Hücre Duvarları Elastik Özelliklerinin AFM-tabanlı Haritalama: doku, hücresel ve Subselüler Çözünürlüklerde

Özet

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Özet

Biz bir JPK AFM için, atomik kuvvet mikroskobu (AFM) mikro / nano-çentikler kullanılarak bitki dokularının yüzeylerinin mekanik özelliklerini ölçmek için yeni geliştirilmiş bir yöntem açıklanmaktadır. Özellikle, bu protokolde, çiçek meristemler, hipokotiller, ve köklerde x 100 um kadar 100 um'lik bölgeler arasında hücre içi çözünürlüklerde hücre duvarlarının belirgin Young modülüne ölçün. Bu numunenin dikkatli hazırlanması, mikro-indenters ve girinti derinliklerinde doğru seçimi gerektirir. Sadece, ölçümler hücreleri plazmolize ve böylece hücre turgor basınç katkı çıkarmak için manitol yüksek ölçüde konsantre çözeltiler içinde gerçekleştirilen hücre duvarı özellikleri hesaba katılması için.

Diğer kaybolmamış tekniklerin aksine, farklı çentikleri ve girinti derinliği kullanılarak, bu yöntem, aynı anda çok ölçekli ölçümleri sağlar: Ancak, bazı sınırlamalar kalır: bu yöntem sadece (100 çapı um civarında) ve bu dış dokularda oldukça küçük numuneler üzerinde kullanılabilir; yöntem, doku topografya duyarlıdır; bu dokusunun karmaşık mekanik özelliklerinin sadece bazı yönlerini ölçer. Teknik hızla geliştirilmektedir ve bu sınırlamalar çoğu yakın gelecekte çözüleceğini olasıdır.

Giriş

Bitkilerde büyüme organizmanın her hücre çevreleyen sert hücre duvarlarının koordineli genişlemesi ile elde edilir. Giderek artan kanıtlar bu bitkiler, yerel olarak, bu genişleme kontrol eden hücre duvarı kimyanın tadilatı yoluyla olduğunu gösterir. Genişleme hücrenin yüksek turgor basıncının neden olduğu hücre duvarları, üzerinde yük öncelikle tahrik olması düşünülmektedir; turgor basıncına bu gerginlik tepkisi hücre duvarlarının ^1'in mekanik özellikleri tarafından yönetilir. Küçük bu mekanik özellikleri bilinen ve geliştirme sırasında nasıl değiştiğini. Ayrıca biraz bu mekanik özellikleri geribildirimler görünüşte bir doku boyunca koordineli bir şekilde hücre duvarı kimyasını değiştirmeye katkısı olup olmadığını kontrol edilir ve nasıl bilinir. Biz kimyasal ve mekanik gelişimi sırasında bitki hücre duvarlarında değişiklikler ve sonuçta nasıl bu mikroskobik etkileşimlerin bir bitkiyi yöneten arasındaki bağlantıyı anlamak için ise'In makroskopik büyümesi, hücre ya da doku ölçeğinde organları geliştirilmesinde hücre çeperlerinin mekanik özelliklerini izlemek için bir yöntem gereklidir.

Atomik kuvvet mikroskobu (AFM) yöntemi mikrometre veya nanometre doku sıkıştırmasından ya da çentikler dayandığı, burada anlatılan, subselüler çözünürlüklerde aynı anda organları gelişmekte ve doku tüm bölgeler arasında hücre duvarlarının mekanik özelliklerini ölçmek için tam geliştirilmiştir. Diğer yöntemler var ya çok düşük ya da çok yüksek bir çözünürlük: Ekstansometrelerin milimetre ölçeğinde ^2-4, erken olayları ölçmek için çok büyük örneğin bir ölçekte tüm doku ortalama mekanik özelliklerini ölçmek için sadece yapabiliyor Organogenezis; microindenter nanometre ölçeğinde hücre içi çözünürlükte ölçümlerini, ancak izole edilmiş hücreler olup hücre ya da organların ^5-7 gruplarının ölçümü ile sınırlandırılmıştır. AFM ile, ihtiyaçd doku, hücre ve hücre içi çözünürlükleri ^8-10 elde edilebilir. Son zamanlarda çok sayıda protokolleri de ^{11, 12,} kullanılabilecek bitki doku mekanik ölçmek için özel olarak geliştirilmiştir.

Biz, belirgin Young modülü ¹³ ölçü dokuya elastikiyetini değerlendirmek nasıl burada sunacaktır.

Young modülü, genellikle bir malzemenin sertliğini tarif etmek için kullanılır. Küçük deformasyon esnasında bir malzemenin deforme edilmesi için gerekli kuvvet girinti alanı ile orantılıdır. Young modülü, bu katsayısıdır. Sürekli bir homojen madde durumunda, aynı katsayısı ne olursa olsun girinti tipi (boyut ve şekil) içinde ölçülür, ancak ölçüm hızı ile değişecektir. Bitki dokusunun bir kompleks yapının durumunda, şimdiye kadar kuvvet belirlenmesini sağlayan bir deformasyon orantılı olduğunu gözlemledikbiz "belirgin genç modülü" adını bir orantılılık katsayısı. Bitkilerde sürekli akışkanda ikinci Bunun aksine, bu bariz genç modülü girinti boyutuna duyarlıdır. Bu saf hücre duvarının genç modülünün karşılık gelmez. Bu, en iyi doku hücre duvarının iskele elastikiyetini açıklar.

Protokol

1.. Örnek Montaj için cam slaytlar hazırlayın

1. Agaroz ortam gömülmesinin hazırlanması:% 10 manitol (su içinde) içinde% 0.7 düşük erime noktalı agaroz.
2. Güçlü bir metal alet (örneğin matkap ucu, kireç) kullanılarak, bir mikroskop cam slayt merkezinde 0.5 x 0.5 cm bölgeyi etch. Veya bunun yerine, Araldite yapıştırıcı kullanarak cam slayt cam yapraklardan (yaklaşık 20 x 200 mm) küçük bir parça tutkal. Not: Bu sağlamak için agaroz yapışmasını kolaylaştırmak amacıyla yüzeyi pürüzlü olduğu slayt agaroz ortam çubukları ya da giderir. Bu slayt yeniden kullanılabilir.
3. Cam slayt kazınmış bölge üzerine agaroz ortam gömülmesinin yaklaşık 20 | il bir damlacık yerleştirin. Bu agaroz ince bir film oluşturur.
4. Nemli bir kutu içinde cam slayt saklayın ve agaroz medya katılaşması için bekleyin.

2.. Meristem Örnekleri Diseksiyon ve Montaj

1. Konfokal IMAGI için Microdissect meristemlering: ultra ince cımbız ile onları aşağı çekerek sapından çiçek tomurcukları tek tek kaldırın. Bu (P1 primordia ¹⁴ yani) sepals ememeyen tomurcukları tüm çiçek tomurcukları kadar kaldırmak için önemlidir.
2. Bir jilet veya cımbız ucu kullanarak, uzak sapından meristemi kesti. Kesilen AFM ile ölçülecek olan meristem yüzeyinin bölgesine paralel olmalıdır. Elde edilen apeks 300 um ve AFM ucu altında uygun yüksek 600 mm arasında olmalıdır.
3. Aşama 1.1.4 hazırlanan agaroz ortam filmin içine tepe itin. Cam slayt / agaroz bir pozisyon seçin ve meristem cam slayt ile temas hem de doğrudan ve agarozdan dışarı çıkıntı nazikçe böyle itin. Bu kök onun kesim takip birkaç saniye içinde agaroz meristemi konumlandırmak için çok önemlidir. Not: Bu kurutma gelen meristemi önlemek için olan. Bu aşamada, bir meristem CRAC ayakta edilecektirAgaroz basınç uygulanması üzerine kırık nedeniyle k.
4. Onlar aynı yükseklikte ve tek slaytta diğerinden az 500 mikron konumlandırılmış şartıyla, birkaç meristemleri toplu görüntüleme için bu şekilde hazırlayın. Bundan başka örnekleri kesme sırasında nemli kutu içinde hazırlanan meristemleri tutun.
   NOT: Bu kalibrasyon gelen değişimi sınırlayan. Her durumda, ideal olarak 2 örnekler hazırlanmış ve rasgele ölçülebilir. Şimdiye kadar ölçüm (stres kaynaklı cevap) toplu görüntüleme gözlenen herhangi bir etkisi yoktur. Bu agar ve / veya montaj çözelti içinde stres sinyal molekülleri seyreltme sayesinde olabilir. Alternatif olarak, stres tepkisi ne olursa olsun, hazırlanmış bir numune miktarı aynıdır.
5. Bir sonraki adıma geçmeden önce, meristem ve çiçek tomurcukları arasındaki sınır kuru olduğundan emin olun. Değilse, hafifçe filtre kağıdı kullanılarak fazla su çıkarmak. Bu erimiş bir sonraki aşamada engellemelidiragaroz nedeniyle kapillarite kuvvetlere örnek sel.
6. 20 ul pipet ile, eklemek yeterli adım 1.2.3 oluşturulan çatlak doldurmak için agaroz montaj eridi. ve her bir meristemi çevreleyen. Agaroz kaldırılan çiçek tomurcuğu (primordium) ve skar seviyesine ulaşmak gerekir. Bu amaca ulaşmak için, bu çatlak her iki ucunda da agaroz eklemek için gerekli olabilir.
7. Agaroz ilave edildiğinde, hızla çatlak içine sel olacak; pipet kullanarak, meristem slaytta en yüksek noktası olmasını sağlamak için agaroz montaj erimiş kısmını emmek. Bu görüntüleme sırasında hareket edemez, böylece bu meristemi giderir.

