Mapeamento baseado em AFM das propriedades elásticas de paredes celulares: em tecido, os celulares, e as Resoluções Subcelulares

Resumo

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Resumo

Nós descrevemos um método recentemente desenvolvido para medir as propriedades mecânicas das superfícies dos tecidos vegetais através de microscopia de força atômica (AFM) micro / nano-recuos, para um JPK AFM. Especificamente, neste protocolo medimos o módulo de Young aparente das paredes celulares em resoluções subcelulares em todas as regiões de até 100 mm x 100 mm em meristemas florais, hipocótilos e raízes. Isto requer uma preparação cuidadosa da amostra, a correta seleção de micro-penetradores e profundidades recuo. Para ter em conta as propriedades da parede celular só, as medições são realizadas em soluções altamente concentradas de manitol de modo a plasmolyze as células e, assim, remover a contribuição da pressão de turgescência celular.

Em contraste com outras técnicas existentes, por meio de diferentes penetradores e profundidades de entalhe, este método permite a medição simultânea multiscale, No entanto, várias limitações permanecem: o método pode ser usado apenas em relativamente pequenas amostras (cerca de 100 um de diâmetro) e apenas em tecidos externos; o método é sensível à topografia do tecido; ele mede apenas certos aspectos das propriedades mecânicas complexas do tecido. A técnica está a ser desenvolvida rapidamente e é provável que a maioria destas limitações sejam ultrapassadas em breve.

Introdução

Crescimento em plantas é conseguido pela expansão coordenada das paredes celulares rígidas que cercam cada uma e todas as células do organismo. Acumulando evidência indica que é através da modificação química da parede celular de plantas que controlar localmente essa expansão. A expansão é pensado para ser conduzido principalmente por pressão sobre as paredes das células, provocadas por uma elevada pressão de turgescência da célula; esta resposta de tensão para a pressão de turgescência é governada pelas propriedades mecânicas das paredes das células ^1. Pouco se sabe sobre estas propriedades mecânicas e como eles mudam durante o desenvolvimento. Além disso, pouco se sabe sobre a forma como estas propriedades mecânicas são controlados e se opiniões contribuir para alterar a química da parede celular de um modo que aparentemente é coordenado através de um tecido. Se quisermos compreender a relação entre as alterações químicas e mecânicas na parede celular das plantas durante o desenvolvimento e, finalmente, como essas interações microscópicas governar uma plantaO crescimento macroscópico, um método que pode controlar as propriedades mecânicas das paredes das células no desenvolvimento de órgãos à escala celular ou de tecido é necessária.

O método de microscopia de força atómica (AFM), descrito aqui, o qual é baseado em micrométricas ou nanométricas compressões de tecidos ou cavidades, foi desenvolvido para medir com precisão as características mecânicas de paredes celulares no desenvolvimento de órgãos simultaneamente com resoluções subcelulares e entre as regiões inteiras de tecido. Outros métodos têm uma resolução que é muito baixo ou muito alto: o extensômetro só é capaz de medir as propriedades mecânicas médias de um tecido inteiro na escala milimétrica ^2-4, numa escala que é, por exemplo muito grande para medir os primeiros eventos organogênese; o microindenter pode fazer medições em resolução subcelular em escala nanométrica, mas é restrita a medição células isoladas e não grupos de células ou órgãos ^5-7. Com a AFM, a exigirtecido d, celulares e subcelulares resoluções podem ser alcançados ^8-10. Recentemente, vários protocolos têm sido desenvolvidos especificamente para medir mecânica do tecido de plantas que também poderiam ser utilizados ^{11, 12.}

Vamos apresentar aqui como avaliar a elasticidade do tecido através da medição do módulo aparente de Young ^13.

O módulo de elasticidade é utilizada para descrever a rigidez de um material. Durante a pequena deformação a força necessária para deformar um material é proporcional à área de reentrância. O módulo de Young é este coeficiente. No caso de um material homogéneo contínuo com o mesmo coeficiente será medido, independentemente do tipo de recuo (tamanho e forma) mas mudará com a velocidade da medição. No caso de a estrutura complexa do tecido de plantas, temos observado até agora que a força é proporcional à deformação, permitindo a determinação deum coeficiente de proporcionalidade que chamamos "jovem módulo aparente". Em contraste a partir de meios contínuos nas plantas, este novo módulo aparente é sensível ao tamanho do recuo. Ele não corresponde ao novo módulos de uma parede celular puro. Ela descreve melhor a elasticidade do andaime da parede celular do tecido de.

Protocolo

1. Prepare lâminas de vidro para montagem Amostra

1. Prepare encaixar mídia agarose: 0,7% de agarose de baixa fusão em 10% manitol (em água).
2. Usando um instrumento de metal forte (por exemplo, ponta broca, cal), gravar uma área de 0,5 x 0,5 cm no centro de uma lâmina de vidro de microscopia. Ou em vez disso, colar um pequeno pedaço de lamela de vidro (cerca de 20 x 200 mm) para a lâmina de vidro com cola Araldite. NOTA: Este encrespa a superfície, a fim de facilitar a aderência da camada de agarose para assegurar que as varas de comunicação de agarose ou corrige para a corrediça. Este slide pode ser reutilizado.
3. Posicionar um gota de cerca de 20 ul de encaixar meios de agarose para a região gravada da placa de vidro. Isto dá uma película fina de agarose.
4. Guarde a lâmina de vidro em uma caixa úmido e esperar que os meios de comunicação de agarose solidificar.

