Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

Abstract

إعادة الإعمار حجم الأنسجة يسهل دراسة شكل 3D وتغير حجم جهازا على مستوى macrostructures تتكون من الخلايا. ويمكن أن تستخدم أيضا للتحقيق والتحقق من صحة تقنيات وخوارزميات جديدة في التصوير الطبي والعلاجات الحجمي. إنشاء الأطالس 3D عالية الدقة من مختلف الأجهزة 1،2،3 هو تطبيق آخر من إعادة الإعمار حجم الأنسجة. وهذا يوفر موردا للتحقيق في هياكل الأنسجة والعلاقة المكانية بين مختلف الميزات الخلوية. نقدم نهجا تسجيل الصورة لاعادة الاعمار حجم الأنسجة، الذي يستخدم مجموعة من الصور الضوئية blockface. يمثل حجم الأنسجة التي أعيد بناؤها على شكل موثوق من العينة المجهزة مع عدم وجود خطأ تسجيل مرحلة ما بعد المعالجة نشر. تم تسجيل الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) أقسام ملطخة اثنين من الغدد الثديية الماوس إلى صور blockface يناظرها باستخدام نقاط الحدود المستخرجة من إدغيس للعينة في الأنسجة وblockface الصور. تم تقييم دقة تسجيل بصريا. كما تم تقييم محاذاة macrostructures في الغدد الثديية بصريا في ارتفاع القرار.

هذه الدراسة يحدد الخطوات المختلفة لهذا الخط تسجيل الصورة، بدءا من استئصال الغدة الثديية من خلال لإعادة الإعمار 3D حجم الأنسجة. بينما الأنسجة 2D الصور تكشف عن الاختلافات الهيكلية بين أزواج من المقاطع، ويوفر حجم الأنسجة 3D القدرة على تصور الاختلافات في الشكل والحجم من الغدد الثديية.

Introduction

IGFBP7 (الأنسولين مثل عامل النمو ملزمة البروتين 7) هو عضو في الأسرة البروتين ملزمة IGF، ولقد ثبت لربط مستقبلات IGF1 4. ومن المعروف أسفل التنظيم من IGFBP7 أن يرتبط بسوء التشخيص بسرطان الثدي في 5، في حين أن إعادة إدخال IGFBP7 في نماذج ورم طعم أجنبي يمنع كثيرا من الأورام النمو من 6 إلى استحثاث موت الخلايا المبرمج والشيخوخة الخلوية 7. من أجل دراسة آثار IGFPB7، أنشئ الماوس Igfbp7 فارغة 5 (بيانات غير منشورة). في حين أن هذه الفئران لا تتطور الأورام، فإنها تظهر تغيرات في الأنسجة من المبيض والعضلات والكبد وكذلك عيوب في الزخرفة التنموية الغدة الثديية (بيانات غير منشورة). وأشير النمط الظاهري عيب أول ما الفئران فارغة ذات أحجام أصغر القمامة وغير قادرين على الحفاظ على الفضلات كبيرة متعددة (بيانات غير منشورة).

كميات الأنسجة 3D لديها القدرة على توفير المعلومات حول عملية مفيدةايون للالتحليلات الكمية والنسبية وتقييم نتائج مرضية في الصور الطبية الحجمي. متحد البؤر ثلاثي الأبعاد، يمكن أن اثنين من الفوتون المجهري توفير مستوى عال من الدقة خلية المعلومات المورفولوجية للغدة على مدى 14 المحلية، لكنه لا يملك حقل محدود من عرض وعمق. يوفر إعادة الإعمار حجم الأنسجة مزيد من المعلومات على حد المكانية أكبر بكثير. باستخدام الأساليب التقليدية ومن المتوقع بعض التشويه أثناء إعداد المقاطع النسيجية، مثل الانكماش والتوسع، والدموع، والطيات. هذه التشوهات تجعل من الصعب على تسجيل الصور النسيجي المسلسل في كومة 3D لإعادة بناء وحدة تخزين 3D. حيث بلغ عدد أقسام متتالية مع العيوب يزيد من أوجه التشابه بين أبواب سليمة يتم تقليل وبالتالي يجعل عملية التسجيل أكثر تعقيدا.

