Реконструкция 3-Dimensional гистологии Том и его применение для изучения Mouse молочных желез

Резюме

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

Аннотация

Реконструкция объем Гистология облегчает изучение 3D формы и изменения объема органа на уровне макроструктуры, состоящие из клеток. Она также может быть использован для исследования и проверки новых методов и алгоритмов в объемной области медицинской визуализации и терапии. Создание 3D атласы высокого разрешения различных органов ^1,2,3 другое применение реконструкции объема гистология. Это обеспечивает ресурс для исследования тканевых структур и пространственную взаимосвязь между различных клеточных функций. Мы представляем регистрационный подход изображения для реконструкции объема гистология, который использует набор изображений оптических blockface. Реконструированный объем гистология представляет собой надежную форму обработанных образца с не Размножается постобработки ошибки регистрации. В гематоксилином и эозином (H & E) окрашенные срезы двух молочных желез мыши были зарегистрированы в соответствующие blockface изображений с использованием граничные точки, извлеченные из редГЭС образца в гистологии и blockface изображений. Точность регистрации визуально оценивали. Выравнивание макроструктурах молочных желез также визуально оценивают с высоким разрешением.

Это исследование определяет различные шаги этого трубопровода регистрации изображения, начиная от удаления молочной железы через к 3D-реконструкции объема гистологии. В то время как гистологии изображения 2D показывают структурные различия между парами секций, 3D объем гистологии обеспечивает возможность визуализации различий в форме и объема молочных желез.

Введение

IGFBP7 (инсулиноподобный фактор роста-связывающего белка 7) является членом семейства белков IGF-связывающих, и было показано, чтобы связать IGF1 рецептор ^4. Понижающей регуляции IGFBP7, как известно, коррелирует с плохим прогнозом при раке молочной железы ^5, в то время как повторное введение IGFBP7 в модели ксенотрансплантата опухоли значительно ингибирует рост опухоли ⁶ через индукцию апоптоза и клеточного старения ^7. С целью изучения влияния IGFPB7, Igfbp7-нулевые мыши была создана ⁵ (неопубликованные данные). В то время как эти мыши не развиваются опухоли, они показывают изменения в гистологии яичников, мышцах и печени, а также дефекты в молочной железы паттерна развития (неопубликованные данные). Дефектный фенотип было впервые указано как нулевые мыши имеют меньшие размеры для мусора и не в состоянии выдержать несколько больших пометов (неопубликованные данные).

3D объемы гистологии есть потенциал, чтобы обеспечить полезную информаион для количественных и сравнительного анализа и оценки патологических результатов в объемных медицинских изображений. Трехмерная конфокальный, двухфотонного микроскопия может обеспечить высокое разрешение клеток морфологическую информацию железы на местном мере ^14, но имеет ограниченное поле зрения и глубины. Реконструкция объем Гистология предоставляет больше информации по гораздо большей пространственной протяженности. Использование традиционных подходов некоторое искажение ожидается в ходе подготовки гистологических срезов, например, усадки, расширения, слезы и складок. Эти искажения затрудняют зарегистрируйтесь серийные гистологические изображения в 3D стека реконструировать 3D объема. В число последовательных секций с дефектами увеличивает сходство между интактных секций уменьшается и, следовательно, делает процесс регистрации сложнее.

Различные методы были предложены для регистрации гистологические срезы и создать непрерывную гистологии VOЛуме. Некоторые методы зависят от вариаций интенсивности ^8, и другие основаны на форме секций ^9. Для некоторых образцов анатомические структуры могут быть использованы в качестве ориентиров ^10,11 вместе с вехой на основе методов регистрации ^12,13. Но эти внутренние структуры не могут быть обнаружены по всему объему, а для некоторых образцов нет достоверных анатомические структуры не могут быть идентифицированы. Некоторые группы использовали парного регистрационный подход и зарегистрирован последовательных изображений гистологии друг другу с помощью контуров или анатомические структуры ^16-18. Регистрация серийных срезов гистологии друг с другом без использования эталонных изображений может распространяться регистрации ошибок и изменения фактического формы объема, гистологии. Попарное регистрация подход основан на согласованности формой гистологии секций и внутренних структур во всем стопку изображений; Поэтому она требует плотной выборки образца, которыймогут не всегда возможно, например, для клинических образцов.

