Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

Özet

Histoloji hacmi yeniden şekil 3B ve hücrelerden oluşur ölçekli yapılar düzeyinde bir organın hacim değişikliği üzerinde çalışmayı kolaylaştırmaktadır. Ayrıca, hacimsel tıbbi görüntüleme ve terapilerde yeni teknikleri ve algoritmalar araştırmak ve doğrulamak için kullanılabilir. Farklı organlarda 1,2,3 3D yüksek çözünürlüklü atlas oluşturma histoloji hacim rekonstrüksiyonu başka bir uygulamadır. Bu doku yapıları ve çeşitli hücresel özellikler arasındaki mekansal ilişkinin araştırmak için bir kaynak sağlar. Biz optik blockface görüntüleri kümesi kullanır histoloji hacim oluşturulması için bir görüntü kaydı yaklaşım sunuyoruz. Yeniden inşa histoloji cilt no bitkiler, post-processing kayıt hatası ile işlenmiş numune güvenilir bir şekli temsil eder. Iki fare meme bezlerinin Hematoksilen ve Eosin (H & E) boyanan kesitler ed çıkarılan sınır noktalarını kullanarak karşılık gelen blockface görüntülere tescil edildihistoloji ve blockface görüntülerde numunenin Ges. Kayıt doğruluğu görsel olarak değerlendirilmiştir. Meme bezlerinin makro yapılar uyumu da görsel olarak yüksek çözünürlükte değerlendirildi.

Bu çalışma, meme bezinin eksizyonu 3D histoloji hacim rekonstrüksiyonu kadar değişen, bu görüntü kayıt boru hattının farklı adımlar çizer. 2D histoloji görsel bölümlerin çiftleri arasındaki yapısal farkların ortaya koymakla birlikte, 3 boyutlu hacim histoloji şekli ve meme bezlerinin hacim farklılıkları görselleştirmek için olanağı sağlar.

Giriş

IGFBP7 (7 bağlayıcı protein insülin benzeri büyüme faktörü), IGF-bağlayıcı protein ailesinin bir üyesidir ve IGF1 4 reseptörüne bağlandığı gösterilmiştir. Ksenograft tümör modellerinde IGFBP7 arasında büyük ölçüde yeniden yerleştirilmesi apoptoz ve hücre yaşlanması 7 endüksiyonu yoluyla 6 büyüme tümör inhibe ederken IGFBP7 arasında aşağı-düzenleme, meme kanseri 5 kötü prognoz ile ilişkili olduğu bilinmektedir. IGFPB7 etkilerini incelemek amacıyla, bir Igfbp7 null fare 5 (yayınlanmamış veri) oluşturuldu. Bu fareler tümörler gelişir yok ederken, onlar yumurtalık, kas ve karaciğer histolojik değişiklikleri yanı sıra meme bezi gelişim desenleme (yayınlanmamış veri) kusurları gösterir. Null fareler daha küçük çöp boyutları vardır ve birden fazla büyük ibrelerin (yayınlanmamış veri) sürdürmek edemiyoruz gibi kusurlu fenotip ilk belirtilmiştir.

3D histoloji hacimleri yararlı informat sağlamak potansiyeline sahiphacimsel Tıbbi görüntülerde patolojik bulguların sayısal ve karşılaştırmalı analizler ve değerlendirme için iyon. Üç boyutlu konfokal, iki-foton mikroskopi yerel ölçüde 14 de bezinin yüksek çözünürlüklü hücre morfolojik bilgi sağlayabilir, ancak bu bakış ve derinlik sınırlı bir alanı vardır. Histoloji hacim rekonstrüksiyonu çok daha büyük bir mekansal ölçüde üzerinde daha fazla bilgi sağlar. Bazı bozulması, büzülme, genişleme, gözyaşı ve kıvrımlar gibi histolojik kesitler, hazırlanması sırasında öngörülmektedir geleneksel yaklaşımları kullanma. Bu bozulmalar zor bir 3D hacmini yeniden bir 3D yığını içine seri histolojik görüntüleri kayıt olun. Defektli ardışık bölümlerin sayısı sağlam bölümler arasındaki benzerlikleri arttıkça azalır ve sonuç olarak kayıt işlemi daha karmaşık hale getirir.

