细胞壁的弹性性能的原子力显微镜为基础的映射:在组织，细胞，亚细胞和决议

摘要

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

摘要

我们描述了一种最近开发的方法来测量植物组织的表面的机械特性使用原子力显微镜（AFM）的微/纳米压痕，要JPK原子力显微镜。具体来说，在这个协议中，我们测量视杨氏模量的细胞壁在跨区域的亚细胞分辨率可达100 微米 ×100微米花分生组织，下胚轴和根。这需要精心准备的样品，正确选用微压头和压痕深度。只占，测量在甘露醇的高度浓缩的溶液以质壁分离的细胞中，从而除去细胞膨压的贡献进行细胞壁的属性。

相对于其他现存的技术，通过使用不同的压头和压痕深度，该方法允许同时多尺度测量然而，一些局限性依然存在:该方法只能用于在相当小的样品（大约100μm直径），并且只在外部组织;该方法是将组织形貌敏感;它测量的组织复杂的机械特性只有某些方面。该技术正在迅速发展，很可能大多数的这些限制将在不久的将来得到解决。

引言

在植物生长受周围的生物体的每一个细胞的刚性细胞壁的协调扩张来实现。越来越多的证据表明它是通过细胞壁化学修饰的植物局部控制这种膨胀。膨胀被认为是主要受应变的细胞壁，引起细胞的高膨压上;此应变响应膨压是由细胞壁¹的机械性能约束。鲜为人知的是，这些机械性能和他们在开发过程中如何变化。而且很少有人知道如何将这些机械性能的控制和反馈是否有助于改变细胞壁化学在显然是跨组织协调的方式。如果我们要了解发育过程中植物细胞壁的化学和机械变化，最终如何将这些微观相互作用支配植物之间的连接的宏观增长，一个是可以监控的细胞壁中，在细胞或组织规模发展器官的机械性能的方法是必需的。

这里的原子力显微镜（AFM）所描述的方法，它是基于微米或纳米级组织的压缩或压痕，开发了精确测量的细胞壁中的亚细胞分辨率同时显影机构和跨组织的整个区域的机械性能。其他的方法有两种，分辨率太低或太高:引伸计仅能够在毫米尺度^2-4，其规模是例如过大而无法 ​​测量中的早期事件，以测量整个组织的平均机械性能器官;该microindenter可以进行测量以在纳米尺度的亚细胞的分辨率，但它被限制在测定分离的细胞，而不是细胞或器官^5-7的基团。用原子力显微镜的要求三维组织，细胞，亚细胞分辨率可达到^8-10。最近几个协议已被开发专门用于测量植物组织中，可能也可用于^11，12的结构。

我们将在这里介绍了如何通过表观杨氏模¹³的测量评估组织的弹性。

杨氏模量通常是用来描述材料的刚度。在小变形而变形的材料所需要的力是正比于压痕的面积。杨氏模量是该系数。在一个连续的均匀的材料的情况下相同的系数将被考虑的缩进类型（大小和形状）的测定，但将与所述测量的速度发生变化。在植物组织中的复杂结构的情况下，我们观察到，到目前为止，该力正比于该变形容许的确定比例系数，我们命名为"表观杨氏模量"。在从连续媒体中的植物相比，这明显的杨氏模量是压痕的大小敏感。它不对应于一个纯细胞壁的年轻模量。它最能说明细胞壁组织的脚手架的弹性。

研究方案

1，准备玻璃幻灯片的安装示例

1. 准备嵌入琼脂糖介质:10％甘露糖醇（在水中）0.7％低熔点琼脂糖。
2. 使用强金属工具（ 如钻头尖，酸橙），蚀刻出一0.5×0.5厘米面积在显微镜载玻片上的中心位置。或者相反，粘上一小块玻璃薄片（约20×200微米），以使用爱牢达胶水的载玻片上。注:此变粗糙的表面，以便于琼脂糖的附着力，以确保琼脂糖介质棒或修复的幻灯片。该滑动可重复使用。
3. 放置约20微升嵌入琼脂糖介质到玻璃载片的蚀刻区域的液滴。这使琼脂糖的薄膜。
4. 储存在潮湿箱中的载玻片，并等待琼脂糖介质固化。

