АСМ на основе карт из упругих свойств клеточных стенок: на ткани, клеточном, и субклеточных резолюций

Резюме

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Аннотация

Мы описываем недавно разработанный метод для измерения механических свойств поверхностей растительных тканей с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) микро / нано-углублений, для JPK АСМ. В частности, в этом протоколе мы измеряем модуль кажущейся Юнга клеточных стенок в субклеточных резолюций по регионам до 100 мкм х 100 мкм в цветочных меристем, гипокотиля и корней. Это требует тщательной подготовки образца, правильный выбор микро-инденторами и глубины отступа. Для учета клеточной стенки свойств только, измерения проводятся в высококонцентрированных растворов маннита для того, чтобы плазмолиз клетки и таким образом снять вклад давления клеток тургор.

В отличие от других существующих методов, с помощью различных инденторами и глубины отступа, этот метод позволяет проводить измерения одновременное многомасштабных, Тем не менее, остаются некоторые ограничения: метод может быть использован только на довольно небольших образцов (около 100 мкм в диаметре), и только на внешних тканей; метод чувствителен к ткани топографии; он измеряет лишь некоторые аспекты сложных механических свойств ткани в. Техника в настоящее время быстро развивается, и вполне вероятно, что большинство из этих ограничений будут решены в ближайшее время.

Введение

Рост растений достигается за счет согласованного расширения жестких клеточных стенок, которые окружают каждую ячейку организма. Количество фактов говорит о том, что в результате изменения химии клеточной стенки, что растения локально контролировать это расширение. Расширение, как полагают, в основном за счет деформации на клеточных стенках, вызванные высоким давлением тургор клетки; этот штамм ответ на давление тургора регулируется механических свойств клеточных стенок ^1. Мало что известно о этих механических свойств и как они изменяются в процессе разработки. Кроме того мало известно о том, как эти механические свойства контролируются и способствовать ли обратные изменить химию клеточной стенки таким образом, что, по-видимому скоординированных через ткань. Если мы хотим понять связь между химическим и механическим изменениям в клеточных стенок растений в процессе разработки, и, в конечном счете, как эти микроскопические взаимодействия регулируют завод'Ы макроскопического рост, метод, который может контролировать механические свойства клеточных стенок в развивающихся органы на клеточном или ткани масштабе требуется.

Метод атомно-силовой микроскопии (АСМ), описанный здесь, в основе которого лежит микрометра или нанометровых сжатий ткани или углублений, была разработана именно для измерения механических свойств клеточных стенок в развивающихся органы одновременно в субклеточных резолюций и через целых регионов ткани. Другие методы имеют либо разрешение, что слишком низкая или слишком высокая: экстензометр только в состоянии измерить средние механические свойства целого ткани в миллиметровом масштабе ^2-4, в масштабе, который является, например слишком большой для измерения ранние события в органогенез; microindenter может проводить измерения на субклеточном разрешением в нанометровом масштабе, но она ограничена измерения изолированных клеток и не группы клеток или органов ^5-7. С АСМ, требуютг ткани, клеточном, и субклеточных резолюции может быть достигнуто ^8-10. Недавно несколько протоколов были разработаны специально для измерения механику растений ткани, которые также могут быть использованы ^{11, 12.}

Мы представим здесь, как оценить эластичность ткани через измерения модуля кажущейся Юнга ^13.

Модуль упругости обычно используется для описания жесткость материала. В малой деформации усилие, необходимое для деформации материала пропорциональна площади отступа. Юнга это коэффициент. В случае непрерывного однородного материала такой же коэффициент будет измеряться независимо от типа отпечатка (размер и форма), но будет изменяться со скоростью измерения. В случае сложной структуры ткани растений, мы наблюдали до сих пор, что сила пропорциональна деформации, позволяющей определитькоэффициент пропорциональности, что мы называем "Видимая Юнга". В отличие от непрерывных средств массовой информации на заводах, это очевидно модуль Юнга чувствителен к размеру отступа. Это не соответствует молодого модулей чистого клеточной стенки. Это лучше всего описывает упругость лесов клеточной стенки ткани.

протокол

1. Подготовьте предметные стекла для монтажа Пример

1. Подготовка вложения агарозном СМИ: 0,7% низкий агарозы плавления в 10% маннита (в воде).
2. Использование сильный металлический инструмент (например, буровой наконечник лайма), гравировать на см площадь 0,5 х 0,5 в центре микроскопии стекло. Или наоборот, склеить небольшой кусочек стекла ламели (около 20 х 200 мкм) на стекло с помощью Araldite клей. Примечание: Этот придает шероховатость поверхности, чтобы облегчить адгезию агарозы для того, чтобы агарозы палочки медиа или исправлять слайда. На этом слайде можно использовать повторно.
3. Поместите капельку объемом приблизительно 20 мкл вложения в агарозном носитель на протравленной области предметное стекло. Это дает тонкий слой агарозы.
4. Храните предметное стекло в влажной камере и ждать агарозные СМИ затвердеть.