2. Dissecando e montagem Amostras meristema

1. Microdissect meristemas para imagi confocalng: remover os botões florais, um por um a partir do tronco, puxando-os para baixo com uma pinça ultrafinas. É importante remover todos os botões florais até os brotos que não apresentam sépalas (isto é, o primórdio P1 ^14).
2. Usando uma lâmina de barbear ou a ponta da pinça, cortar o meristema para longe da haste. O corte deve ser paralela à região da superfície do meristema, que deve ser medida com a AFM. O ápice obtida deve estar entre 300 mm e 600 mM alto para caber sob a ponta do AFM.
3. Empurre o ápice no filme de meios de agarose preparado no passo 1.1.4. Escolha uma posição sobre a lâmina de vidro / agarose e empurre tal que o meristema é tanto diretamente em contato com a lâmina de vidro e se projeta para fora da agarose. É crucial para posicionar o meristema no agarose, nos poucos segundos que se seguem o seu corte a partir da haste. NOTA: Este é, a fim de impedir que o meristema da secagem. Nesta fase, o meristema estará de pé em um crack porque a agarose fracturado mediante a aplicação de pressão.
4. Prepare vários meristemas desta forma para a imagiologia de lote, proporcionando que eles têm a mesma altura e são posicionados inferior a 500 mm a partir de um outro sobre a corrediça. Mantenha os meristemas preparados na caixa úmido enquanto dissecar mais amostras.
   NOTA: Limita a variação proveniente da calibração. Idealmente, 2 amostras de cada condição pode ser preparado e medido de forma aleatória. Até o momento não há nenhum efeito observado de imagem em lote na medição (stress induzido resposta). Isto pode ser devido à diluição de moléculas de sinalização de stress no agar e / ou a solução de montagem. Em alternativa, a resposta ao estresse é o mesmo, independentemente da quantidade de amostra preparada.
5. Antes de passar para o próximo passo, certifique-se que a fronteira entre o meristema e os botões florais é seco. Se não, retire o excesso de água com papel de filtro. Isto deve impedir que na fase seguinte, que o derretidoagarose inunda a amostra devido às forças de capilaridade.
6. Com uma pipeta de 20 mL, adicione o suficiente derretido montagem agarose para preencher o crack criou no passo 1.2.3. e cercar cada meristema. A agarose deve atingir o nível da cicatriz do botão de flor removido (primórdio). Para alcançar este objectivo, pode ser necessário adicionar agarose em cada extremidade da fenda.
7. Quando a agarose é adicionado, ele vai rapidamente inundar o crack; utilizando a pipeta, chupar parte da montagem de agarose fundida para garantir que o meristema é o ponto mais alto da corrediça. Isto corrige o meristema de modo que não pode mover-se durante o exame.

3. Montagem amostras de raízes ou hipocótilo

1. Para raízes e hipocótilos, sem dissecção é necessário. No fina película de agarose na lâmina preparada, fazer um sulco ou diretamente acima de um etch no vidro ou ao longo de uma lamela de vidro. Posicione a raiz ou hipocótilo neste sulco garantindo que ele está em contato com ode vidro ao longo de todo o seu comprimento.
2. Antes de passar para o próximo passo, certifique-se de que a amostra é seca em sua superfície. Se não, retire o excesso de água com papel de filtro.
3. Adicionar derretido montagem agarose ao redor da amostra como no passo 1.2.6.

4. AFM Preparação e calibração de sensibilidade (para uma JPK NanoWizard AFM)

1. Montar um cantilever na AFM. O balanço deve ser montado com penetrador em forma redonda. O raio vai determinar a, y, z x resolução e a profundidade de penetração no qual a medição exacta poderia ser arquivados.
   1. Para fazer medições meso-escala nanométrica na superfície da epiderme, use um penetrador rodada 50 raio nm; para fazer medições de mesoescala, use um raio mM penetrador rodada 0,5; para fazer medições em microescala (através 2-3 células), use um penetrador rodada 2,5 mM raio.
2. Posicionar o laser na ponta do braço de suporte. Alinhar o laser para o meiodo captor através do espelho.
3. Coloque um copo limpo sob o AFM.
   NOTA: O seguinte é definido para transformar o sinal da posição do laser sobre o receptor de AFM em uma deformação do cantilever e, avaliando a constante do cantilever primavera, para traduzi-lo em uma força.
4. Aproximação com uma força-alvo "set point" de 1 V.
5. Selecione "espectroscopia de força". Faça um recorte, definindo o máximo de "set point em relação" a 2 V, o "estender velocidade" a 40 mM / seg, eo "comprimento z" de 5 mm.
6. A partir do menu "calibração manager", selecione a parte linear da curva para a frente para se ajustar à sensibilidade utilizando o botão "select ajuste faixa". O "ponto de ajuste relativa" deve ser transformado de "volt" para "meter".
7. A partir do menu "Gerenciador de calibração", selecionar "constante da mola" para avaliar a elasticity do cantilever usando flutuações térmicas. Pressione o botão "run" para obter o enredo densidade espectral do cantilever. Encontre o pico de ressonância com a freqüência mais baixa. Coloque-o usando o botão "selecionar ajuste faixa".
   NOTA 1: Para mais detalhes sobre o ajuste de flutuações térmicas, leia ¹⁵ Cook et al.
   NOTA 2: É preferível utilizar um método directo para avaliar a elasticidade do braço de suporte através de um braço de suporte de referência (ou material com rigidez conhecida). O usado aqui foi gentilmente doado por Atef Asnacios ^16.
8. Adicione 200 ml de solução de manitol a 10% sob a ponta do cantilever. Realinhar o laser para o meio do captador usando o espelho.
9. Recalibrar a sensibilidade: a partir do menu "calibração manager", clique no botão "desconhecido"; repita os passos 2.3 até 2.5.

