AFM-basierte Mapping der elastischen Eigenschaften der Zellwände: auf der Tissue-, Handy-und subzellulärer Beschlüsse

Zusammenfassung

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine kürzlich entwickelte Methode, um die mechanischen Eigenschaften der Oberflächen von Pflanzengeweben für ein JPK AFM-Messung mit Hilfe der Rasterkraftmikroskopie (AFM) Mikro / Nano-Vertiefungen. Insbesondere wird in diesem Protokoll wir das scheinbare Elastizitätsmodul der Zellwände zu messen subzellulären Auflösungen in den Regionen von bis zu 100 &mgr; m × 100 &mgr; m in Blütenmeristemen, Hypokotylen und Wurzeln. Dies erfordert eine sorgfältige Vorbereitung der Probe, die richtige Auswahl der Mikro-Eindringkörper und Eindringtiefen. Um die Zellwand nur Eigenschaften werden Messungen in hochkonzentrierten Lösungen von Mannitol, um die Zellen plasmolysieren beseitigen und damit den Beitrag der Zelle Turgor geführt ausmachen.

Im Gegensatz zu anderen vorhandenen Techniken, durch die Verwendung unterschiedlicher Eindringkörpern und Eindringtiefen ermöglicht dieses Verfahren die gleichzeitige Multiskalen-Messungen Es bleiben jedoch mehrere Einschränkungen: Das Verfahren kann nur für relativ kleine Proben (etwa 100 um Durchmesser) und nur an äußeren Gewebe verwendet werden; die Methode ist empfindlich, um Gewebe Topographie; sie misst nur bestimmte Aspekte des Gewebes komplexen mechanischen Eigenschaften. Die Technik wird schnell entwickelt, und es ist wahrscheinlich, dass die meisten dieser Beschränkungen werden in naher Zukunft gelöst werden.

Einleitung

Wachstum der Pflanzen wird durch die koordinierte Ausdehnung der starren Zellwänden, die jede einzelne Zelle des Organismus umgibt erreicht. Zunehmend Hinweise darauf, zeigt, dass es durch die Modifikation der Zellwand der Chemie, dass Pflanzen lokal diese Expansion zu steuern. Die Expansion wird angenommen, dass in erster Linie durch Druck auf den Zellwänden von hohen Turgor der Zelle verursacht angetrieben zu werden; Dieser Stamm Reaktion auf Turgor wird durch die mechanischen Eigenschaften der Zellwände ¹ geregelt. Wenig ist von dieser mechanischen Eigenschaften bekannt und wie sie während der Entwicklung ändern. Weiterhin ist wenig wie diese mechanischen Eigenschaften gesteuert werden, und ob erteilen tragen zur Zellwandchemie in einer Weise, die offensichtlich in einer Gewebe koordiniert verändern bekannt. Wenn wir die Verbindung zwischen chemischen und mechanischen Veränderungen in der Pflanzenzellwände während der Entwicklung, und schließlich, wie diese mikroskopischen Wechselwirkungen regieren ein Werk verstehen'S makroskopischen Wachstums, eine Methode, die die mechanischen Eigenschaften der Zellwände bei der Entwicklung von Organen an der Zell-oder Gewebe Maßstab überwachen erforderlich.

Die Rasterkraftmikroskopie (AFM)-Methode hier beschrieben, die auf Mikrometer-oder Nanometergewebekompressionen oder Vertiefungen basiert, wurde entwickelt, um genau die mechanischen Eigenschaften der Zellwände in der Entwicklung gleichzeitig Organe auf subzellulärer Auflösungen und über ganze Regionen des Gewebes zu messen. Andere Methoden entweder eine Auflösung, die zu niedrig oder zu hoch ist: das Extensometer ist nur in der Lage, die durchschnittlichen mechanischen Eigenschaften eines ganzen Gewebes an der Millimeter-Skala ^2-4, einer Skala, die beispielsweise zu groß, um in frühen Ereignisse zu messen, ist zu messen Organogenese; die Mikroindenter können Messungen an subzellulärer Auflösung im Nanometerbereich, aber es wird in den Messzellen isoliert und nicht Gruppen von Zellen oder Organen ^5-7 beschränkt. Mit der AFM, die erforderlichd Gewebe, Zell und subzellulärer Auflösungen ^8-10 erreicht werden. Kürzlich mehrere Protokolle wurden speziell entwickelt, um Mechanismen der Gewebe Pflanzen, die auch verwendet werden könnte, ^{11, 12} zu messen.

Wir werden hier präsentiert, wie die Elastizität des Gewebes durch Messung der scheinbaren Elastizitätsmodul ¹³ zu beurteilen.

Der Elastizitätsmodul wird häufig verwendet, um die Steifigkeit eines Materials zu beschreiben. Während kleine Verformung der erforderlich ist, um ein Material zu verformen Kraft ist proportional zur Fläche des Eindrucks. Der E-Modul ist dieser Koeffizient. Im Fall einer kontinuierlichen homogenen Material die gleichen Koeffizienten unabhängig von der Einrückung Typ (Größe und Form) gemessen werden, jedoch wird mit der Geschwindigkeit der Messung verändern. Im Falle der komplexen Struktur von Pflanzen Gewebe haben wir so weit, dass die Kraft proportional zu der Deformation, die die Bestimmung der beobachtetenein Koeffizient der Verhältnismäßigkeit, die wir nennen "scheinbare Elastizitätsmodul". Im Gegensatz von kontinuierlichen Medien in den Pflanzen ist diese scheinbare Elastizitätsmodul empfindlich auf die Größe der Vertiefung. Es muss nicht auf die jungen Moduli eines reinen Zellwand entsprechen. Es beschreibt die beste Elastizität des Gerüsts der Zellwand des Gewebes.

Protokoll

1. Bereiten Glasobjektträger für die Montage Proben

1. Bereiten Einbettung Agarose Mittel: 0,7% niedrig schmelzender Agarose in 10% Mannit (in Wasser).
2. Mit einem starken Metallinstrument (zB Bohrerspitze, Kalk), ätzen ein 0,5 x 0,5 cm-Bereich in der Mitte eines Mikroskopie Glasträger. Oder statt, kleben Sie ein kleines Stück der Glaslamelle (ca. 20 x 200 um) auf die Glasobjektträger mit Araldite Leim. ANMERKUNG: Diese raut die Oberfläche, um die Haftung der Agarose zu erleichtern, damit die Agarose Medien Sticks oder Korrekturen an der Folie. Diese Folie kann wiederverwendet werden.
3. Positionieren eines Tröpfchens von 20 &mgr; l Agarose-Einbettungsmedium auf dem geätzten Bereich des Objektträgers. Dies ergibt eine Dünnschicht aus Agarose.
4. Bewahren Sie die Glasobjektträger in einer feuchten Box und warten, bis die Agarose-Medien zu verfestigen.

2. Zergliedern und Montage Meristem Proben

1. Microdissect Meristemen für konfokale Phantasieng: Entfernen Sie die Blütenknospen eines nach dem anderen aus dem Stamm, indem Sie sie mit ultra feinen Pinzette nach unten. Es ist wichtig, alle Blütenknospen an den Knospen, die nicht Kelchblätter nicht aufweisen (dh der P1 Primordia ¹⁴⁾ entfernen sich.
2. Mit einer Rasierklinge oder die Spitze der Pinzette, schneiden Sie den Meristem vom Stamm. Der Schnitt sollte parallel zu dem Bereich der Meristem Oberfläche, die mit dem AFM gemessen werden soll. Das erhaltene Spitze sollte zwischen 300 &mgr; m und 600 &mgr; m hoch, unter der AFM-Spitze zu passen.
3. Drücken Sie die Spitze in den Film der in Schritt 1.1.4 vorbereitet Agarose-Medien. Wählen Sie eine Position auf dem Objektträger / Agarose und drücken Sie vorsichtig, so dass das Meristem ist sowohl direkt in Kontakt mit dem Objektträger aus Glas und ragt aus dem Agarose. Es ist entscheidend, die Meristem in der Agarose in den wenigen Sekunden, die seinen Schnitt von dem Schaft folgen positionieren. Hinweis: Dies ist, um das Austrocknen zu verhindern Meristem aus. In dieser Phase wird das Meristem in einem crac zu stehenk, weil die Agarose bei Anwendung von Druck zerbrochen.
4. Bereiten mehrere Meristeme diese Weise für Batch-Bildgebung, vorausgesetzt, sie haben die gleiche Höhe aufweisen und weniger als 500 um voneinander auf der Folie angeordnet ist. Halten Sie die vorbereitet Meristeme in der feuchten Feld während Sezieren weitere Proben.
   HINWEIS: Es begrenzt die Änderung, die von der Kalibrierung. Idealer 2 Proben jeder Bedingung könnte vorbereitet und zufällig gemessen werden. Bisher gibt es keine Wirkung beobachtet von Batch-Bildgebung auf der Messung (Stress-induzierten Antwort). Dies dank der Verdünnung des Spannungssignalmoleküle in den Agar und / oder der Montage Lösung. Alternativ kann die Spannung ist die gleiche, unabhängig auf die Menge der Probe hergestellt.
5. Bevor wir zum nächsten Schritt, um sicherzustellen, dass die Grenze zwischen dem Meristem und die Blütenknospen trocken ist. Wenn nicht, entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Wasser mit Filterpapier. Dies sollte in der nächsten Stufe zu verhindern, daß das geschmolzeneAgarose flutet die Probe aufgrund der Kapillarwirkung Kräfte.
6. Mit einem 20 ul Pipette genug geschmolzen Montage Agarose in den Riss im Schritt 1.2.3 erstellt zu füllen. und jede Meristem zu umgeben. Die Agarose sollte das Niveau der Narbe des entfernten Blütenknospe (Primordium) zu erreichen. Um dies zu erreichen, kann es notwendig sein, Agarose an jedem Ende des Risses hinzuzufügen.
7. Wenn die Agarose hinzugefügt wird, wird es schnell in den Riss überfluten; mit der Pipette absaugen Teil der geschmolzenen Agarose-Montage, um sicherzustellen, dass das Meristem ist der höchste Punkt auf der Folie. Dieser behebt das Meristem, so dass es nicht während der Bildgebung zu bewegen.

3. Montage Root-oder Hypokotyl Proben

1. Für Wurzeln und Keimstengel, keine Präparation erforderlich. In dem dünnen Film aus Agarose auf die vorbereitete Objektträger, einen Nut direkt oberhalb einer Ätzung in dem Glas oder auf einer Glaslamelle. Positionieren Sie die Wurzel oder Hypokotyl in dieser Nut sicherzustellen, dass sie in Kontakt mit der istGlas in seiner ganzen Länge.
2. Bevor wir zum nächsten Schritt, um sicherzustellen, dass die Probe trocken ist, an seiner Oberfläche. Wenn nicht, entfernen Sie vorsichtig das überschüssige Wasser mit Filterpapier.
3. Montage Agarose geschmolzen um die Probe, wie in Schritt 1.2.6 hinzufügen.

4. AFM Vorbereitung und Empfindlichkeitskalibrierung (JPK Nanowizard für eine AFM)

1. Montieren Sie einen Ausleger auf der AFM. Der Ausleger sollte mit runder Eindringkörper montiert werden. Der Radius wird die x, y, z-Auflösung und die Eindringtiefe in dem eine genaue Messung archiviert werden konnten bestimmen.
   1. Um meso-nanoskalige Messungen an der Epidermis der Oberfläche nehmen, verwenden Sie eine 50 nm Radius runden Stempels; zu mesoskaligen Messungen, verwenden Sie eine 0,5 um Radius rund Eindringkörper; zu Mikro Messungen (über 2-3 Zellen), verwenden Sie eine 2,5 um Radius rund Eindringkörper.
2. Positionieren Sie den Laser an der Spitze des Auslegers. Ausrichten des Lasers auf die Mittelder Entführer mit dem Spiegel.
3. Positionieren Sie ein sauberes Glas unter den AFM.
   HINWEIS: Das folgende ist eingestellt, um das Signal der Laserposition auf der AFM-Rezeptor in einer Verformung des Auslegers zu verändern und, durch Auswertung der Federkonstante des Cantilevers, um es in eine Kraft umzusetzen.
4. Anfahren mit einem Zielkraft "Sollwert" von 1 V.
5. Wählen Sie "Kraftspektroskopie". Tun eine Vertiefung durch Einstellen der maximalen "relative Sollwert" auf 2 V, die "erstrecken Geschwindigkeit" auf 40 um / s, und die "Länge z" bis 5 um.
6. Wählen Sie im Menü "Calibration Manager", wählen Sie den linearen Teil der Terminkurve, um die Empfindlichkeit mit dem "fit Bereich wählen"-Button passen. Die "relative Sollwert" vom "Volt" auf "Meter" umgewandelt werden.
7. Wählen Sie im Menü "Calibration Manager", wählen Sie "Federkonstante", um die el bewertenasticity des Auslegers mit thermischen Fluktuationen. Drücken Sie auf "Ausführen", um die spektrale Dichte Grundstück des Auslegers zu erhalten. Finden Sie die Resonanzspitze mit der niedrigsten Frequenz. Setzen Sie es mit dem "fit Bereich auswählen" klicken.
   Hinweis 1: Für weitere Informationen über die thermischen Fluktuationen Tuning, lesen Koch et al ^15.
   Hinweis 2: Es ist besser, eine direkte Methode verwenden, um die Elastizität des Auslegers bewerten mit Hilfe eines Referenzbiegebalken (oder Material mit bekannten Steifigkeit). Der hier verwendete wurde freundlicherweise von Atef Asnacios ¹⁶ gespendet.
8. Geben Sie 200 ul 10% Mannit-Lösung unter der Auslegerspitze. Richten des Lasers, um die Mitte der Fänger mit dem Spiegel.
9. Kalibrieren Sie die Empfindlichkeit: aus dem Menü "Calibration Manager", klicken Sie auf den "unbekannten"-Taste; wiederholen Sie die Schritte 2.3 bis zum 2.5.

. 5 Datenerfassung: Scheinbarer Elastizitätsmodul Kartographie

1. Positionieren Sie die montierten Proben unter der AFM und fügen Sie eine 500 ul Tröpfchen von 10% Mannit-Lösung auf die Probe. Die Mannitollösung plasmolyzes die Zellen innerhalb von Minuten.
2. Anfahren mit einem Zielkraft ("set point") von 20 nN ("set point" sollte nicht mehr als 3 V liegen)
3. Gedankenstrich mit einer "relativen Sollwert" von 200 nN, ein "erstrecken Geschwindigkeit" von 40 &mgr; m / sec, und "z Länge" 5 um.
4. Stellen Sie die "relative Sollwert", um eine Vertiefung von 100 nm für die 200 nm Freischwinger oder 0,5 um für die 1 um / 5 um montierten Ausleger montiert zu erhalten.
5. In "Kraft-Mapping"-Modus, wählen Sie eine Region, um zu scannen: für Meristeme, 70 um x 70 um mit einer Auflösung ("Pixel") von 64 x 64; für Hypokotylen und Wurzeln, 100 um · 100 um mit einer Auflösung von 64 x 64.
6. Drücken Sie Scannen, um die Experimente zu starten. Speichern Sie die Ausgabe.

. 6 Datenanalyse: Scheinbarer Elastizitätsmodul Berechnungen

1. Öffnen Sie die Datei in der Datenanalyse-Software.
2. Wählen Sie "Stapelverarbeitung", um die gleiche Analyse für alle Kurven einer einzigen Karte beantragen.
3. "Korrigieren der Höhe der Biegung des Auslegers", damit die Eindringtiefe zu extrahieren.
4. Option "Elastizitätsmodul fit-Funktion", die annehmen, wird die Kraft ist proportional zu der Fläche der Einbuchtung. Stellen Sie die "Spitzenform" parabolischer anzunehmen, dass die Vertiefung Form ist ein parabolisch.
5. Geben Sie den Radius der Spitze.
6. Vorzugsweise Wählen Sie die "Rückzugs"-Kurve für die Analyse, weil sie weniger empfindlich auf Topographie als die "extend"-Kurve. Allerdings, wenn es erhebliche Verkleben der Sonde während des "Rückzugs", benutzen Sie die "verlängern"-Kurve, die unempfindlich gegenüber kleben ist.
7. Setdas Poisson-Verhältnis von 0,5. Drücken Sie auf zu analysieren und speichern Sie die Ausgabe.

Ergebnisse

In Abbildung 1 stellen wir typische Junge Module Karten Blütenmeristemen (1A und 1B), jung und alt Hypokotylen (1C-F) und Wurzelspitzen (1G und 1H). Bei allen Versuchen der Eindringkörper ist halbkugelförmig, aber seinen Radius unterscheidet, so dass verschiedene räumliche Auflösungen erreicht werden kann 1C und 1D zeigen typische Ergebnisse für meso-nanoskaligen Eindringkörper (...

Diskussion

In Pflanzen spielen wechselnden mechanischen Eigenschaften eine wichtige Rolle bei der Leitung Wachstum und Morphogenese. Bis heute hat es große Fortschritte in der Entschlüsselung der genetischen und chemischen Netzwerke, die das Pflanzenwachstum zu kontrollieren, aber unser Wissen, wie diese Netzwerke beitragen, und sind durch Veränderungen der mechanischen Eigenschaften betroffen ist rudimentär. Diese Methode sollte es uns ermöglichen, diese Lücke zu füllen, und so sollte es ein starkes Interesse an Wissenscha...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM	JPK	NanoWizard	All the 3-generation are able to do the work with the same preferment.
AFM stage	JPK	CellHesion	Required for sample with low topography (less than 11 µm between the lowest and the highest point in the area of force scanning).
AFM optics	JPK	Top View Optics	Very important in order to position the sample. Could be replaced by long range binoculars or a microscope.
Stereo microscope	Leica	M125	Any type of stereo microscope could do.
150 nm mounted cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	R150-NCL-10	To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use.
1 µm mounted cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	SD-Sphere-NCH-S-10	To measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis.
Tipless cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	TL-NCH-20	To measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5 µm mounted cantilever. We attached a 5 µm borosilicate bead to a tipless cantilever.
5 µm silicon microspheres	Corpuscular	C-SIO-5
Araldite	Bartik S.A. 77170 Coubet, France		Araldite for fixing the bead to the tipless cantilever.
Low melting agarose	Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410	BP160-100	34-45 °C gelation temperature
D-Mannitol	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA	M4125-500G
2 Stainless Steel No. 5 Tweezers	Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland	951199