Farklı yöntemler histolojik kesitler kayıt ve sürekli bir histoloji vo yaratmak için ileri sürülmüştürlume. Bazı teknikler yoğunluk değişmeleri 8 bağlıdır ve diğer bölümleri 9 şekline dayanmaktadır. Bazı örnekler için anatomik yapılar dönüm tabanlı kayıt yöntemleri 12,13 ile birlikte görülecek 10,11 olarak kullanılabilir. Ancak bu iç yapıların bütün hacmi boyunca ve güvenilir bir anatomik yapıların tespit edilebilir bir numune için tespit olmayabilir. Bazı gruplar bir çift-bilge kayıt yaklaşım kullanılmış ve ardışık histoloji görüntüleri hatlarını ya da anatomik yapıları 16-18 kullanarak başka bir kayıt var. Referans resim kullanılmadan birbirine seri histoloji kısımlarının kayıt tarihi hata yaymak ve histoloji birimin gerçek şekli değişebilir. Pair-bilge kayıt yaklaşım görüntülerin yığını boyunca histoloji bölümlerinde ve iç yapılarının şekli tutarlılık dayanır; bu nedenle numunenin yoğun örnekleme gerektirenklinik örnekler için, örneğin belki her zaman mümkün değildir.

Bu boru hattı biz histoloji hacim rekonstrüksiyonu 19 için referans görüntülerin bir dizi olarak blockface görüntüleri kullanın. Blockface görsel mikrotomu monte edildikten sonra parafin doku blokları alınır ve her bir bölüm kesilmeden önce. Böylece, bireysel seri bölümleri kesmek için hasar seri bölümleri 8,11,15 tesciline engel değildir. Biz, diğer gruplardan farklı bir şekilde blockface çekim. Optik blok yüz görüntüleri optik düzenli lens kullanırken genellikle oluşur varil ve perspektif bozulmalarını ortadan kaldırmak veya en aza indirmek için bir Telesentrik lens ile elde edilir. Bu normal bir lens kullanarak blockface görüntüleme gerçekleştirmek yayınlanan diğer yöntemlere göre önerilen yaklaşımın avantajlarından biridir. Görüntüler Tiss arasındaki kontrast, bloğun yüzeyi yansımasını kullanmak için hafif eğik bir açı ile alınırue ve parafin yüzeyi ve parafin yüzeyinin altında, derinlemesine doku gölge ortadan kaldırmak için. Bir fotoğrafik filtre, aynı zamanda blok yüzeyi ile kontrast 19 dengelemek için dokudan gelen ışığı polarize etmek için kullanılır. Döner mikrotom üzerindeki bloğun değiştirmesi için düzeltmek için, 2-3 delik blockface görüntülerde kolaylıkla saptanabilen bloğun köşelerinde, delinir. Bu deliklerin sentroidler blockface görüntüleri hizalamak için dönüm noktası tabanlı katı kaydı ile birlikte kullanılır.

Protokol

1.. Numune

  1. Üç gün laktasyon başlangıcı sonrası yabani tip CDH1 ikinci cerrahi meme bezleri gibi Igfbp7 null fareler tüketim.
  2. Yerli meme bezi morfolojisi yeniden yardımcı cam slaytlar üzerine bezleri yayıldı.

2.. Fiksasyon ve Doku İşleme

  1. 4 ° C'de o nötr tamponlu% 4 PFA O / N meme bezleri saptamak
  2. Önce doku işleme% 70 etanol içinde bezleri saklayın.
  3. Küçük doku işleme kaset bezleri aktarın.
  4. Otomatik bir doku işlemci kullanarak dokular işleyin
    1. 45 dakika için ksilen içinde, 1 saat ve 2 kez% 100 etanol içinde, 45 dakika boyunca% 95 etanol içinde 45 dakika, 2 kez 3 kez% 70 etanol, etanol ve ksilen banyoları artan doku kurutmak.
    2. Uygulanan basınç bir vakum içinde 1 saat boyunca her bir parafin ile 3 kez dokulara nüfuz.
  5. Blokları meydana getirmek için dokular parafin içinde Embed, Kesit için.

