proportionnelle à la déformation permettant la détermination deun coefficient de proportionnalité que l'on nomme «module de Young apparent». En contraste à partir de supports continus dans les plantes, ce module de Young apparent est sensible à la taille de l'indentation. Elle ne correspond pas à la jeune modules d'une paroi cellulaire pure. Il décrit le mieux l'élasticité de l'échafaudage de la paroi cellulaire du tissu.

Protocole

1. Préparer lames de verre pour l'échantillon de montage

1. Préparer plongement médias agarose: 0,7% d'agarose à faible point de fusion dans 10% de mannitol (dans l'eau).
2. L'utilisation d'un instrument de métal solide (par exemple pointe de forage, de la chaux), graver un cm x 0,5 0,5 zone dans le centre d'une lame de verre de microscope. Ou plutôt, coller un petit morceau de lamelle de verre (environ 20 x 200 um) à la lame de verre avec de la colle Araldite. REMARQUE: Cette rugosité de la surface, afin de faciliter l'adhérence de l'agarose afin de s'assurer que les bâtonnets de médias d'agarose ou des corrections à la diapositive. Cette glissière peut être réutilisé.
3. Positionner une gouttelette d'environ 20 pi d'agarose à insérer de support sur la région gravée de la lame de verre. On obtient ainsi un film mince d'agarose.
4. Conservez la lame de verre dans une boîte humide et attendre que les médias d'agarose à solidifier.

2. Dissection et montage échantillons méristèmes

1. Microdissect méristèmes pour imagination confocaleng: supprimer les boutons floraux, un par un à partir de la tige en les tirant vers le bas avec des pincettes ultra-fines. Il est important d'enlever tous les bourgeons floraux à les bourgeons qui ne présentent pas de sépales (c'est à dire les ébauches de P1 ^14).
2. En utilisant une lame de rasoir ou la pointe de la pince à épiler, couper le méristème loin de la tige. La coupe doit être parallèle à la région de la surface du méristème qui doit être mesurée à l'aide de l'AFM. Le sommet obtenu doit être comprise entre 300 um et 600 um haute pour passer sous la pointe de l'AFM.
3. Poussez le sommet dans le film de médias agarose préparés à l'étape 1.1.4. Choisir un emplacement sur la lame de verre / agarose et pousser doucement de telle sorte que le méristème est à la fois directement en contact avec la lame de verre et fait saillie hors de l'agarose. Il est essentiel de positionner le méristème dans la gélose dans les quelques secondes qui suivent sa coupe de la tige. NOTE: Ceci est pour éviter le méristème de séchage. A ce stade, le méristème sera debout dans un crack parce que l'agarose fracturé lors de l'application de la pression.
4. Préparer plusieurs méristèmes de cette manière pour l'imagerie par lots, à condition qu'ils soient de la même hauteur et sont placées à moins de 500 pm les unes des autres sur la diapositive. Gardez les méristèmes préparés dans la zone humide tandis que la dissection des échantillons supplémentaires.
   NOTE: Il limite la variation venant de l'étalonnage. Idéalement 2 échantillons de chaque état peuvent être préparés et mesurés de façon aléatoire. Jusqu'à présent, il est sans effet observé de l'imagerie de lot sur la mesure (stress induit une réponse). Cela pourrait être, grâce à la dilution de molécules de signalisation de stress dans l'agar-agar et / ou de la solution de montage. En variante, la réaction de stress est la même quelle que soit la quantité de l'échantillon préparé.
5. Avant de passer à l'étape suivante, assurez-vous que la frontière entre le méristème et les boutons floraux est sec. Sinon, retirez délicatement l'excès d'eau avec un papier filtre. Cela devrait éviter dans l'étape suivante que le fonduagarose inonde l'échantillon en raison de forces de capillarité.
6. Avec une pipette 20 ul, ajouter suffisamment fondu de montage agarose à remplir la fissure créée à l'étape 1.2.3. et à entourer chaque méristème. L'agarose devrait atteindre le niveau de la cicatrice de bourgeon de fleur enlevé (de primordium). Pour ce faire, il peut être nécessaire d'ajouter d'agarose à chaque extrémité de la fissure.
7. Lorsque la gélose est ajouté, il va rapidement inonder dans la fissure; à l'aide de la pipette, aspirer une partie de l'agarose fondu de montage afin de s'assurer que le méristème est le point le plus haut sur le coulisseau. Cela corrige le méristème de sorte qu'il ne peut pas se déplacer au cours de l'imagerie.

