3次元組織学ボリュームとマウス乳腺研究への応用再建

要約

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

要約

組織学のボリューム再構成は、3D形状および細胞から構成されるマクロ構造のレベルで器官の体積変化の研究を容易にする。また、体積医療画像および療法における新規技術とアルゴリズムを調査し、検証するために使用することができます。異なる器官^1,2,3の3D高解像度の地図帳を作成すると、組織学、ボリューム再構成の他のアプリケーションである。これは、組織の構造や様々な細胞機能の間の空間的関係を調査するためのリソースを提供しています。我々は、光blockface画像のセットを使用して組織学ボリューム再構成のための画像登録手法を提示する。再構築された組織学のボリュームには伝播された後処理登録エラーで処理された試料の信頼性の高い形状を表す。 2マウス乳房腺のヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）染色切片はEDから抽出された境界点を使用して、それに対応するblockface画像に登録されていた組織学およびblockface画像中の試験片のGES。レジストレーションの精度を目視で評価した。乳腺のマクロ構造の位置合わせは、視覚的にも高解像度で評価した。

この研究は、乳腺切除から3次元組織学ボリューム再構成に至るまで、この画像登録パイプラインの異なるステップの輪郭を描く。 2Dの組織学的画像は各項のペア間の構造的な違いを明らかにしながら、3次元組織像ボリュームは形状や乳腺の音量の違いを視覚化する機能を提供します。

概要

IGFBP7（結合タンパク質7インスリン様成長因子）はIGF結合タンパク質ファミリーのメンバーであり、IGF1受容体^4を結合することが示されている。異種移植片腫瘍モデルにおけるIGFBP7の再導入が大きくアポトーシスおよび細胞老化の誘導を介して^{7 6}腫瘍増殖を阻害しながら、IGFBP7のダウンレギュレーションは、乳癌⁵における予後不良と相関することが知られている。 IGFPB7の影響を研究するために、IGFBP7ヌルマウスは^5（未発表データ）を作成しました。これらのマウスが腫瘍を発症しないが、彼らは卵巣、筋肉および肝臓の組織像の変化だけでなく、乳腺の発達パターニング（未発表データ）の欠陥を示している。欠損マウスは、より小さなゴミの大きさを持っており、複数の大きな同腹仔（未発表データ）を維持することができないように欠陥のある表現型は、最初に示された。

組織学3Dボリュームは、有用なのinformatを提供する可能性を有しているボリュメトリック医用画像中の病理所見の定量および比較分析·評価するためのイオン。三次元共焦点、二光子顕微鏡法は、ローカル·エクステント¹⁴における腺の高解像度の細胞形態学的情報を提供することができるが、それは、ビューと深さの限られた視野を有する。組織学のボリュームの再構築がはるかに大きい空間範囲にわたってより多くの情報を提供しています。いくつかの歪みがそのような収縮、拡張、涙、そして折り​​目などの組織切片の調製の間に予想されている伝統的なアプローチを使用。これらの歪みは、それが困難な3次元ボリュームを再構成する3次元スタックにシリアル組織学的画像を登録することを可能にする。欠陥を有する連続したセクションの数は、無傷のセクション間の類似度を増加すると減少し、その結果、登録プロセスがより複雑にされる。

別の方法は、組織切片を登録するために、連続組織学voを作成するために提案されているLUME。いくつかの技術は、強度変動⁸に依存し、他のものは複数のセクション⁹の形状に基づいている。いくつかの試験片の解剖学的構造は、ランドマークに基づく登録方法^12,13と一緒に目印^10,11として使用することができます。しかし、これらの内部構造は、全編を通してず、信頼性の解剖学的構造を特定することはできない、いくつかの試料については検出できない場合があります。いくつかのグループは、ペアワイズ登録アプローチを使用し、連続した組織学的画像を等高線や解剖学的構造^16〜18を使用して別のものを登録している。参照画像を使用せずに互いに直列組織学的切片を登録すると、位置合わせ誤差を伝播および組織容積の実際の形状を変更することができる。ペアワイズ登録の方法は、画像のスタック全体で組織学セクションおよび内部構造の形状の一貫性に依存しています。従って、それは、試料の密なサンプリングを必要とする臨床検体については、例えば 、可能性があることは必ずしも可能ではない。

このパイプラインでは、組織学のボリューム再構成¹⁹のための参照画像のセットとしてblockface画像を使用しています。 Blockface画像はミクロトームで、各セクションが切断される前に実装した後、パラフィン組織ブロックを撮影している。このように、個々の連続切片カットの損傷が連続切片^8,11,15の登録を妨げることはありません。私たちは、他のグループとは別の方法でblockface画像を取り込む。光学ブロック顔画像を光学における規則的なレンズを使用するときに通常発生バレルと遠近歪みを排除又は最小化するためにテレセントリックレンズによって得られる。これは、通常のレンズを用いblockface撮影を行う他の公開された方法、オーバー提案されたアプローチの利点の一つである。画像はTISSの間のコントラスト向上のためのブロックの表面の反射を使用するようにわずかに傾斜した角度で​​撮影されているUEとパラフィン表面とパラフィン表面の下、深さ、組織の影を排除する。写真フィルターはまた、ブロック表面¹⁹及びコントラストのバランス^をとるために、組織からの光を偏光するために使用される。回転式ミクロトーム上のブロックの位置ずれを補正するために、二から三穴がblockface画像において容易に検出されたブロックの角に掘削されています。これらの穴の重心はblockface画像を位置合わせするためにランドマークベースの剛体レジストレーションと一緒に使用されている。

プロトコル

1。試料

1. 3日間は、授乳の発症を投稿する野生型CDH1から外科的に乳腺だけでなく、IGFBP7欠損マウスを切り出す。
2. ネイティブ乳腺形態を取り戻すためにガラススライド上に腺を広げた。

2。固定及び組織処理

1. 4 ^Oで中性緩衝4％PFA O / N中の乳腺を修正しました。
2. 組織処理前に70％エタノールでの腺に保管してください。
3. 小さな組織処理カセットに腺を転送します。
4. 自動化組織プロセッサを使用して組織を処理する
   1. 45分間、キシレン中で1時間及び2回、100％エタノール中で、45分間、95％エタノールで45分間、2回、3回、70％エタノールのエタノールおよびキシレン浴を増加させるに組織を脱水する。
   2. 印加圧力と真空中での1時間ごとに、パラフィン3回組織に浸透。
5. ブロックを形成するためにパラフィンに組織を埋め込む、区画する。

3。組織学およびBlockfaceイメージング

1. 過剰のパラフィンが除去されるまでロータリーミクロトームを用いてパラフィンブロックをトリミング。
2. カセットに垂直なパラフィンブロックの少なくとも二つの隅部に1mmの孔を穿孔する垂直フライス盤を使用する。
3. 回転式ミクロトームで組織ブロックをマウントします。
4. ミクロトームの前にblockface撮像システム^19を設定する。
5. 前の切片に光学blockfaceイメージをキャプチャします。
6. ミクロトームで5μmの厚さで4つのセクションでリボンをカット。
   1. 冷水浴にリボンを転送します。
   2. リボンの第2、第4のセクションを分離し、顕微鏡スライド上にマウントします。第2、第4のセクションを選択すると、セクション間の5μmのギャップを提供します。
   3. それは顕微鏡スライド上に再マウントして、それを滑らかにするために、温水浴（48 ^度C）の各セクションを展開します。
      メモ：Cutting、取付部は、涙、倍、収縮、拡張などのセクションにいくつかの歪みを引き起こすunwrinkling。これらの成果は、組織学切片の登録を複雑にする。
   4. 自動染色装置を使用し、H＆Eでのセクションを染色。
   5. 自動カバースリッパーを使用してスライドをカバースリップ。
   6. 興味の解像度でデジタル組織学スライドスキャナを使用してスライドをデジタル化する。このプロトコルの倍率は20倍であり、分解能は0.47μmである。
   7. blockface画像の解像度、18μmの組織学的画像をダウンサンプリングする。

4。画像の登録

1. 画像分割やポイントの選択
   1. blockfaceの画像は、登録孔の画素値を測定し、セグメントパラフィンブロックの角部における整合穴に固定された閾値として平均値を用いる。
   2. いくつかの追加部品もによってセグメント化される可能性があるため固定しきい値を使用して、穴を見つけて、余分なオブジェクトを破棄するように真円とセグメント化されたオブジェクトの領域を使用します。これを行うには、小さなコードを書いて、セグメント化されたオブジェクトのための（4πさx面積）/（周長^）2の比率を見つける。丸いオブジェクトにこの比率は1である。
   3. 各乳腺の場合は、基準となる1 blockface画像を選択し、登録ホールやランドマークベースの登録技術の中心を用いて基準にblockface画像の残りの部分を合わせます。
   4. 整列blockface画像では、手動セグメントや背景から組織を抽出します。プロトコルの残りのためのマスクの中で最もかなりのオブジェクトを使用します。
   5. H＆Eのためのセクションでは、自動セグメンテーションのため、以下の手順に従ってください。
      1. 背景からセグメント画像に大津しきい値処理技術^20を使用し、組織学画像のバイナリマスクを作成。
      2. Hを使用して、各マスクの中で最もかなりのオブジェクトを識別し、選択するラベルされたオブジェクトのistogram。
      3. 組織学およびblockfaceマスクの両方から1ピクセル幅の境界点を抽出します。
      4. 区分線形フィットのシーケンスで境界点を表現するために、チェーンコードのアルゴリズム^21を使用してください。
2. 初期剛体レジストレーション
   1. 初期剛性のは組織学の境界点とそれに対応するblockface画像間の変換を求めるために、フーリエ記述子アルゴリズム^22を使用してください。この最初の変換は、平行移動、回転、スケールファクタが含まれています。
   2. 当初、各組織学画像を変換前のステップから得た変換。
3. 剛体レジストレーションの改良
   1. ローリングボールフィルター^23を使用して、組織学輪郭から高い曲の縁部分を削除します。
   2. ランダムに一様分布を使用して残りの組織学の境界点から500点を選びます。
   3. ザ·トランスフォームフーリエ記述子から取得した初期変換と組織像のランダムな境界点。
   4. blockface境界点のセット全体を選択し、blockface境界ポイント、宛先、および組織学ランダム境界点間の剛体変換を見つけるために反復最近点（ICP）アルゴリズム^24を使用しています。
   5. 前のステップから得整列組織学的画像を変換し、整列した組織学的画像のスタックは、組織学のボリュームを作成します。
   6. 組織学ボリュームの視覚的なイメージを作成するために、3D可視化ソフトウェアを使用してください。
4. 5倍の倍率で画像のスタックを表示する
   1. 倍率を5倍オリジナルの組織学的画像をダウンサンプリングする。
   2. 組織学画像の一つで関心領域をトリミング。
   3. 登録の二つのステップから剛体変換の組合せを使用して、他の5倍の組織学的画像におけるその領域の位置を計算する。
   4. レジをトリミング他のすべての組織学的画像で同じサイズの領域への関心のアドオン。
   5. 最終的に手動で地域間の位置合わせを調整。 2画像を重ね合わせると、他の1以上の画像の1の回転と移動のための値を選択可能にし、その後、アライメントが受け入れられたとき、変換された画像を保存するプログラムを書く。
   6. 3D視覚化ソフトウェアを使用して整列5X組織学領域のスタックを表示します。

結果

従来の顕微鏡技術の落とし穴は、顕微鏡レベルで器官の理解は一度に一つの視野に限定されることである。スライド全体のセクションを提供しても「全開示」スライドを、三次元情報を提供することができない。スライド全体の開発、動的なスキャン技術を使用すると、そのセクション全体を参照する当社の能力が増加している、しかし、構造体を外挿すると、3次元組織学ボリューム再構成...

ディスカッション

本研究では、組織を歪める可能性があり、組織内の内部ランダムに選択されたランドマークまたは移植基準マーカを必要としないシリアル2D組織学的画像から三次元組織学ボリュームを再構成する画像レジストレーションのワークフローを開発した。記載の方法により、光学blockface画像自体は従来セクショニングを参照画像として使用される。我々は、blockface画像を位置合わせするのを助け?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% PFA	VWR International	15710	16% Paraformaldehyde solution
Small tissue processing cassettes	VWR International	CA95029-956
Leica ASP300 Automated Tissue processor	Leica	14047643515
100% ethanol	Fisher Scientific	S25307B
Xylene	VWR International	CA95057-822
Paraffin	Thermo Fisher	39501006	Paraplast Tissue Embedding Medium
Leica EG 1160 Embedding Centre	Leica
Leica rotary microtome	Leica
Milling machine	Argo
Microscope slides	VWR International	CA48312-015
H&E stain	VWR International
Automatic stainer
Coverslips	VWR International	48404-452
MEDITE RCM 7000 Glass Coverslipper	MEDITE
Leica SCN400 slide scanner	Leica
MATLAB	MathWorks Inc	MATLAB 2007b	Development software
MeVisLab	MeVis Medical Solutions AG	MeVisLab 2.1	3D visualization software