وقد اقترحت أساليب مختلفة لتسجيل المقاطع النسيجية وخلق الأنسجة فو المستمرلوم. بعض التقنيات تعتمد على الاختلافات كثافة 8، وتستند الآخرين على شكل أقسام 9. بالنسبة لبعض العينات الهياكل التشريحية يمكن أن تستخدم جنبا إلى جنب مع المعالم 10،11 القائم على أساليب التسجيل معلما 12،13. ولكن هذه الهياكل الداخلية قد لا تكون قابلة للكشف في جميع أنحاء مجلدا كاملا وبالنسبة لبعض العينات لا يمكن تحديد الهياكل التشريحية موثوق بها. وقد استخدمت بعض الجماعات نهج تسجيل الزوج الحكيم وتسجيل الصور على التوالي الأنسجة واحد إلى آخر باستخدام ملامح أو الهياكل التشريحية 16-18. تسجيل أقسام الأنسجة المسلسل مع بعضها البعض دون استخدام صور المرجعية قد نشر خطأ التسجيل وتغيير الشكل الفعلي من حجم الأنسجة. يعتمد نهج تسجيل الزوج الحكيم على اتساق شكل أقسام الأنسجة والهياكل الداخلية في جميع أنحاء كومة من الصور؛ وبالتالي فإنه يتطلب أخذ عينات كثيفة من العينة، والتيربما ليس من الممكن دائما، على سبيل المثال، لالعينات السريرية.

في هذا الخط نستخدم الصور blockface كمجموعة من الصور المرجعية لإعادة الإعمار حجم الأنسجة 19. تؤخذ الصور Blockface من كتل الأنسجة البارافين بعد تصاعد على مشراح وقبل أن يتم قطع كل قسم. وبالتالي، الأضرار التي لحقت الفردية قطع المقاطع المسلسل لا يتعارض مع تسجيل مقاطع المسلسل 8،11،15. نحن التقاط الصور blockface بطريقة مختلفة عن المجموعات الأخرى. يتم الحصول على صور الوجه كتلة البصرية بواسطة عدسة telecentric للقضاء أو التقليل برميل وتشويه المنظور، والذي يحدث عادة عند استخدام العدسات العادية في مجال البصريات. هذه هي واحدة من مزايا النهج المقترح على الطرق الأخرى المنشورة، والتي تؤدي التصوير blockface استخدام عدسات العادية. تؤخذ الصور في زاوية مائلة طفيف استخدام انعكاس سطح كتلة لتعزيز التباين بين TISSرق والبارافين سطح وإزالة ظلال الأنسجة في العمق، وتحت سطح البارافين. ويستخدم فلتر التصوير أيضا من استقطاب الضوء القادم من سطح كتلة وأنسجة لتحقيق التوازن في المقابل 19. لتصحيح تشريد كتلة على مشراح دوارة، يتم حفر 2-3 ثقوب في زوايا كتلة، والتي يمكن اكتشافها بسهولة في الصور blockface. يتم استخدام النقطة الوسطى من هذه الثقوب جنبا إلى جنب مع تسجيل جامدة على أساس تاريخية لمحاذاة الصور blockface.

Protocol

1. العينة

  1. استئصال الغدد الثديية جراحيا من النوع البري CDH1 وكذلك الفئران Igfbp7 الصفرية ثلاثة أيام بعد ظهور الرضاعة.
  2. تنتشر الغدد على الشرائح الزجاجية للمساعدة في استعادة الأم التشكل الغدة الثديية.

2. تثبيت ومعالجة الأنسجة

  1. إصلاح الغدد الثديية في محايدة مخزنة PFA 4٪ O / N عند 4 درجة مئوية.
  2. تخزين الغدد في الايثانول 70٪ قبل معالجة الأنسجة.
  3. نقل الغدد إلى أشرطة معالجة الأنسجة الصغيرة.
  4. معالجة الأنسجة باستخدام معالج الأنسجة الآلي
    1. يذوى الأنسجة في زيادة الإيثانول والزيلين الحمامات من الايثانول 70٪ لمدة 45 دقيقة، 2 مرات في الايثانول 95٪ لمدة 45 دقيقة، 3 مرات في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 1 ساعة و 2 مرات في الزيلين لمدة 45 دقيقة.
    2. تتخلل الأنسجة مع البارافين 3 مرات لمدة 1 ساعة في كل من فراغ مع الضغوط التي مورست.
  5. تضمين الأنسجة في البارافين لتشكيل كتل، لباجتزاء.