2，解剖和安装分生组织样品

1. Microdissect分生组织的共聚焦想象力吴:从干拉下来了超精细镊子取出花芽一个接一个。重要的是要消除所有的花蕾最多时不显示（ 即 P1原基^14）萼片的味蕾是很重要的。
2. 用刀片或镊子的尖端，切分生组织离干。切口应平行于分生组织表面的将要被使用的原子力显微镜测得的区域。得到的顶点应该是300微米，600微米高，以适应针尖下的。
3. 推顶到在步骤1.1.4制备琼脂糖介质的膜。选择在载玻片/琼脂糖的位置并轻推，这样的分生组织，既是直接与载玻片接触，并从琼脂糖伸出。关键是要遵循从它的茎切了几秒钟之内定位在琼脂糖的分生组织。注意:这是为了防止从分生组织的干燥。在这个阶段，分生组织将站在一个CRACķ因为琼脂糖时施加压力破碎。
4. 准备几个分生组织这种方式为批处理成像，只要它们都具有相同的高度并彼此上滑动定位小于500微米。保持分生组织准备在潮湿的盒子，同时进一步解剖标本。
   注意:它限制了变化，从校准到来。理想的情况是2个样本的每个条件的可能做好准备，并随机测量。到目前为止，有一批成像对测量（应力诱导反应）没有观察到的效果。这可能是由于应激信号传导分子中的琼脂和/或所述安装的溶液稀释。备选的应激反应是一样的，不管对样品的制备量。
5. 之前移动到下一个步骤，确保分生组织和花芽之间的边界是干的。如果没有，用滤纸轻轻去除多余水分。这应防止在接下来的阶段，该熔融琼脂糖洪水样品由于毛细作用的力量。
6. 用20微升移液器，补充足够的安装融化琼脂糖填写步骤1.2.3创建裂纹。和以包围各分生组织。琼脂糖应达到除去花芽（原基）的伤痕的程度。为了实现这一目标，它可能有必要在裂纹的每一端加琼脂糖。
7. 当琼脂糖被添加，它会迅速涌入裂缝;使用吸管，吸脱熔安装琼脂糖，以确保分生组织是幻灯片上的最高点的一部分。这解决了分生组织，使其不能成像过程中移动。

3，安装根或胚轴样品

1. 对于根和下胚轴，没有剥离是必要的。在琼脂糖上制备的玻璃载片的薄膜，使一个槽是直接在上面的玻璃蚀刻或沿着一个玻璃薄片。放置在该槽中根或胚轴确保它是与接触玻璃沿其整个长度。
2. 之前移动到下一个步骤，确保样品是干在其表面。如果没有，用滤纸轻轻去除多余的水。
3. 加入融化的样品周围琼脂糖作为安装步骤1.2.6。

4，原子力显微镜制备及灵敏度校准（一JPK Nanowizard AFM）

1. 安装在原子力显微镜的悬臂。悬臂的安装应与圆形压头。半径将决定在x，y和z的分辨率和压痕深度在哪个精确的测量可被存档。
   1. 采取细观纳米级测量在表皮表面，使用50纳米半径圆压头;采取尺度测量，使用一个0.5微米的半径圆压头;采取微尺度测量（横跨2-3个细胞），使用2.5微米半径的圆压头。
2. 定位激光在悬臂的尖端。激光对准中间使用镜像的俘虏的。
3. 放置干净的玻璃的原子力显微镜下。
   注意:以下设置变换的原子力显微镜受体的激光位置的信号转换成悬臂的变形，并通过评估悬臂的弹簧常数，把它翻译成一种力量。
4. 与1 V的目标部队"设定点"的​​方法
5. 选择"力谱"。由最大的"相对集中点"设置为2 V做一个压痕，在"扩展速度"到40微米/秒，而"Z长"到5微米。
6. 从"校准管理"菜单中，选择适合使用"选择合适的范围"按钮灵敏度的远期曲线的线性部分。 "相对集中点"应该从"伏"转化为"米"。
7. 从"校准管理"菜单，选择"弹性系数"来评价的ELasticity利用热波动的悬臂。按"运行"，以获得悬臂的频谱密度图。找到具有最低频率的共振峰。使用"选择合适的范围"按钮适应它。
   注1:关于热波动调整的更多细节，请阅读库克等人^15。
   注2:这是优​​选使用的直接方法使用参考悬臂（或材料与已知的刚度），以评估在悬臂的弹性。这里使用一个是好心阿提夫Asnacios ¹⁶捐赠。
8. 加入200μl的悬臂尖端下10％甘露醇溶液。重新对准激光来使用镜子的捕捉体的中间。
9. 重新校准灵敏度:从"校准管理"菜单中，单击"未知"按钮;重复步骤2.3至2.5。