. 5 Aquisição de Dados: Módulo Cartografia aparente de Young

1. Coloque as amostras montadas sob a AFM e adicionar uma gota de 500 mL de uma solução de manitol a 10% para a amostra. A solução de manitol plasmolyzes as células dentro de minutos.
2. Aproximação com uma força-alvo ("set point"), de 20 nN ("set point", não deve ser superior a 3 V)
3. Recuo com um "ponto de ajuste relativa" de 200 nN, um "estender velocidade" de 40 mM / s, e "comprimento z" de 5 mm.
4. Ajustar o "set point relativa", a fim de obter uma reentrância de 100 nm a 200 nm, para a montagem do cantilever ou 0,5 mm para o braço de suporte montado 1 mM / 5 um.
5. No modo de "mapeamento de força", selecione uma região para analisar: por meristemas, 70 mM x 70 mM com uma resolução ("pixels") de 64 x 64; para hipocótilos e das raízes, 100 um x 100 mm com uma resolução de 64 x 64.
6. Pressione Digitalizar para iniciar os experimentos. Salve a saída.

. 6 Análise de Dados: Cálculos aparente módulo de Young

1. Abra o arquivo de dados no software de análise de dados.
2. Selecione "processamento em lote" para aplicar a mesma análise para todas as curvas de um único mapa.
3. Seleccionar "corrigir a altura para a flexão do braço de suporte" de modo a extrair a profundidade de penetração.
4. Seleccionar "módulo de função ajuste de Young" que vai assumir a força é proporcional à área de reentrância. Defina a "forma tip" para parabólica para assumir que a forma é um recuo parabólica.
5. Indique o raio da ponta.
6. Escolha preferencialmente a curva "retract" para a análise, porque é menos sensível a topografia do que a curva "estender". No entanto, se há aderência significativa da sonda durante a "retração", use a curva "estender", que é insensível a degola.
7. Conjuntoa relação de Poisson para 0,5. Imprensa em analisar e salvar a saída.

Resultados

Na Figura 1 apresenta-se típicas Jovens mapas de módulos de meristemas florais (Figuras 1a e 1b), jovens e velhos hipocotiledonar (Figuras 1C-F) e meristema da raiz (Figura 1G e 1H). Em todos os experimentos o penetrador é hemisférica, mas seu raio é diferente, de modo que diferentes resoluções espaciais podem ser alcançados Figuras 1C e 1D mostram resultados típicos para penetradores meso-esca...

Discussão

Nas plantas, a mudança de propriedades mecânicas desempenham um papel importante na orientação do crescimento e morfogénese. Até à data, tem havido um grande progresso em desvendar as redes genéticas e químicas que controlam o crescimento das plantas, mas nosso conhecimento de como essas redes contribuem e são afetadas por mudanças nas propriedades mecânicas é rudimentar. Este método deve permitir-nos para preencher esta lacuna, e por isso deve ser de grande interesse para os cientistas que estudam qualque...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM	JPK	NanoWizard	All the 3-generation are able to do the work with the same preferment.
AFM stage	JPK	CellHesion	Required for sample with low topography (less than 11 µm between the lowest and the highest point in the area of force scanning).
AFM optics	JPK	Top View Optics	Very important in order to position the sample. Could be replaced by long range binoculars or a microscope.
Stereo microscope	Leica	M125	Any type of stereo microscope could do.
150 nm mounted cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	R150-NCL-10	To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use.
1 µm mounted cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	SD-Sphere-NCH-S-10	To measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis.
Tipless cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	TL-NCH-20	To measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5 µm mounted cantilever. We attached a 5 µm borosilicate bead to a tipless cantilever.
5 µm silicon microspheres	Corpuscular	C-SIO-5
Araldite	Bartik S.A. 77170 Coubet, France		Araldite for fixing the bead to the tipless cantilever.
Low melting agarose	Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410	BP160-100	34-45 °C gelation temperature
D-Mannitol	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA	M4125-500G
2 Stainless Steel No. 5 Tweezers	Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland	951199