3. الأنسجة وBlockface التصوير

  1. تقليم كتل البارافين باستخدام مشراح الدوارة حتى تتم إزالة البارافين الزائدة.
  2. استخدام آلة الطحن العمودي لحفر ثقوب 1 ملم في اثنين على الأقل من زوايا كتلة البارافين عمودي على الكاسيت.
  3. جبل كتلة الأنسجة على مشراح الدوارة.
  4. إعداد نظام التصوير blockface 19 أمام مبضع للفحص المجهري.
  5. التقاط صورة blockface الضوئية قبل باجتزاء.
  6. قطع شرائط من أربعة أقسام في 5 ميكرون سمك على مشراح.
    1. نقل أشرطة إلى حمام الماء البارد.
    2. فصل أقسام الثاني والرابع من الشريط وجبل لهم على شرائح المجهر. اختيار الفروع الثاني والرابع ويوفر وجود فجوة بين أبواب 5 ميكرون.
    3. توسيع كل قسم في حمام ماء دافئ (48 درجة مئوية) لunwrinkle ذلك، ثم إعادة تركيب، فإنه على شريحة المجهر.
      ملاحظة: Cاوتينغ وتركيب وunwrinkling الأقسام يسبب بعض التشوهات فى القسم، مثل المسيل للدموع، أضعاف، وانكماش، والتوسع. هذه التحف تعقيد تسجيل المقاطع الأنسجة.
    4. وصمة عار المقاطع مع H & E باستخدام الملطخ التلقائي.
    5. ساترة الشرائح باستخدام coverslipper التلقائي.
    6. رقمنة الشرائح باستخدام الأنسجة الماسح الضوئي الشريحة الرقمية في قرار الفائدة. لهذا البروتوكول هو 20x والتكبير والقرار هو 0.47 ميكرون.
    7. أسفل أخذ عينات من الأنسجة الصور لهذا القرار من الصور blockface، 18 ميكرومتر.

4. صورة التسجيل

  1. الإنقسام الصورة واختيار نقطة
    1. في blockface الصور قياس القيم بكسل من الثقوب التسجيل واستخدام متوسط ​​القيمة باعتباره عتبة الثابتة لقطاع الثقوب تسجيل في زوايا كتلة البارافين.
    2. منذ يمكن أيضا مجزأة بعض أجزاء إضافيةباستخدام عتبة ثابتة، استخدم دائرية ومجال الكائنات مجزأة للعثور على الثقوب وتجاهل الكائنات إضافية. للقيام بذلك، وكتابة رمز صغير والعثور على نسبة (س 4π منطقة) / (محيط) 2 للكائنات مجزأة. هذه النسبة لكائنات الجولة هو 1.
    3. لكل الغدة الثديية، حدد صورة واحدة blockface كمرجع ومحاذاة بقية الصور blockface إلى المرجع باستخدام مركز ثقوب التسجيل وتقنيات التسجيل القائم على المعالم السياحية.
    4. للصور blockface الانحياز، يدويا شريحة أو استخراج أنسجة من الخلفية. استخدام الكائن الأكثر كبير في قناع لبقية البروتوكول.
    5. لH & E متابعة أقسام الخطوات التالية لتجزئة التلقائي.
      1. استخدام تقنية 20 أوتسو مستوى العتبة إلى صور جزء من الخلفية وخلق أقنعة ثنائي من الصور الأنسجة.
      2. تحديد واختيار الكائن الأكثر كبيرة في كل قناع باستخدام ساعةistogram من الكائنات المسمى.
      3. استخراج بكسل واحد نقاط الحدود واسعة من كل من الأنسجة وأقنعة blockface.
      4. استخدام التعليمات البرمجية سلسلة الخوارزمية 21، لتمثيل نقاط الحدود عن طريق سلسلة من piecewise الخطية تناسبها.
  2. التسجيل الأولي جامدة
    1. استخدام خوارزمية فورييه واصفات 22، للعثور على جامدة الأولي تحويل بين نقاط الحدود من الأنسجة والصور blockface يناظرها. ويشمل هذا الأولي تحويل الترجمة، وتناوب على نطاق العوامل.
    2. تحويل كل صورة الأنسجة مع التحويل الأولية التي تم الحصول عليها من الخطوة السابقة.
  3. تنقيح التسجيل جامدة
    1. إزالة المقاطع انحناء حافة عالية من كفاف الأنسجة باستخدام المتداول مرشح الكرة 23.
    2. حدد 500 نقطة من نقاط الحدود المتبقية الأنسجة عشوائيا باستخدام توزيع موحد.
    3. تحويل لالأنسجة نقاط الحدود عشوائي مع التحول الأولية التي تم الحصول عليها من واصفات فورييه.
    4. حدد مجموعة كاملة من blockface نقاط الحدود واستخدام تكرارية أقرب نقاط (ICP) خوارزمية 24 للعثور على التحول جامدة بين نقاط blockface الحدود، والمقصد، والأنسجة نقاط الحدود عشوائي.
    5. تحويل الصور الأنسجة الانحياز الحصول عليها من الخطوة السابقة وكومة من الصور الأنسجة الانحياز يخلق حجم الأنسجة.
    6. استخدام البرمجيات 3D التصور لخلق صورة بصرية من حجم الأنسجة.
  4. عرض كومة من الصور في التكبير 5X
    1. أسفل أخذ عينات من الأنسجة الصور الأصلية إلى 5x التكبير.
    2. المحاصيل في المنطقة من الاهتمام في واحدة من الصور الأنسجة.
    3. حساب الموقع في تلك المنطقة في الصور الأخرى الأنسجة 5X باستخدام مزيج من التحولات جامدة من خطوتين التسجيل.
    4. اقتصاص ريجيإضافات تهم نفس المنطقة في جميع الصور حجم الأنسجة الأخرى.
    5. أخيرا تحسين المواءمة بين المناطق يدويا. كتابة البرنامج الذي يعلو صورتين ويسمح لاختيار القيم للتناوب وترجمة واحدة من الصور أكثر من الآخر ومن ثم يقوم بحفظ الصورة تحولت عند قبول المحاذاة.
    6. عرض رزمة من المناطق الأنسجة 5X محاذاة باستخدام برنامج 3D التصور.