В этом трубопроводе мы используем blockface изображения в виде набора эталонных изображений для реконструкции объема гистологии ^19. Blockface изображения взяты из парафина блоков ткани после его установки на микротоме и перед каждой секции сократить. Таким образом, повреждение индивидуального серийных срезов разреза не мешает регистрации серийных срезов ^8,11,15. Мы захватить blockface изображения по-другому от других групп. Изображения лиц оптический блок получаются телецентрическим линзы чтобы исключить или уменьшить искажения ствол и перспективный, который обычно происходит, когда с помощью регулярных линз в оптике. Это одно из преимуществ предложенного подхода над другими опубликованными способами, которые выполняют визуализацию с использованием регулярных blockface линзы. Изображения взяты под небольшим острым углом использовать отражение от поверхности блока для усиления контраста между TISSUE и парафин поверхность и устранить тени ткани в глубине под поверхностью парафина. Фотографический фильтр также используется для поляризации света, исходящего от поверхности блока и ткани, чтобы сбалансировать контрастность ^19. Для коррекции смещения блока на поворотном микротоме, 2:58 сверлят отверстия в углах блока, которые легко обнаружить в blockface изображений. В центроиды эти отверстия используются наряду с ориентир на основе жесткой регистрации для выравнивания blockface изображения.

протокол

1. Образцы

1. Акцизный молочных желез хирургическим путем из дикого типа CDH1 а также Igfbp7-нулевых мышей три дня после начала лактации.
2. Разведите желез на стеклах, чтобы помочь восстановить родной молочной морфологии железы.

2. Фиксация и обработка ткани

1. Fix молочных желез в нейтральный буферный 4% PFA O / N на 4 ^{° С.}
2. Храните желез в 70% этаноле до обработки тканей.
3. Перенесите желез малых кассет обработки ткани.
4. Процесс тканей с использованием автоматического процессор тканей
   1. Обезвоживают ткани в увеличении этанола и ксилола ванны 70% этанола в течение 45 мин, 2 раза в 95% этаноле в течение 45 мин, 3 раза в 100% этаноле в течение 1 ч и 2 раза в ксилоле в течение 45 мин.
   2. Пронизывают ткани с парафиновых 3 раза в течение 1 часа каждый в вакууме с приложенного давления.
5. Вставить тканей в парафин в блоки, Для секционирования.

3. Гистологии и Blockface изображений

1. Обрежьте парафиновые блоки с использованием роторного микротом пока избыток парафин удаляется.
2. Используйте Вертикально-фрезерный станок для бурения отверстий 1 мм как минимум в двух углах парафинового блока перпендикулярно к кассете.
3. Установите тканей блок на вращающейся микротоме.
4. Настройте систему визуализации blockface ¹⁹ перед микротоме.
5. Захват оптической blockface изображение до секционирования.
6. Отрежьте ленты четырех разделов на 5 толщиной мкм на микротоме.
   1. Передача ленты в ванну с холодной водой.
   2. Отделите второй и четвертый разделы лентой и смонтировать их на предметные стекла. Выбор второй и четвертый разделы обеспечивает разрыв 5 мкм между секциями.
   3. Развернуть каждый раздел в теплой водяной бане (48 ^{° С),} чтобы unwrinkle его, а затем вновь монтировать его на предметное стекло.
      ПРИМЕЧАНИЕ: СUtting, монтаж, unwrinkling разделы вызвать некоторые искажения на секции, такие как слеза, сгиб, усадка, и расширения. Эти артефакты усложнить регистрацию секциях гистологии.
   4. Пятно секции с H & E с использованием автоматического ситечко.
   5. Покровные слайды с использованием автоматического Coverslipper.
   6. Оцифровка слайдов с использованием цифрового гистологии слайд сканер с разрешением интерес. Для этого протокола увеличение в 20 раз, а разрешение составляет 0,47 мкм.
   7. Вниз-образец гистологии изображения в разрешении blockface изображений, 18 мкм.

4. Изображение Регистрация

1. Сегментация изображения и выбор точек
   1. В blockface изображения измерить значения пикселов отверстия регистрации и использовать среднее значение в виде фиксированной порога до сегменте отверстия регистрации в углах парафинового блока.
   2. Поскольку некоторые дополнительные детали, возможно, также быть сегментирован пос использованием фиксированного порога, используйте округлость и площадь сегментированных объектов, чтобы найти дыры и отбросить лишние объекты. Для этого нужно написать небольшой код и найти отношение (4π х области) / (периметра) ² для сегментированных объектов. Это соотношение для круглых объектов 1.
   3. Для каждого молочной железы, выберите один blockface изображение как ссылки и выровнять остальные blockface изображений на ссылки с помощью центра отверстия регистрация и методов регистрации знаковых основе.
   4. Для выровненных blockface изображений, вручную сегмент или извлечь ткань от фона. Использовать наиболее значительную объекта в маске для остальной части протокола.
   5. Для H & E разделы выполните следующие действия для автоматической сегментации.
      1. Используйте Оцу пороговой технику ²⁰ сегментировать изображений с фоном и создавать бинарные маски гистологии изображений.
      2. Выявление и выбрать наиболее значительный объект в каждой маски с использованием чistogram меченых объектов.
      3. Извлеките шириной в один пиксель граничные точки как от гистологии и blockface масок.
      4. Используйте алгоритм Сеть код ^21, для представления граничные точки последовательностью кусочно-линейных подходит.
2. Начальная Жесткая Регистрация
   1. Используйте Фурье дескрипторов алгоритм ^22, чтобы найти первоначальный жесткий преобразовать между граничных точек гистологии и соответствующих им blockface изображений. Этот первоначальный преобразования включает в себя факторы перемещения, поворота и масштабирования.
   2. Transform каждый гистологии изображение с начальным преобразования, получаемого из предыдущего шага.
3. Уточнение жесткой Регистрация
   1. Удалить высокие разделы края кривизны от гистологии контура с помощью катящийся шар фильтр ^23.
   2. Выберите 500 очков из оставшихся гистологии граничных точек случайным образом с помощью равномерного распределения.
   3. Преобразованиегистологии случайные граничные точки с начальной трансформации, полученной из дескрипторов Фурье.
   4. Выберите весь набор blockface граничных точек и использовать Итерационные ближайших точек (ПМС) алгоритм ^24, чтобы найти жесткий преобразование между blockface граничных точек, пункта назначения, а гистологии случайных граничных точек.
   5. Transform выровненных изображений гистологии, полученные из предыдущего шага и стопка выровненных гистологии изображений создает объем гистологии.
   6. Используйте программное обеспечение 3D визуализации для создания визуального образа объема гистологии.
4. Просмотр Стек изображений на 5-кратным увеличением
   1. Вниз-пробовать оригинальные гистологии изображения в 5x увеличение.
   2. Обрезать область интереса в одном из гистологии изображений.
   3. Рассчитать расположение этого региона в других гистологии изображений 5x с использованием комбинацию из жестких преобразований из двух шагах от регистрации.
   4. Обрезать RegiДополнения, представляющие интерес для той же области размера во всех других гистологии изображений.
   5. Наконец уточнить выравнивание между регионами вручную. Напишите программу, которая перекрывает два изображения и позволяет для выбора значения для вращения и перемещения одного из изображений над другой, а затем сохраняет его в преобразованном виде, когда выравнивание принимается.
   6. Просмотр стеки выровненных 5x регионах гистологии с использованием 3D программного обеспечения визуализации.

Результаты

Ловушка традиционных методов микроскопии является то, что понимание органа на микроскопическом уровне ограничивается одной области-обзора в то время. Даже "всего по раскрытию информации" горки, которые обеспечивают целые разделы слайд, не в состоянии обеспечить трехмерную инфор...

Обсуждение

В этом исследовании, мы разработали регистрационный рабочий процесс изображения на реконструкцию объем 3D гистологии от серийных 2D-изображений гистологии, которая не требует внутренних случайно выбранных ориентиров или имплантированные координатных меток внутри ткани, которые могл?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% PFA	VWR International	15710	16% Paraformaldehyde solution
Small tissue processing cassettes	VWR International	CA95029-956
Leica ASP300 automated tissue processor	Leica	14047643515
100% Ethanol	Fisher Scientific	S25307B
Xylene	VWR International	CA95057-822
Paraffin	Thermo Fisher	39501006	Paraplast tissue embedding medium
Leica EG 1160 embedding center	Leica
Leica rotary microtome	Leica
Milling machine	Argo
Microscope slides	VWR International	CA48312-015
H&E stain	VWR International
Automatic stainer
Coverslips	VWR International	48404-452
MEDITE RCM 7000 glass coverslipper	MEDITE
Leica SCN400 slide scanner	Leica
MATLAB	MathWorks Inc	MATLAB 2007b	Development software
MeVisLab	MeVis Medical Solutions AG	MeVisLab 2.1	3D visualization software