5，数据采集:表观杨氏模量制图

1. 定位装样品的原子力显微镜下，并添加10％的甘露醇溶液中的500微升小滴在样品上。的甘露醇溶液plasmolyzes分钟内的单元格。
2. 用20 NN目标力（"设定点"）的方式（"设定点"不应该超过3 V）
3. 缩进为200 NN"相对设定点"，一个"延伸速度"40微米/秒，而为5μm的"z长度"。
4. 调整"相对设定点"，以获得100nm的缩进处安装悬臂或0.5微米的为1微米/ 5微米安装悬臂200。
5. 在"力映射"模式，选择一个区域进行扫描:对分生组织，70微米×70微米，分辨率为64×64（"像素"）;对于下胚轴和根，100微米×100微米与64×64的分辨率。
6. 按下扫描启动实验。保存输出。

6，数据分析:表观杨氏模量的计算

1. 在数据分析软件打开数据文件。
2. 选择"批量处理"，以同样的分析适用于单个地图中的所有曲线。
3. 选择"正确的高度为悬臂的弯曲"，所以提取压痕深度。
4. 选择"杨氏模量的拟合函数"，将假定该力正比于压痕的面积。将"笔尖形状"，以抛物线假设压痕形状是抛物线。
5. 表明尖的半径。
6. 优先选择的"回退"曲线的分析，因为它是地形较不敏感比"扩展"曲线。然而，如果有探针的显著粘固在"回退"，用"扩展"曲线，这是不敏感的粘附。
7. 集泊松比为0.5。按分析和保存输出。

结果

在图1中，我们提出花分生组织（ 图1A和1B），年轻人和老年人的下胚轴（ 图1C-F）和根分生组织（ 图1G和1H）典型的年轻模量地图。在所有实验中压头是半球形的，但它的半径不同，使不同空间分辨率可以达到图1C和1D显示了中观纳米压头（50纳米半径）与介观纳米压痕（50 nm的深度）的典型结果。...

讨论

在植物中，改变机械性能起到引导生长和形态发生了重大作用。到目前为止，已经在解开控制植物生长的遗传和化学网络很大的进步，但我们对这些网络如何促进并受到改变机械性能知识是最基本的。这个方法应该使我们能够填补这一空白，所以它应该是浓厚的兴趣，科学家研究植物生长或形态发生的任何方面的。现在我们总结了该方法的挑战和局限，以及未来展望。

在协?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM	JPK	NanoWizard	All the 3-generation are able to do the work with the same preferment.
AFM stage	JPK	CellHesion	Required for sample with low topography (less than 11 µm between the lowest and the highest point in the area of force scanning).
AFM optics	JPK	Top View Optics	Very important in order to position the sample. Could be replaced by long range binoculars or a microscope.
Stereo microscope	Leica	M125	Any type of stereo microscope could do.
150 nm mounted cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	R150-NCL-10	To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use.
1 µm mounted cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	SD-Sphere-NCH-S-10	To measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis.
Tipless cantilever	Nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel, Switzerland	TL-NCH-20	To measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5 µm mounted cantilever. We attached a 5 µm borosilicate bead to a tipless cantilever.
5 µm silicon microspheres	Corpuscular	C-SIO-5
Araldite	Bartik S.A. 77170 Coubet, France		Araldite for fixing the bead to the tipless cantilever.
Low melting agarose	Fisher Scientific Fair Lawn, New Jersey 07410	BP160-100	34-45 °C gelation temperature
D-Mannitol	Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 USA	M4125-500G
2 Stainless Steel No. 5 Tweezers	Ideal-Tek 6828 Balerna, Switzerland	951199