النتائج

A شرك من تقنيات الفحص المجهري التقليدي هو أن فهم جهازا على المستوى المجهري يقتصر على حقل من رأي واحد في كل مرة. حتى تفشل "مجموع الإفصاح" الشرائح، والتي توفر أقسام الشريحة بأكملها، لتقديم معلومات ثلاثية الأبعاد. مع تطور الشريحة بأكملها، تقنيات المسح الضوئي الدينا...

Discussion

في هذه الدراسة، قمنا بتطوير سير عمل تسجيل الصورة لإعادة بناء وحدة تخزين الأنسجة 3D من المسلسل صور الأنسجة 2D، والتي لا تتطلب المعالم الداخلية تم اختيارها عشوائيا أو علامات إيمانية مزروع داخل الأنسجة، والتي قد تشوه الأنسجة. من خلال طريقة وصفها، وتستخدم الصور الضوئية blo...

Disclosures

The authors have nothing to disclose

Acknowledgements

The authors would like to thank the Biomarker Imaging Research Laboratory (BIRL) at Sunnybrook Research Institute for their histology services. Support for this work was provided by the Terry Fox Foundation, the Canadian Breast Cancer Foundation‐the Prairie‐NWT as well as a CIHR grant, #MOP-97996.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
16% PFAVWR International1571016% Paraformaldehyde solution
Small tissue processing cassettesVWR InternationalCA95029-956
Leica ASP300 Automated Tissue processorLeica14047643515
100% ethanolFisher ScientificS25307B
XyleneVWR International CA95057-822
Paraffin Thermo Fisher39501006Paraplast Tissue Embedding Medium
Leica EG 1160 Embedding CentreLeica
Leica rotary microtomeLeica
Milling machineArgo
Microscope slidesVWR International CA48312-015
H&E stainVWR International
Automatic stainer
Coverslips VWR International 48404-452
MEDITE RCM 7000 Glass CoverslipperMEDITE
Leica SCN400 slide scannerLeica
MATLABMathWorks IncMATLAB 2007bDevelopment software
MeVisLabMeVis Medical Solutions AGMeVisLab 2.13D visualization software