3.. Montaj Kök veya Hipokotil Örnekleri

1. Kökler ve hipokotiller, hiç diseksiyon gereklidir. Hazırlanan cam slayt üzerinde agaroz ince bir film olarak, doğrudan cam üzerinde olan asit ya da bir cam lamel üzerinde ya da bir oluk yapmak. Bu temas halinde olduğu bu sağlanan bir oluk içinde kök veya hipokotil yerleştirinonun bütün uzunluğu boyunca cam.
2. Bir sonraki adıma geçmeden önce, numune yüzeyinde kuru olduğundan emin olun. Eğer değilse, hafifçe filtre kağıdı kullanılarak suyun fazlası uzaklaştırıldı.
3. 1.2.6 ekleme aşamasında olduğu gibi, numune etrafında monte agaroz eritilir.

4. AFM Hazırlama ve Hassasiyet Kalibrasyon (bir JPK Nanowizard AFM için)

1. AFM üzerinde bir dirsek monte edin. Konsol yuvarlak indenter ile monte edilmelidir. Yarıçapı x, y, z çözünürlük ve hassas ölçüm arşivlenmiş olabilir hangi girinti derinliği belirleyecek.
   1. Epidermisteki yüzeyindeki mezo-nano ölçümler almak için, bir 50 nm yarıçaplı yuvarlak dişinin kullanın; , orta ölçek ölçümleri almak 0.5 mikron yarıçaplı yuvarlak dişinin kullanmak için; (2-3 hücreleri arasında) mikro ölçümler almak için, 2.5 mikron yarıçaplı yuvarlak dişinin kullanın.
2. Konsol ucundaki lazer yerleştirin. Orta lazer hizalamaayna kullanarak captor.
3. AFM altında temiz bir bardak yerleştirin.
   NOT: Aşağıdaki konsol bir deformasyon içine AFM reseptörü üzerindeki lazer pozisyonun sinyalini dönüştürmek için ayarlanır ve bir güç haline çevirmek için, konsolun yay sabiti değerlendirerek edilir.
4. 1 V. hedef kuvvet "set point" ile yaklaşım
5. "Force spektroskopi" seçeneğini seçin. 2 V maksimal "göreli noktası" ayarlayarak bir girinti yapmak, 40 mikron / sn "hız genişletmek", ve 5 um için "z uzunluk".
6. "Kalibrasyon Yöneticisi" menüsünden "fit aralığını seçin" düğmesini kullanarak hassasiyeti sığdırmak için öne eğrisinin doğrusal bölümünü seçin. "Göreli set point" "metre" ile "volt" dönüştürülmüş olmalıdır.
7. "Kalibrasyon Yöneticisi" menüsünden EL değerlendirmek için "yay sabiti" seçiniztermal dalgalanmalar kullanarak Konsolun asticity. Konsolun spektral yoğunluk arsa almak için Basın "run". Düşük frekans ile rezonans pik bulun. "Fit aralığını seçin" düğmesini kullanarak takınız.
   NOT 1:. Termal dalgalanmalar ayarlama hakkında daha fazla bilgi için, Cook ve ark ¹⁵ okundu
   Not 2: (bilinen sertlik ya da malzeme), bir referans konsol ile konsol elastikiyetini değerlendirmek için doğrudan bir yöntemi kullanmak için tercih edilir. Burada kullanılan nazik birini Atef Asnacios ¹⁶ tarafından bağışlanmıştır.
8. Konsol ucu altında% 10 mannitol çözeltisi 200 ul ekleyin. Ayna kullanarak captor ortasına lazer hizalayın.
9. Hassasiyetini yeniden kalibre: "kalibrasyon Yöneticisi" menüsünden, "bilinmeyen" butonuna tıklayın; tekrar 2.5 ile 2.3 adım.

. 5 Veri Toplama: Görünen Young Modülü Haritacılık

1. AFM altına monte edilen örnekleri yerleştirin ve numune üzerine,% 10 mannitol bir solüsyon 500 ul damlacık ekleyin. Mannitol solüsyon birkaç dakika içinde hücreleri plasmolyzes.
2. 20 nN hedef kuvveti ("noktasını ayarlamak") ile yaklaşım ("set point" fazla 3 V olmamalıdır)
3. 200 nN bir "göreli set noktası" olan girinti, bir 40 mm / sn "hız uzatmak", ve 5 mikron "z uzunluğu".
4. Konsol ya da 1 mm / 5 um monte konsol 0.5 um monte nm 200 için 100 nm bir çentik elde etmek üzere "nispi noktası" ayarlayın.
5. , Meristemlerde için, bir çözünürlük 64 x 64 ("piksel") ile 70 mikron x 70 mikron: "force haritalama" modunda taramak için bir bölge seçin hipokotillerinden ve kökleri için, 64 x 64 çözünürlüğe sahip 100 mikron x 100 mm.
6. Basın deneyler başlatmak için tarayın. Çıktısını kaydetmek.

. 6. Veri Analizi: Görünen Young Modülü Hesaplamalar

1. Veri analiz yazılımı veri dosyasını açın.
2. Tek bir harita tüm eğrileri aynı analizi uygulamak için "toplu işlem" seçeneğini seçin.
3. Böylece girinti derinliği ayıklamak için "konsolun bükme için yüksekliği düzeltmek" seçeneğini seçin.
4. Kuvvet girinti alanı ile orantılıdır üstlenecek "Young modülü uyum fonksiyonunu" seçeneğini seçin. Girinti şekli parabolik olduğunu varsaymak için parabolik "ucu şekli" olarak ayarlayın.
5. Uç yarıçapını gösterir.
6. O "genişletmek" eğri daha topografya daha az duyarlı olduğu için tercihen analizi için "geri çekme" eğrisi seçin. Prob önemli yapışma sırasında Ancak, eğer "geri çekme," yapıştırma duyarsız "genişletmek" eğrisi, kullanın.
7. Set0,5 Poisson oranıdır. Basın üzerinde analiz ve çıkış kaydedin.

Sonuçlar

Şekil 1 de çiçek Meristemlere tipik Genç modülleri haritalar (Şekil 1A ve 1B), genç ve yaşlı hipokotilleri (Şekil 1C-F) ve kök meristem (Şekil 1G ve 1H) sunuyoruz. Tüm deneylerde delici yarı-küresel, ancak farklı uzamsal çözünürlük elde edilebilir, böylece bunun radius farklıdır 1C ve 1D meso-nano girinti (50 nm derinlik) meso-nano indenters (50 nm çapında) iç...

Tartışmalar

Bitkilerde, değişen mekanik özellikler büyüme ve morfolojilerinden yönlendirilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Bugüne kadar orada bitki gelişimini kontrol genetik ve kimyasal ağları çözülüyor büyük ilerlemeler kaydedilmiş, ancak bu ağlar katkı ve mekanik özelliklerindeki değişikliklerden nasıl etkilendiğini bilgimiz ilkel gelmiştir. Bu yöntem, bu boşluğu doldurmak için bize imkan vermelidir, ve bu yüzden bitki büyümesi veya morfojenesis'in herhangi bir yönünü inceleyen bilimc...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM	JPK	NanoWizard	All the 3-generation are able to do the work with the same preferment.
AFM stage	JPK	CellHesion	Required for sample with low topography (less than 11 µm between the lowest and the highest point in the area of force scanning).
AFM optics	JPK	Top View Optics	Very important in order to position the sample. Could be replaced by long range binoculars or a microscope.
Stereo microscope	Leica	M125	Any type of stereo microscope could do.
150 nm mounted cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	R150-NCL-10	To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use.
1 µm mounted cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	SD-Sphere-NCH-S-10	To measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis.
Tipless cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	TL-NCH-20	To measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5 µm mounted cantilever. We attached a 5 µm borosilicate bead to a tipless cantilever.
5 µm silicon microspheres	Corpuscular	C-SIO-5
Araldite	Bartik S.A. 77170 Coubet, France		Araldite for fixing the bead to the tipless cantilever.
Low melting agarose	Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410	BP160-100	34-45 °C gelation temperature
D-Mannitol	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA	M4125-500G
2 Stainless Steel No. 5 Tweezers	Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland	951199