2. Пройдя и монтаж меристема Образцы

1. Microdissect меристемы для конфокальной томографовнг: вынуть цветочных бутонов по одному из ствола, потянув их вниз с ультра тонких пинцетом. Важно, чтобы удалить все цветочных бутонов до бутонов, которые не проявляют чашелистики (т.е. P1 зачатков ^14).
2. Использование лезвия бритвы или кончик пинцетом, сократить меристему от стебля. Срез должен быть параллелен области поверхности меристемы, которая должна быть измерена с АСМ. Полученный вершина должна быть между 300 мкм и 600 мкм высокой, чтобы соответствовать под иглой АСМ.
3. Нажмите вершины в пленку геле СМИ, подготовленных на этапе 1.1.4. Выберите позицию на стекле / агарозы и осторожно нажмите таким образом, что меристема как непосредственно в контакте с стекло и выступает из агарозы. Очень важно, чтобы расположить меристему в агарозы в течение нескольких секунд, которые следуют его разрез от стебля. Примечание: Это делается для того, чтобы предотвратить меристемы от сушки. На данном этапе, меристема будет стоять в КРАУМК потому что агарозы перелом от применения давления.
4. Подготовить несколько меристемы этот способ для пакетной обработки изображений, при условии, что они имеют одинаковую высоту и расположены менее 500 мкм друг от друга на слайде. Держите приготовленные меристем в влажной камере в то время рассечения дополнительные образцы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это ограничивает вариацию, идущий от калибровки. В идеале 2 образцы каждого условия могут быть подготовлены и измеряется в случайном порядке. До сих пор нет наблюдаемый эффект пакетном изображений на измерении (стресс, вызванный ответа). Это может быть благодаря разбавления стресса сигнальных молекул в агаре и / или монтажной раствора. Альтернативно реакция на стресс является той же, независимо от количества образца, полученного.
5. Прежде чем перейти к следующему шагу, убедитесь, что граница между меристемы и цветочных бутонов сухая. Если нет, то аккуратно удалите излишки воды, используя фильтровальную бумагу. Это должно предотвратить на следующем этапе, что расплавленныйагарозном заливает образец из-за капиллярности сил.
6. С 20 мкл пипетки, добавить достаточно растаял монтажа агарозы заполнить трещины, созданной на шаге 1.2.3. и окружить каждый меристему. Агарозу должны выйти на уровень шрам от удаленной бутон цветка (зачаток). Чтобы достичь этого, это может быть необходимо добавить агарозы на каждом конце трещины.
7. Когда агарозном добавляется, он будет быстро залить в трещину; с помощью пипетки, отсасывать часть расплавленный монтажа агарозы для того, чтобы меристема является самой высокой точкой на слайде. Это фиксирует меристемы так, что она не может двигаться во время съемки.

3. Монтажные Главные или гипокотиля Образцы

1. Для корней и гипокотиля, не рассечение не требуется. В тонкой пленке агарозы на подготовленном стекло, делают канавку либо непосредственно выше травления в стекле или вдоль стеклянной пластинки. Расположите корень или гипокотиль в эту канавку гарантируя, что он находится в контакте сстекло по всей ее длине.
2. Прежде чем перейти к следующему шагу, убедитесь, что образец сухой на ее поверхности. Если нет, то аккуратно удалите избыток воды с использованием фильтровальной бумаги.
3. Добавить растаял монтажа агарозном вокруг образца, как в пункте 1.2.6.

4. АСМ Подготовка и чувствительности Калибровка (для JPK NanoWizard АСМ)