References

  1. Sunkin, S. M., et al. Brain Atlas: An integrated spatiotemporal port for exploring the central nervous system. Nucleic Acids Research. 41, 996-1008 (2012).
  2. Shen, E. H., Overly, C. C., Jones, A. R. The Allen Human Brain Atlas: Comprehensive gene expression mapping of the human brain. Trends in Neurosciences. 35 (12), 711-714 (2012).
  3. Trifunović, D., Karali, M., Camposampiero, D., Ponzin, D., Banfi, S., Marigo, V. A high-resolution RNA expression atlas of retinitis pigmentosa genes in human and mouse retinas. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49 (6), 2330-2336 (2008).
  4. Evdokimova, V., et al. IGFBP7 binds to the IGF-1 receptor and blocks its activation by insulin-like growth factors. Science Signaling. 5 (255), 92 (2012).
  5. Burger, A., Leyland-Jones, B., Banerjee, K., Spyropoulos, D., Seth, A. Essential roles for IGFBP-3 and IGFBP-rP1 in breast cancer. European J. Cancer. 41 (11), 1515-1527 (2005).
  6. Amemiya, Y., et al. Insulin like growth factor binding protein-7 reduces growth of human breast cancer cells and xenografted tumors. Breast Cancer Res Treat. 126 (2), 373-384 (2011).
  7. Benatar, T., et al. IGFBP7 reduces breast tumor growth by induction of senescence and apoptosis pathways. Breast Cancer Res Treat. 133 (2), 563-573 (2012).
  8. Bardinet, E., et al. Co-registration of histological, optical and MR data of the human brain. Medical Image Computing and Computer-Assisted Intervention-Part I. , 548-555 (2002).
  9. Jacobs, M. A., Windham, J. P., Soltanian-Zadeh, H., Peck, D. J., Knight, R. A. Registration and warping of magnetic resonance images to histological sections. Medical Physics. 26 (8), 1568-1578 (1999).
  10. Zhan, Y., Ou, Y., Feldman, M., Tomaszeweski, J., Davatzikos, C., Shen, D. Registering histologic and MR images of prostate for image-based cancer detection. Academic radiology. 14 (11), 1367-1381 (2007).
  11. Dauguet, J., et al. Three-dimensional reconstruction of stained histological slices and 3D non-linear registration with in vivo MRI for whole baboon brain. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 191-204 (2007).
  12. Lazebnik, R. S., Lancaster, T. L., Breen, M. S., Lewin, J. S., Wilson, D. L. Volume registration using needle paths and point landmarks for evaluation of interventional MRI treatments. IEEE Transactions on Medical Imaging. 22 (5), 653-660 (2003).
  13. Breen, M. S., Lazebnik, R. S., Wilson, D. L. Three-dimensional registration of magnetic resonance image data to histological sections with model-based evaluation. Annals of Biomedical Engineering. 33 (8), 1100-1112 (2005).
  14. Mori, H., Borowsky, A. D., Bhat, R., Ghajar, C. M., Seiki, M., Bissell, M. J. . The American Journal of Pathology. 180 (6), 2249-2256 (2012).
  15. Gibb, M., Gilbert, D., Heiner, M., et al. Resolving the three-dimensional histology of the heart. Computational Methods in Systems Biology. , 2-16 (2012).
  16. Wu, M. L., et al. Three-dimensional virtual microscopy of colorectal biopsies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 129 (4), 507-510 (2005).
  17. Arganda-Carreras, I., et al. 3D Reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microscopy Research and Technique. 73 (11), 1019-1029 (2010).
  18. Song, Y., Treanor, D., Bulpitt, A. J., Magee, D. R. 3D reconstruction of multiple stained histology images. Journal of Pathology Informatics. 4 (2), 7 (2013).
  19. Shojaii, R., Karavardanyan, T., Yaffe, M., Martel, A. L. Validation of histology image registration. SPIE Medical Imaging. 7962, 79621E, doi:10.1117/12.878762. 7962 (7962E), (2011).
  20. Ridler, T. W., Calvard, S. Picture thresholding using an iterative selection method. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 8 (8), 630-632 (1978).
  21. Freeman, H. Computer processing of line-drawing images. ACM Computing Surveys (CSUR. 6 (1), 57-97 (1974).
  22. Giardina, C. Accuracy of curve approximation by harmonically related vectors with elliptical loci). Computer Graphics and Image Processing. 6 (3), 277-285 (1977).
  23. Shojaii, R., Martel, A. L. A novel edge point selection method for registration of histology images. Optical Tissue Image analysis in Microscopy, Histopathology and Endoscopy. (OPTIMHisE) Workshop, MICCAI. , (2009).
  24. Besl, P., McKay, N. A method for registration of 3-D shapes. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 14 (2), 239-256 (1992).
  25. Chatterjee, S., et al. Loss of Igfbp7 causes precocious involution in lactating mouse mammary gland. PLoS ONE. 9 (2), e87858 (2013).
  26. Manjunath, B. S., Chellappa, R. Unsupervised texture segmentation using Markov random field models. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 13 (5), 478-482 (1991).
  27. Krishnamachari, S., Chellappa, R. Multiresolution Gauss-Markov random field models for texture segmentation. IEEE Transactions on Image Processing: a publication of the IEEE Signal Processing Society. 6 (2), 251-267 (1997).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

89

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved