שחזור נפח היסטולוגיה 3 ממדים ויישומו לחקר מאוס החלב בלוטות

Summary

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

Abstract

שחזור היסטולוגיה נפח מאפשר המחקר של צורת 3D ושינוי נפח של איברים ברמה של macrostructures המורכב של תאים. זה גם יכול לשמש כדי לחקור ולאמת את טכניקות חדשניות ואלגוריתמים בתחום הדמיה רפואית נפחית וטיפולים. יצירת אטלסים ברזולוציה גבוהה 3D של איברים שונים ^1,2,3 היא יישום אחר של שיקום היסטולוגיה נפח. זה מספק משאבים לחקירת מבני רקמות והיחסים מרחביים בין תכונות תאיות השונות. אנו מציגים גישת רישום תמונה לשיקום היסטולוגיה נפח, אשר עושה שימוש בסט של תמונות blockface אופטיות. משוחזר היסטולוגיה הנפח מייצג צורה אמינה של דגימת מעובד ללא שגיאות רישום שלאחר עיבוד מופץ. סעיפי hematoxylin ו eosin (H & E) המוכתמות של שתי בלוטות החלב עכבר נרשמו לתמונות blockface המקבילה שלהם באמצעות נקודות גבול שחולצו מן edGES של הדגימה בתמונות היסטולוגיה וblockface. הדיוק של הרישום הוערך באופן חזותי. היישור של macrostructures של בלוטות החלב הוערך גם מבחינה ויזואלית ברזולוציה גבוהה.

מחקר זה מתאר את השלבים השונים של צינור רישום תמונה זו, החל מכריתה של בלוטת החלב ועד לשחזור היסטולוגיה נפח 3D. בעוד תמונות היסטולוגיה 2D לחשוף את ההבדלים המבניים בין הזוגות של חלקים, 3D היסטולוגיה נפח מספק את היכולת לדמיין את ההבדלים בצורה ובנפח של בלוטות החלב.

Introduction

IGFBP7 (אינסולין כמו גורם גדילת חלבון מחייב 7) הוא חבר של משפחת החלבון קושר IGF, והוכח להיקשר לקולטן IGF1 ^4. למטה רגולציה של IGFBP7 ידועה להיות מתואם עם פרוגנוזה גרועה בסרטן השד ^5, ואילו החידוש של IGFBP7 במודלי גידול xenograft מאוד מעכב את גידולי צמיחת ⁶ באמצעות אינדוקציה של אפופטוזיס והזדקנות תאית ^7. כדי לחקור את ההשפעות של IGFPB7, עכבר Igfbp7-null נוצר ⁵ (נתונים שלא פורסמו). בעוד עכברים אלו לא לפתח גידולים, הם מראים שינויים בהיסטולוגיה של השחלה, שריר ובכבד, כמו גם ליקויים בדפוסי החלב בלוטה התפתחותית (נתונים שלא פורסמו). פנוטיפ הפגום צוין ראשון כמו שיש לי העכברים null גדלי המלטה קטנים יותר ואינם מצליח לשמור על המלטות מרובות גדולות (נתונים שלא פורסמו).

יש לי כרכי היסטולוגיה 3D הפוטנציאל לספק informat שימושייון לניתוחים והערכה כמותית והשוואתיים של ממצאים פתולוגיים בתמונות רפואיות נפחית. confocal תלת ממדים, שני הפוטונים במיקרוסקופ יכול לספק מידע מורפולוגי של תאים ברזולוציה גבוהה של הבלוטה ^ב14 מידה מקומית, אבל יש לו שדה ראייה מוגבל ועומק. שחזור היסטולוגיה נפח מספק מידע נוסף על מרחבי מידה גדולה הרבה יותר. תוך שימוש בגישות מסורתיות כמה עיוות צפויה במהלך תקופת ההכנה של סעיפים היסטולוגית, כגון התכווצות, התרחבות, דמעות, וקפלים. עיוותים אלה מקשים לרשום תמונות היסטולוגית סידוריים לתוך ערימת 3D לשחזר נפח 3D. ככל שמספר סעיפים ברציפות עם מומים מגדיל את הדמיון בין סעיפים בשלמות מצטמצם וכתוצאה מכך הופכת את תהליך הרישום מורכב יותר.

שיטות שונות הוצעו כדי לרשום סעיפים היסטולוגית וליצור vo היסטולוגיה רציףlume. כמה טכניקות תלויות בוריאציות בעוצמה ^8, ואחרים המבוססים על הצורה של הסעיפים ^9. עבור חלק מדגימות יכולים לשמש מבנים אנטומיים כציוני דרך ^10,11 יחד עם שיטות רישום המבוסס על ציון ^12,13. אבל המבנים הפנימיים אלה עלולים שלא להתגלות לאורך כל הנפח ועבור חלק מדגימות לא ניתן לזהות מבנים אנטומיים אמינים. חלק מהקבוצות השתמשו בגישת רישום זוג חכם ורשומות תמונות היסטולוגיה רציפות אחד למשנו באמצעות קווי המתאר או מבנים אנטומיים ^16-18. רישום סעיפי היסטולוגיה סידוריים זה לזה ללא השימוש בתמונות התייחסות עשויה להפיץ טעות ברישום ולשנות את הצורה האמיתית של היסטולוגיה הנפח. גישת רישום זוג חכמה מסתמכת על העקביות של צורה של סעיפי היסטולוגיה והמבנים הפנימיים לאורך הערימה של התמונות; לכן הוא דורש דגימה צפופה של הדגימה, אשראולי לא תמיד אפשרי, למשל, לדגימות קליניות.

בצנרת זו אנו משתמשים בתמונות blockface כסט של תמונות התייחסות לשיקום היסטולוגיה נפח ^19. תמונות Blockface נלקחות מאבני רקמות פרפין לאחר גובר על microtome ולפני כל קטע הוא לחתוך. לפיכך, נזק לקיצוץ סעיפים סידוריים בודד לא מפריע לרישום של חלקים סידוריים ^8,11,15. אנו ללכוד את תמונות blockface בצורה שונה מהקבוצות האחרות. תמונות הפנים של הבלוק האופטי מתקבלות על ידי עדשת telecentric כדי למנוע או למזער את עיוות החבית ופרספקטיבה, אשר מתרחשת בדרך כלל בעת שימוש בעדשות רגילות באופטיקה. זהו אחד היתרונות של הגישה המוצעת על פני השיטות האחרות שפורסמו, אשר מבצעות הדמיה blockface שימוש בעדשות רגילות. התמונות שצולמו בזווית אלכסונית קלה להשתמש בהשתקפות של פני השטח של הבלוק להגברת ניגוד בין Tissמשטח UE ופרפין ולחסל את הצל של הרקמה בעומק, מתחת לפני שטח פרפין. מסנן צילום משמש גם כדי לקטב את האור המגיע ממשטח הבלוק והרקמות כדי לאזן את הניגוד ^19. כדי לתקן את העקירה של הגוש על microtome הסיבובי, פעמים עד שלושה הם קדחו חורים בפינות הרחוב, שהם בקלות לזיהוי בתמונות blockface. Centroids של חורים אלה משמשים יחד עם רישום נוקשה המבוסס על אתר כדי ליישר את תמונות blockface.

Protocol

1. דגימה

1. בלו בלוטות החלב בניתוח מהסוג wild-CDH1 כמו גם עכברי Igfbp7-null שלושה ימים שלאחר תחילתה של הנקה.
2. מורחים את הבלוטות על גבי שקופיות זכוכית כדי לעזור להחזיר את מורפולוגיה בלוטת החלב מקומית.

2. קיבוע ועיבוד רקמות

1. תקן את בלוטות החלב בPFA 4% O / N הניטרלי שנאגרו ב4 ^o C.
2. אחסן את הבלוטות ב70% אתנול לפני עיבוד רקמות.
3. העבר את הבלוטות לקלטות עיבוד רקמות קטנות.
4. לעבד את הרקמות באמצעות מעבד רקמות אוטומטית
   1. מייבשים את הרקמות בהגדלת אמבטיות אתנול וקסילן של 70% אתנול ל45 דקות, 2 פעמים ב95% אתנול ל45 דקות, 3 פעמים ב100% אתנול עבור שעה 1 ו -2 פעמים בקסילן 45 דקות.
   2. מחלחל רקמות עם 3 פעמים פרפין במשך שעה 1 כל אחד בואקום עם לחץ מופעל.
5. להטביע את הרקמות בפרפין ליצירת בלוקים, עבור חתך.

3. היסטולוגיה וBlockface הדמיה

1. חתוך את בלוקי פרפין באמצעות microtome סיבובי עד פרפין העודף מוסר.
2. השתמש במכונת טחינה אנכית לקדוח חורי 1 מ"מ לפחות בשתי פינות של גוש פרפין בניצב לקלטת.
3. הר גוש הרקמה בmicrotome הסיבובי.
4. הגדר את מערכת ההדמיה blockface ¹⁹ מול microtome.
5. לכידת תמונת blockface אופטית לפני חתך.
6. לחתוך סרטים מארבעה חלקים בעובי 5 מיקרומטר על microtome.
   1. להעביר את הסרטים לאמבטיה מים הקרים.
   2. הפרד את החלקים השניה והרביעי של הסרט ולעלות אותם בשקופיות מיקרוסקופ. בחירת החלקים השניה והרביעי מספקת פער 5 מיקרומטר בין סעיפים.
   3. להרחיב כל קטע באמבט מים חם (48 C ^o) לunwrinkle, ואז שוב לעלות אותו על שקופיות מיקרוסקופ.
      הערה: Cutting, הרכבה, unwrinkling הסעיפים לגרום לעיוותים במקטע, כגון דמעה, לקפל, התכווצות והתרחבות. ממצאים אלה לסבך את הרישום של חלקי היסטולוגיה.
   4. להכתים את החלקים עם H & E באמצעות שטיינר אוטומטי.
   5. Coverslip השקופיות באמצעות coverslipper אוטומטי.
   6. ספרת השקופיות באמצעות סורק שקופיות היסטולוגיה דיגיטלי ברזולוציה של עניין. לפרוטוקול זה הוא בהגדלה 20x והרזולוציה היא 0.47 מיקרומטר.
   7. למטה לדגום את תמונות היסטולוגיה לרזולוציה של תמונות blockface, 18 מיקרומטר.

4. רישום תמונה

1. פילוח תמונה ובחירת נקודה
   1. בblockface תמונות למדוד את ערכי פיקסל של חורי הרישום ולהשתמש בערך הממוצע כסף קבוע למגזר חורי הרישום בפינות של בלוק פרפין.
   2. מאז כמה חלקים נוספים עשויים להיות גם בפילוח לפישימוש בסף הקבוע, השתמש בהמעגליות והשטח של האובייקטים מפולחים למצוא את החורים וזורקים חפצים נוספים. כדי לעשות זאת, לכתוב קוד קטן ולמצוא את היחס (x אזור 4π) / (היקפי) ² לאובייקטים מפולחים. יחס זה לעצמים עגולים הוא 1.
   3. עבור כל בלוטת החלב, בחר את תמונת blockface אחד כנקודת התייחסות וליישר את שאר תמונות blockface להתייחסות על ידי שימוש במרכז חורי הרישום וטכניקות רישום המבוסס על ציון דרך.
   4. לתמונות blockface המיושרים, באופן ידני או לחלץ קטע הרקמה מהרקע. השתמש באובייקט הגדול ביותר במסכה למשך שארית הפרוטוקול.
   5. עבור H & E סעיפים בצעו את השלבים הבאים לפילוח אוטומטי.
      1. השתמש בטכניקת thresholding אוטסו ²⁰ לתמונות קטע מהרקע ויצירת מסכות בינאריות של תמונות היסטולוגיה.
      2. לזהות ולבחור את האובייקט הגדול ביותר בכל מסכה באמצעות histogram של האובייקטים שכותרתו.
      3. חלץ את נקודות גבול רחבה פיקסל אחד משני היסטולוגיה ומסכות blockface.
      4. השתמש באלגוריתם קוד שרשרת ^21, לייצג את נקודות גבול על ידי רצף של יניארי piecewise מתאים.
2. רישום נוקשה ראשוני
   1. השתמש במתארים פורייה אלגוריתם ^22, למצוא נוקשה הראשוני להפוך בין נקודות גבול של היסטולוגיה ותמונות blockface המקבילה שלהם. ראשוני להפוך את זה כולל את גורמי תרגום, סיבוב ואת קנה מידה.
   2. להפוך כל תמונת היסטולוגיה עם הראשוני להפוך התקבל מהשלב הקודם.
3. עידון של הרישום קשיח
   1. הסר את חלקי קצה עקמומיות גבוהים מגובה היסטולוגיה באמצעות מסנן גלגל את כדור ^23.
   2. בחר 500 נקודות מנקודות גבול היסטולוגיה שנותרו באופן אקראי באמצעות התפלגות אחידה.
   3. להפוך אתנקודות היסטולוגיה אקראיות גבול עם השינוי הראשוני המתקבל ממתארים פורייה.
   4. בחר את המערך השלם של blockface נקודות גבול ולהשתמש בנקודות הקרובה ביותר איטרטיבי אלגוריתם (ICP) ²⁴ כדי למצוא את השינוי הנוקשה בין נקודות גבול blockface, היעד, ונקודות גבול אקראיות היסטולוגיה.
   5. להפוך את התמונות מיושרות היסטולוגיה שהתקבלו מהשלב הקודם ואת ערימת תמונות היסטולוגיה מיושרות יוצרת היסטולוגיה הנפח.
   6. השתמש בתוכנה להדמיה 3D כדי ליצור תמונה חזותית של היסטולוגיה הנפח.
4. צופה בערימה של תמונות בהגדלה 5x
   1. למטה לדגום את תמונות היסטולוגיה המקוריות פי 5 ההגדלה.
   2. לחתוך את האזור של עניין באחת תמונות היסטולוגיה.
   3. לחשב את מיקומו של אזור זה בתמונות היסטולוגיה אחרות 5x באמצעות השילוב של התמורות הנוקשה משני השלבים של רישום.
   4. חתוך את regiפיירפוקס של עניין לאותו אזור בגודל בכל תמונות היסטולוגיה האחרות.
   5. לבסוף לחדד את התיאום בין האזורים באופן ידני. לכתוב תכנית ששכבות שתי תמונות ומאפשרת בחירת הערכים עבור סיבוב ותרגום של אחת התמונות על השני ולאחר מכן שומרת את התמונה הופכת כאשר היישור מקובל.
   6. צפה בערימות של אזורי היסטולוגיה 5x המיושרים באמצעות תוכנת 3D להדמיה.

תוצאות

מלכודת של שיטות מיקרוסקופיה המסורתיות היא שההבנה של איבר ברמה המיקרוסקופית מוגבלת לשדה של נוף אחד בכל פעם. אפילו שקופיות "בסך הכל גילוי", אשר מספקות חלקי שקופית כולה, אינן מספקות מידע תלת ממדים. עם התפתחותה של כל שקופית, טכנולוגיות סריקה דינמיות, היכולת שלנו לראו...

Discussion

במחקר זה, פיתחנו תהליך עבודה רישום תמונה לשחזר 3D היסטולוגיה נפח מתמונות סידורי 2D היסטולוגיה, אשר אינו מחייבות את ציוני דרך פנימיות שנבחרו באקראי או סמני fiducial מושתלים בתוך הרקמה, הדבר שעלול לעוות את הרקמות. בשיטה שתוארה, תמונות blockface אופטיות עצמם משמשות כהפנית התמונות...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% PFA	VWR International	15710	16% Paraformaldehyde solution
Small tissue processing cassettes	VWR International	CA95029-956
Leica ASP300 Automated Tissue processor	Leica	14047643515
100% ethanol	Fisher Scientific	S25307B
Xylene	VWR International	CA95057-822
Paraffin	Thermo Fisher	39501006	Paraplast Tissue Embedding Medium
Leica EG 1160 Embedding Centre	Leica
Leica rotary microtome	Leica
Milling machine	Argo
Microscope slides	VWR International	CA48312-015
H&E stain	VWR International
Automatic stainer
Coverslips	VWR International	48404-452
MEDITE RCM 7000 Glass Coverslipper	MEDITE
Leica SCN400 slide scanner	Leica
MATLAB	MathWorks Inc	MATLAB 2007b	Development software
MeVisLab	MeVis Medical Solutions AG	MeVisLab 2.1	3D visualization software