1. Установите кантилевера на АСМ. Консольные должен быть установлен с круглой формой индентора. Радиус определит х, у, разрешение г и глубину вдавливания, при котором точное измерение может быть в архиве.
   1. Для того, чтобы мезо-наноразмерных измерения на поверхности эпидермиса, используйте радиус 50 нм круглый индентора; принять мезомасштабные измерений, используйте радиус мкм круглый индентора 0,5; принять микромасштабной измерения (через 2-3 клеток), используйте радиус 2,5 мкм круглый индентора.
2. Позиционировать лазер на кончике кантилевера. Совместите лазер к серединеиз похитителя с помощью зеркала.
3. Установите чистый стакан под АСМ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: следующие установлен для преобразования сигнала в положение лазерного на рецептор АСМ в деформации кантилевера и, по оценке жесткости пружины кантилевера, чтобы перевести его в силу.
4. Подход с целевой силы "уставки" 1 В.
5. Выберите "силовой спектроскопии". У углубление, установив максимальный "относительно уставки" до 2 V, "расширить скорость" до 40 мкм / сек, а "длина г" до 5 мкм.
6. В меню "калибровка менеджер", выберите линейную часть форвардной кривой, чтобы соответствовать чувствительности, используя кнопку "выберите пункт по размеру диапазон". «Относительная уставки" должны быть преобразованы из "вольт" на "метр".
7. В меню "менеджер калибровка" выберите "жесткости пружины", чтобы оценить Эльasticity кантилевера с использованием тепловые флуктуации. Нажмите кнопку "Выполнить", чтобы получить спектральную плотность участок кантилевера. Найдите резонансный пик с минимальной частоты. Установите его с помощью кнопки "выберите пункт по размеру диапазон".
   ПРИМЕЧАНИЕ 1: Для более подробной информации о настройке тепловых флуктуаций, читать Кук и др. ^15.
   Примечание 2: Предпочтительно использовать прямой метод, чтобы оценить упругость кантилевера с использованием опорного кантилевера (или материала с известной жесткостью). Тот, используется здесь был любезно пожертвован Атеф Asnacios ^16.
8. Добавить 200 мкл 10% раствора маннита в соответствии с кантилевера. Realign лазер на середине похититель с помощью зеркала.
9. Перекалибруйте чувствительность: из меню "калибровка менеджер", нажать на кнопку «неизвестного»; повторите шаги 2,3 до 2,5.

. 5 Сбор данных: кажущихся Модуль Юнга картографии

1. Разместите запрессованных образцов под АСМ и добавить 500 мкл каплю 10% раствора маннитола на образец. Раствор маннита plasmolyzes клетки в течение нескольких минут.
2. Подход с целевой силы ("поставлена ​​точка") от 20 нн ("установить точки" не должно быть более 3 В)
3. Отступ с "относительно уставки" 200 нн, "расширить скорость" 40 мкм / сек, а "длина г" 5 мкм.
4. Отрегулируйте "относительно уставки" для того, чтобы получить отступ 100 нм для 200 нм, установленного кантилевера или 0,5 мкм для смонтированном кантилевера 1 мкм / 5 мкм.
5. В режиме "отображения сила", выберите регион для сканирования: для меристем, 70 мкм х 70 мкм с разрешением ("пикселов") из 64 х 64; для гипокотиля и корней, 100 мкм х 100 мкм с разрешением 64 х 64.
6. Пресс сканировать запустить эксперименты. Сохраните выход.

. 6 Анализ данных: Модуль упругости Расчеты кажущихся Юнга

1. Откройте файл данных в программное обеспечение для анализа данных.
2. Выберите "пакетную обработку", чтобы применить тот же анализ для всех кривых одной карте.
3. Выберите "корректировки высоты для изгиба кантилевера" так, чтобы извлечь глубину вдавливания.
4. Выберите "модуль подходят функцию Юнга", что возьмет на себя сила пропорциональна площади отпечатка. Установите "Tip Shape", чтобы параболических предположить, что форма отступ является параболической.
5. Укажите радиус чаевых.
6. Выберите преимущественно в "втягивания" кривую для анализа, потому что это менее чувствительны к топографии, чем кривая "продлить". Однако, если существует значительное прилипание зонда во время "ретракта" использовать "продлить" кривую, которая является нечувствительным к прилипание.
7. Наборкоэффициент Пуассона 0.5. Нажмите на анализ и сохранить результат.

Результаты

На рисунке 1 мы приводим типичные значения модуля Юнга карты цветочными меристем (рис. 1a и 1b), молодые и старые гипокотили (рис. 1С-F), и корневой меристемы (рис. 1G и 1Н). Во всех экспериментах индентора полусферической, но его радиус отличается те...

Обсуждение

В растениях, изменение механических свойств играют важную роль в направляя рост и морфогенез. На сегодняшний день наблюдается большой прогресс в разгадке генетические и химические сетей, которые контролируют рост растений, но наши знания о том, как эти сети способствуют и зависят от и?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM	JPK	NanoWizard	All the 3-generation are able to do the work with the same preferment.
AFM stage	JPK	CellHesion	Required for sample with low topography (less than 11 µm between the lowest and the highest point in the area of force scanning).
AFM optics	JPK	Top View Optics	Very important in order to position the sample. Could be replaced by long range binoculars or a microscope.
Stereo microscope	Leica	M125	Any type of stereo microscope could do.
150 nm mounted cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	R150-NCL-10	To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use.
1 µm mounted cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	SD-Sphere-NCH-S-10	To measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis.
Tipless cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	TL-NCH-20	To measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5 µm mounted cantilever. We attached a 5 µm borosilicate bead to a tipless cantilever.
5 µm silicon microspheres	Corpuscular	C-SIO-5
Araldite	Bartik S.A. 77170 Coubet, France		Araldite for fixing the bead to the tipless cantilever.
Low melting agarose	Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410	BP160-100	34-45 °C gelation temperature
D-Mannitol	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA	M4125-500G
2 Stainless Steel No. 5 Tweezers	Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland	951199