Reconstrucción de 3-Dimensional Volumen Histología y su aplicación al estudio del ratón glándulas mamarias

Resumen

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

Resumen

Reconstrucción volumen Histología facilita el estudio de la forma 3D y el cambio de volumen de un órgano a nivel de macro-estructuras formadas por células. También se puede utilizar para investigar y validar nuevas técnicas y algoritmos en imágenes médicas volumétrica y terapias. La creación de los atlas 3D de alta resolución de los diferentes órganos ^1,2,3 es otra aplicación de la reconstrucción del volumen histología. Esto proporciona un recurso para la investigación de las estructuras de tejido y la relación espacial entre diferentes características celulares. Presentamos un método de registro de imágenes para la reconstrucción del volumen histología, que utiliza un conjunto de imágenes blockface ópticos. El volumen histología reconstruida representa una forma fiable de la muestra procesada sin error de registro post-procesamiento propagado. Los hematoxilina y eosina (H & E) manchadas secciones de dos glándulas mamarias de ratón se registraron a sus imágenes blockface correspondientes utilizando puntos de los límites extraídos del edbios de la muestra en la histología y blockface imágenes. La precisión del registro se evaluó visualmente. La alineación de las macroestructuras de las glándulas mamarias también se evaluó visualmente en alta resolución.

Este estudio delinea las diferentes etapas de esta tubería de registro de imágenes, que van desde la escisión de la glándula mamaria a través de volumen histología reconstrucción 3D. Mientras que las imágenes de histología 2D revelan las diferencias estructurales entre pares de secciones, el volumen de la histología en 3D proporciona la capacidad de visualizar las diferencias en la forma y el volumen de las glándulas mamarias.

Introducción

IGFBP7 (la insulina como factor de crecimiento de la proteína de unión a 7) es un miembro de la familia de proteínas de unión de IGF-, y se ha demostrado que se unen al receptor de IGF1 ^4. Down-regulación de IGFBP7 se sabe que se correlaciona con mal pronóstico en cáncer de mama ^5, mientras que la reintroducción de IGFBP7 en modelos de tumores de xenoinjertos inhibe en gran medida los tumores de crecimiento ⁶ a través de la inducción de la apoptosis y senescencia celular ^7. Con el fin de estudiar los efectos de IGFPB7, un ratón-IGFBP7 nula fue creado ⁵ (datos no publicados). Mientras que estos ratones no desarrollan tumores, que muestran cambios en la histología del ovario, músculo y el hígado, así como defectos en los patrones de desarrollo de la glándula mamaria (datos no publicados). El fenotipo defectuoso fue indicado por primera vez como los ratones nulos tienen camadas más pequeñas y no son capaces de sostener múltiples camadas grandes (datos no publicados).

Volúmenes de histología en 3D tienen el potencial de proporcionar Informat útilion para los análisis cuantitativos y comparativos y la evaluación de los hallazgos patológicos en las imágenes médicas volumétricas. Confocal tridimensional, la microscopía de dos fotones puede proporcionar células de alta resolución información morfológica de la glándula en extensión local ^14, pero tiene un campo de visión limitado y profundidad. Reconstrucción volumen Histología proporciona más información sobre un mucho mayor extensión espacial. El uso de los enfoques tradicionales se prevé cierta distorsión durante la preparación de los cortes histológicos, tales como contracción, expansión, las lágrimas, y los pliegues. Estas distorsiones hacen que sea difícil para registrar imágenes histológicas de serie en una pila 3D para reconstruir un volumen 3D. Como el número de secciones consecutivas con defectos aumenta las similitudes entre las secciones intactas se reduce y por lo tanto hace que el proceso de registro más complicado.

Se han propuesto diferentes métodos para registrar las secciones histológicas y para crear un VO histología continuolume. Algunas técnicas dependen de variaciones de intensidad ^8, y otros se basan en la forma de las secciones ^9. Para algunas muestras de las estructuras anatómicas se pueden utilizar como puntos de referencia ^10,11, junto con métodos de registro basado-hito ^12,13. Pero estas estructuras internas podrían no ser detectables a través de todo el volumen y para algunos especímenes no hay estructuras anatómicas confiables pueden ser identificados. Algunos grupos han utilizado un enfoque de registro de pares y registrado histología imágenes consecutivas de uno a otro utilizando contornos o estructuras anatómicas ^16-18. Registro de secciones histológicas de serie el uno al otro sin el uso de imágenes de referencia puede propagar error de registro y cambiar la forma real del volumen de la histología. Enfoque de registro por pares se basa en la consistencia de la forma de las secciones de histología y las estructuras internas a lo largo de la pila de las imágenes; por lo tanto, requiere densa de muestreo de la muestra, la cualno siempre es posible, por ejemplo, para las muestras clínicas.

En este gasoducto utilizamos imágenes blockface como un conjunto de imágenes de referencia para la reconstrucción del volumen histología ^19. Imágenes Blockface se toman de los bloques de parafina de tejidos después de su montaje en el microtomo y antes se corta cada sección. Por lo tanto, el daño a individuo corte secciones en serie no interfiere con el registro de las secciones de serie ^8,11,15. Capturamos las imágenes blockface de una manera diferente a los otros grupos. Las imágenes de la cara del bloque óptico se obtienen mediante un objetivo telecéntrico para eliminar o minimizar el cañón y la perspectiva de la distorsión, que generalmente ocurre cuando se utilizan objetivos regulares en la óptica. Esta es una de las ventajas del enfoque propuesto sobre los otros métodos publicados, que realizan de imágenes blockface usando lentes regulares. Las imágenes son tomadas en un ángulo oblicuo de leve a utilizar la reflexión de la superficie del bloque para el aumento del contraste entre el TISSsuperficie UE y de parafina y para eliminar la sombra del tejido en profundidad, bajo la superficie de parafina. Un filtro fotográfica también se utiliza para polarizar la luz procedente de la superficie del bloque y el tejido para equilibrar el contraste ^19. Para corregir para el desplazamiento del bloque en el micrótomo rotatorio, de dos a tres agujeros son perforados en las esquinas del bloque, que son fácilmente detectables en las imágenes blockface. Los centroides de estos agujeros se utilizan junto con el registro rígido basado en hito para alinear las imágenes blockface.

Protocolo

1. Espécimen

1. Impuestos especiales de las glándulas mamarias quirúrgicamente de tipo salvaje CDH1 así como los ratones IGFBP7 nulo tres días publican inicio de la lactancia.
2. Separe las glándulas en portaobjetos de vidrio para ayudar a recuperar la morfología de la glándula mamaria nativo.

2. La fijación y procesamiento de tejidos

1. Fijar las glándulas mamarias en neutro tamponado al 4% PFA O / N a ^{4 °} C.
2. Guarde las glándulas en etanol al 70% antes de la elaboración de tejidos.
3. Transferir las glándulas para pequeños casetes de procesamiento de tejidos.
4. Procesar los tejidos usando un procesador automatizado de tejido
   1. Deshidratar los tejidos en el aumento de etanol y xileno baños de etanol al 70% durante 45 minutos, 2 veces en etanol al 95% durante 45 min, 3 veces en etanol al 100% durante 1 hora y 2 veces en xileno durante 45 min.
   2. Permear los tejidos con parafina 3 veces durante 1 hora cada uno en el vacío con la presión aplicada.
5. Incrustar los tejidos en parafina para formar bloques, Para seccionar.

3. Histología y Blockface Imaging

1. Recorte los bloques de parafina utilizando un micrótomo rotatorio hasta que se elimina el exceso de parafina.
2. Use una máquina de fresado vertical para perforar agujeros de 1 mm en al menos dos esquinas del bloque de parafina perpendicular a la casete.
3. Monte el bloque de tejido en el micrótomo rotatorio.
4. Establecer el sistema de formación de imágenes ¹⁹ blockface delante del microtomo.
5. Captura de imagen blockface óptica antes de seccionar.
6. Cortar las cintas de cuatro secciones a las 5 micras de espesor en el microtomo.
   1. Transfiera las cintas para el baño de agua fría.
   2. Separar las segunda y cuarta secciones de la cinta y montarlos en portaobjetos de microscopio. La elección de las segunda y cuarta secciones proporciona una brecha de 5 m entre las secciones.
   3. Amplíe cada sección en un baño de agua caliente (48 ^{º C)} para desarrugar, luego volver a montarlo en el portaobjetos de un microscopio.
      NOTA: CUtting, montaje, unwrinkling las secciones causan algunas distorsiones en la sección, como desgarro, doblez, la contracción y la expansión. Estos artefactos complican el registro de las secciones histológicas.
   4. Teñir las secciones con H & E utilizando una tinción automática.
   5. Cubreobjetos las diapositivas usando un cubreobjetos automático.
   6. Digitalizar las diapositivas usando un escáner de diapositivas histología digital en la resolución de su interés. Para este protocolo el aumento es de 20x y una resolución de 0,47 micras.
   7. Down-muestra las imágenes de histología a la resolución de las imágenes blockface, 18 micras.

4. Registro de Imágenes

1. Segmentación de imagen y el punto de selección
   1. En blockface imágenes miden los valores de píxeles de los orificios de registro y utilizar el valor medio como un umbral fijo al segmento de los orificios de registro en las esquinas del bloque de parafina.
   2. Dado que algunas partes adicionales también pueden ser segmentados porutilizando el umbral fijo, utilizar la circularidad y el área de los objetos segmentados para encontrar los agujeros y descartar los objetos adicionales. Para hacer esto, escriba un pequeño código y encontrar la relación de (4π x área) / (perímetro) ² para los objetos segmentados. Esta relación de objetos redondos es de 1.
   3. Para cada glándula mamaria, seleccionar una imagen blockface como referencia y alinear el resto de las imágenes blockface a la referencia utilizando el centro de los orificios de registro y técnicas de registro basado en la señal.
   4. Para las imágenes blockface alineados, segmento manualmente o extraer el tejido del fondo. Utilice el objeto más importante en la máscara para el resto del protocolo.
   5. Para H & E secciones siguen los siguientes pasos para la segmentación automática.
      1. Utilice una técnica de umbralización Otsu ²⁰ a las imágenes del segmento de los antecedentes y crear máscaras binarias de las imágenes de histología.
      2. Identificar y seleccionar el objeto más importante en cada máscara utilizando la histogram de los objetos etiquetados.
      3. Extraiga los puntos de los límites de ancho de un píxel, tanto de la histología y máscaras blockface.
      4. Utilice el algoritmo de código de cadena ^21, para representar los puntos de los límites de una secuencia de tramos lineales se ajusta.
2. Registro rígido inicial
   1. Utilice Fourier Descriptores algoritmo ^22, para encontrar el rígido inicial transformada entre los puntos de los límites de la histología y sus imágenes blockface correspondientes. Esta inicial incluye transformar los factores de traslación, rotación y escala.
   2. Transformar cada imagen histología con la inicial transformada obtenido de la etapa anterior.
3. Refinamiento del registro rígido
   1. Retire las secciones altas borde curvatura del contorno histología utilizando un filtro de balanceo de la bola ^23.
   2. Seleccione 500 puntos de los puntos de los límites de histología restantes utilizando aleatoriamente distribución uniforme.
   3. Transformar el delhistología puntos limítrofes al azar con la transformación inicial obtenida a partir de los descriptores de Fourier.
   4. Seleccione el conjunto de blockface puntos de los límites y el uso iterativos puntos más cercanos (ICP) del algoritmo ²⁴ para encontrar la transformación rígida entre los puntos de los límites blockface, el destino y la histología puntos limítrofes aleatorios.
   5. Transformar las imágenes de histología alineados obtenidos de la etapa anterior y la pila de imágenes de histología alineados crea el volumen histología.
   6. Utilice un software de visualización 3D para crear una imagen visual del volumen histología.
4. Visualización de la Pila de imágenes con un aumento de 5x
   1. Down-muestrear las imágenes histológicas originales a 5x de aumento.
   2. Recortar la región de interés en una de las imágenes de histología.
   3. Calcular la ubicación de esa región en otras imágenes de histología 5x utilizando la combinación de las transformaciones rígidas de los dos pasos de registro.
   4. Recortar la regiComplementos de interés a la misma región de tamaño en todas las demás imágenes de histología.
   5. Finalmente refinar el alineamiento entre las regiones de forma manual. Escriba un programa que se superpone dos imágenes y permite la selección de los valores de rotación y traslación de una de las imágenes más de la otra y luego guarda la imagen transformada cuando se acepta la alineación.
   6. Ver las pilas de las regiones de histología 5x alineados utilizando un software de visualización 3D.

Resultados

Una trampa de técnicas de microscopía tradicionales es que la comprensión de un órgano a nivel microscópico se limita a un campo de visión a la vez. Incluso diapositivas "en total conformidad", que ofrecen secciones enteras de diapositivas, no proporcionan información tridimensional. Con el desarrollo de la diapositiva entera, tecnologías de análisis dinámicos, nuestra capacidad de ver una sección en su totalidad se ha incrementado, sin embargo la extrapolación de las estructuras requiere volumen h...

Discusión

En este estudio, hemos desarrollado un flujo de trabajo de registro de imágenes para reconstruir un volumen histología en 3D a partir de imágenes de histología en 2D de serie, que no requieren puntos de referencia internos seleccionados al azar o marcadores fiduciales implantados dentro del tejido, que puedan distorsionar el tejido. Mediante el método descrito, imágenes blockface ópticos mismos se utilizan como imágenes de referencia antes de seccionar. Utilizamos orificios externos perforados en el bloque de pa...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% PFA	VWR International	15710	16% Paraformaldehyde solution
Small tissue processing cassettes	VWR International	CA95029-956
Leica ASP300 automated tissue processor	Leica	14047643515
100% Ethanol	Fisher Scientific	S25307B
Xylene	VWR International	CA95057-822
Paraffin	Thermo Fisher	39501006	Paraplast tissue embedding medium
Leica EG 1160 embedding center	Leica
Leica rotary microtome	Leica
Milling machine	Argo
Microscope slides	VWR International	CA48312-015
H&E stain	VWR International
Automatic stainer
Coverslips	VWR International	48404-452
MEDITE RCM 7000 glass coverslipper	MEDITE
Leica SCN400 slide scanner	Leica
MATLAB	MathWorks Inc	MATLAB 2007b	Development software
MeVisLab	MeVis Medical Solutions AG	MeVisLab 2.1	3D visualization software