3. Montage des racines ou hypocotyle échantillons

1. Pour les racines et les hypocotyles, aucune dissection est nécessaire. Dans le film mince d'agarose sur la lame de verre préparées, faire une rainure, soit directement au-dessus d'une gravure dans le verre ou le long d'une lamelle de verre. Positionner la racine ou de l'hypocotyle dans cette rainure en s'assurant qu'il est en contact avec leverre sur toute sa longueur.
2. Avant de passer à l'étape suivante, assurez-vous que l'échantillon est sec à sa surface. Sinon, retirez délicatement l'excès d'eau avec un papier filtre.
3. Ajouter fondu de montage agarose autour de l'échantillon comme dans l'étape 1.2.6.

4. AFM Préparation et Calibrage de la sensibilité (pour un JPK Nanowizard AFM)

1. Monter un porte à faux sur l'AFM. Le cantilever doit être monté avec pénétrateur de forme ronde. Le rayon détermine les coordonnées x, y, z de résolution et la profondeur de pénétration au cours de laquelle une mesure précise puisse être archivée.
   1. Pour prendre des mesures méso-échelle nanométrique à la surface de l'épiderme, utiliser un pénétrateur ronde rayon de 50 nm; de prendre des mesures méso-échelle, utiliser un rayon um pénétrateur ronde 0,5; de prendre des mesures micrométriques (dans 2-3 cellules), utiliser un pénétrateur ronde 2,5 um de rayon.
2. Positionner le laser à la pointe de la poutre. Aligner le laser au milieudu capteur à l'aide du miroir.
3. Placez un verre propre sous l'AFM.
   Remarque: le texte suivant est réglé pour transformer le signal de la position du laser sur le récepteur AFM en une déformation de la poutre et, par l'évaluation de la constante de rappel du levier, pour la traduire en une force.
4. Approche avec une force de cible "consigne" de 1 V.
5. Sélectionnez «spectroscopie de force". Faites une entaille en réglant le maximum "point de consigne par rapport" à 2 V, la "étendre vitesse" à 40 um / s, et le "z longueur" à 5 um.
6. Dans le menu "calibrage gestionnaire", sélectionnez la partie linéaire de la courbe vers l'avant pour s'adapter à la sensibilité à l'aide du bouton «sélectionner gamme ajustement". Le "point de consigne par rapport" devrait être transformé de "V" pour "mètre".
7. Dans le menu «gestionnaire d'étalonnage", sélectionnez "constante de rappel» pour évaluer l'elasticity du cantilever, avec des fluctuations thermiques. Appuyez sur "Exécuter" pour obtenir le tracé de la densité spectrale de la poutre. Trouver le pic de résonance à la fréquence la plus basse. Monter à l'aide de la touche «select gamme ajustement".
   NOTE 1: Pour plus de détails sur le réglage des fluctuations thermiques, lu Cook et al ^15.
   NOTE 2: Il est préférable d'utiliser une méthode directe pour évaluer l'élasticité de la poutre à l'aide d'une console de référence (ou matériau de raideur connue). Celle utilisée ici a été gracieusement offert par Atef Asnacios ^16.
8. Ajouter 200 pi de solution de mannitol à 10% sous la pointe du cantilever. Réaligner le laser au moyen du capteur à l'aide du miroir.
9. Recalibrer la sensibilité: à partir du menu "calibrage gestionnaire", cliquez sur le bouton «inconnu»; répétez les étapes 2.3 à 2.5.

. 5 Acquisition de données: module de Young apparent de Cartographie

1. Placer les échantillons montés sous l'AFM et ajouter une goutte de 500 pl d'une solution de mannitol à 10% sur l'échantillon. La solution de mannitol plasmolyzes les cellules en quelques minutes.
2. Approche avec une force de cible ("consigne") de 20 nN ("de point de consigne" ne devrait pas être plus de 3 V)
3. Retrait d'un "point de consigne relative» de 200 nN, un "étendre vitesse" de 40 um / s, et "z longueur" de 5 um.
4. Réglez le "point de consigne relative" afin d'obtenir une empreinte de 100 nm pour le 200 nm monté en porte à faux ou 0,5 um pour la 1 pm / 5 um cantilever monté.
5. En mode "cartographie de la force", sélectionnez une région à numériser: pour méristèmes, 70 um x 70 um avec une résolution ("pixels") de 64 x 64; pour les hypocotyles et les racines, 100 um x 100 um avec une résolution de 64 x 64.
6. Appuyez sur SCAN pour lancer les expériences. Enregistrez la sortie.

6. Analyse des données: calculs de l'apparente module d'Young

1. Ouvrir le fichier de données dans le logiciel d'analyse de données.
2. Sélectionnez "traitement par lots" pour appliquer la même analyse à toutes les courbes d'une seule carte.
3. Sélectionner "corriger la hauteur de la flexion de la poutre" afin d'extraire la profondeur de pénétration.
4. Sélectionnez "module fonction d'ajustement de Young» qui suppose la force est proportionnelle à la surface de l'indentation. Réglez la "forme de pointe" pour paraboliques de supposer que la forme d'indentation est une parabole.
5. Indiquez le rayon de la pointe.
6. Sélectionner préférentiellement le "retract" courbe de l'analyse, car il est moins sensible à la topographie de la courbe "étendre". Cependant, si il ya adhérence importante de la sonde au cours de la "rentrée", utilisez la courbe «prolonger», qui est insensible à coller.
7. Setle coefficient de Poisson de 0,5. Appuyez sur analyser et enregistrer la sortie.

Résultats

Dans la figure 1, nous présentons des cartes de modules jeunes typiques de méristèmes floraux (Figures 1A et 1B), jeunes et vieux hypocotyles (figures 1C-F), et méristème de la racine (figure 1G et 1H). Dans toutes les expériences, le pénétrateur est hémisphérique, mais son rayon est différent de sorte que différentes résolutions spatiales peuvent être atteints figures 1C et 1D

Discussion

Chez les plantes, la modification des propriétés mécaniques jouent un rôle majeur dans la direction de la croissance et de la morphogenèse. À ce jour, il ya eu de grands progrès dans le décryptage des réseaux génétiques et chimiques qui contrôlent la croissance des plantes, mais notre connaissance de la façon dont ces réseaux contribuent à et sont affectés par les changements des propriétés mécaniques est rudimentaire. Cette méthode devrait nous permettre de combler cette lacune, et il devrait donc ?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM	JPK	NanoWizard	All the 3-generation are able to do the work with the same preferment.
AFM stage	JPK	CellHesion	Required for sample with low topography (less than 11 µm between the lowest and the highest point in the area of force scanning).
AFM optics	JPK	Top View Optics	Very important in order to position the sample. Could be replaced by long range binoculars or a microscope.
Stereo microscope	Leica	M125	Any type of stereo microscope could do.
150 nm mounted cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	R150-NCL-10	To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use.
1 µm mounted cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	SD-Sphere-NCH-S-10	To measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis.
Tipless cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	TL-NCH-20	To measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5 µm mounted cantilever. We attached a 5 µm borosilicate bead to a tipless cantilever.
5 µm silicon microspheres	Corpuscular	C-SIO-5
Araldite	Bartik S.A. 77170 Coubet, France		Araldite for fixing the bead to the tipless cantilever.
Low melting agarose	Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410	BP160-100	34-45 °C gelation temperature
D-Mannitol	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA	M4125-500G
2 Stainless Steel No. 5 Tweezers	Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland	951199