3.. Histoloji ve Blockface Görüntüleme

  1. Fazla parafin kaldırılana kadar bir döner mikrotom kullanılarak parafin blokları kesin.
  2. Kasetine dik olan parafin bloğun en az iki köşe 1 mm delik için dikey bir freze makinesi kullanın.
  3. Döner mikrotom üzerinde doku bloğu monte edin.
  4. Mikrotom önündeki blockface görüntüleme sistemi 19 kurun.
  5. Önce kesit optik blockface görüntü yakalayın.
  6. Mikrotomu 5 mikron kalınlığında dört bölümden şeritler kesin.
    1. Soğuk su banyosuna şeritler aktarın.
    2. Şerit ikinci ve dördüncü bölümleri ayırın ve mikroskop lamı üzerine takar. Ikinci ve dördüncü bölümleri seçimi bölümleri arasında bir 5 mm bir boşluk sağlar.
    3. Bu mikroskop lamı üzerine yeniden monte sonra, bunu unwrinkle için sıcak su banyosunda (48 o C) her bölümü genişletin.
      NOT: CKesm, montaj bölümleri gibi gözyaşı, kat, çekme ve genişleme olarak bölümünde bazı bozulmalara neden unwrinkling. Bu eserler histoloji bölümlerin kayıt zorlaştırıyor.
    4. Otomatik Stainer kullanılarak H & E ile bölümleri Leke.
    5. Otomatik coverslipper kullanarak slaytlar Coverslip.
    6. Ilgi çözünürlükte dijital histoloji slayt tarayıcı kullanarak slaytlar sayısallaştır. Bu protokol için 20x büyütme ve çözünürlük 0.47 mm.
    7. Blockface görüntüler, 18 mikron çözünürlüğü histoloji görüntü aşağı-örnek.

4. Görüntü Kayıt

  1. Görüntü Segmentasyon ve nokta Seçimi
    1. Blockface görüntüler kayıt deliklerin piksel değerlerini ölçmek ve segmentinde parafin blok köşelerinde kayıt delikler sabit bir eşik olarak ortalama değeri kullanın.
    2. Bazı ek parçalar da bölünmüş olabilir yanasabit eşik kullanarak, daireselliğe ve delikleri bulmak ve ekstra nesneleri atmak için segmente nesnelerin alanını kullanın. Bunu yapmak küçük bir kod yazmak ve bölümlere ayrılmış nesneler için (4π x alan) / (çevre) 2 oranını bulmak için. Yuvarlak nesneler için bu oranı 1'dir.
    3. Her meme bezi için, referans gibi bir blockface görüntüyü seçin ve kayıt delikler ve bölge-tabanlı kayıt teknikleri merkezi kullanarak referans blockface görüntülerin kalanını hizalayın.
    4. Hizalanmış blockface görüntüler için, elle kesimi veya arka plan doku ayıklayın. Protokol kalanı için maske en büyükçe nesnesini kullanın.
    5. H & E bölümler için otomatik segmentasyon için aşağıdaki adımları uygulayın.
      1. Arka plan bölüm görüntüleri Otsu eşikleme tekniği 20 kullanın ve histoloji görüntülerin ikili maskeler oluşturabilirsiniz.
      2. Belirlenmesi ve h kullanarak her maskesi içinde en büyük hacimli nesneyi seçinetiketli nesnelerin istogram.
      3. Histoloji ve blockface maskeleri hem bir piksel genişliğinde sınır noktaları ayıklayın.
      4. Parçalı doğrusal bir dizisi ile sınır noktaları temsil etmek, Zincir kodu algoritması 21 kullanın uyuyor.
  2. İlk Sert Kayıt
    1. Ilk sert histoloji sınır noktaları ve bunlara karşılık gelen blockface görüntüleri arasında dönüştürmek bulmak için, Fourier tanımlayıcıları algoritma 22 kullanın. Bu ilk dönüştürmek çevirme, döndürme ve ölçek faktörleri içerir.
    2. Başlangıç ​​önceki aşamada elde edilen dönüşüm her histoloji görseli dönüşümü.
  3. Sert Kayıt arıtma
    1. Yuvarlanan bir top filtre 23 kullanılarak histoloji konturundan yüksek eğrilik kenar bölümleri kaldırın.
    2. Rastgele düzgün dağılım kullanılarak, kalan histoloji sınır noktalarından 500 puan seçin.
    3. TransformFourier tanımlayıcıları elde edilen ilk dönüşüm ile histoloji rastgele sınır noktaları.
    4. Blockface sınır noktaları bütün seti seçin ve blockface sınır noktaları, hedef ve histoloji rastgele sınır noktaları arasındaki sert dönüşüm bulmak için iteratif en yakın Puanlar (ICP) algoritması 24 kullanın.
    5. Hizalanmış histoloji önceki adımda elde edilen görüntüleri ve hizalanmış histoloji görüntülerin yığını histoloji ses oluşturur Transform.
    6. Histoloji hacminin görsel bir görüntü oluşturmak için bir 3D görselleştirme yazılımını kullanın.
  4. 5x büyütme Görüntüler Stack görüntüleniyor
    1. Büyütme 5x orijinal histoloji görüntü aşağı-örnek.
    2. Histoloji görüntülerin birinde, ilgili bölgeyi Crop.
    3. Kayıt iki aşamadan gelen katı dönüşümlerin kombinasyonunu kullanan diğer 5x histoloji görüntülerde bu bölgenin konumunu hesaplar.
    4. Regi kırpınDiğer tüm histoloji görüntülerde aynı boyutta bölgeye ilgi ons.
    5. Nihayet elle bölgeler arasındaki uyum rafine. Iki görüntüyü üst üste bindirir ve rotasyon ve diğer birinin üzerine görüntülerden birine çeviri için değerlerini seçmek için izin verir ve ardından hizalama kabul edilir dönüştürülmüş görüntüsünü kaydeden bir program yazın.
    6. 3D görselleştirme yazılımı ile uyumlu 5x histoloji bölgelerin yığınları görüntüleyebilirsiniz.

Sonuçlar

Geleneksel mikroskopi teknikleri bir hatadır mikroskobik düzeyde bir organın anlayış bir defada bir alan-görünümü ile sınırlı olmasıdır. Hatta tüm slayt bölümlerini sağlamak "total açıklama" slaytlar, üç boyutlu bilgi sağlamak için başarısız. Bütün slayt, dinamik tarama teknolojileri, bütünüyle bir bölümünü görmek bizim yeteneği arttı, gelişimi ile ancak yapıları extrapolating 3D histoloji hacmi rekonstrüksiyon gerektirir.

Daha Igfbp7 null...

Tartışmalar

Bu çalışmada, doku deforme olabilir dokusu içinde iç rastgele seçilmiş işaretlerini veya implante fiducial işaretleri, gerektirmeyen seri 2B histoloji görüntüleri, bir 3D histoloji cildini yeniden bir görüntü kaydı iş akışını geliştirdik. Tarif edilen yönteme göre, optik blockface görsel kendilerini önce kesit için, referans resim olarak kullanılır. Biz blockface görüntüleri hizalama yardımcı olmak üzere ve kameranın önüne parafin bloğun 2B çapraz hareketi için gidermesi parafin ...

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose

Teşekkürler

The authors would like to thank the Biomarker Imaging Research Laboratory (BIRL) at Sunnybrook Research Institute for their histology services. Support for this work was provided by the Terry Fox Foundation, the Canadian Breast Cancer Foundation‐the Prairie‐NWT as well as a CIHR grant, #MOP-97996.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
16% PFAVWR International1571016% Paraformaldehyde solution
Small tissue processing cassettesVWR InternationalCA95029-956
Leica ASP300 Automated Tissue processorLeica14047643515
100% ethanolFisher ScientificS25307B
XyleneVWR International CA95057-822
Paraffin Thermo Fisher39501006Paraplast Tissue Embedding Medium
Leica EG 1160 Embedding CentreLeica
Leica rotary microtomeLeica
Milling machineArgo
Microscope slidesVWR International CA48312-015
H&E stainVWR International
Automatic stainer
Coverslips VWR International 48404-452
MEDITE RCM 7000 Glass CoverslipperMEDITE
Leica SCN400 slide scannerLeica
MATLABMathWorks IncMATLAB 2007bDevelopment software
MeVisLabMeVis Medical Solutions AGMeVisLab 2.13D visualization software

Referanslar

  1. Sunkin, S. M., et al. Brain Atlas: An integrated spatiotemporal port for exploring the central nervous system. Nucleic Acids Research. 41, 996-1008 (2012).
  2. Shen, E. H., Overly, C. C., Jones, A. R. The Allen Human Brain Atlas: Comprehensive gene expression mapping of the human brain. Trends in Neurosciences. 35 (12), 711-714 (2012).
  3. Trifunović, D., Karali, M., Camposampiero, D., Ponzin, D., Banfi, S., Marigo, V. A high-resolution RNA expression atlas of retinitis pigmentosa genes in human and mouse retinas. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 49 (6), 2330-2336 (2008).
  4. Evdokimova, V., et al. IGFBP7 binds to the IGF-1 receptor and blocks its activation by insulin-like growth factors. Science Signaling. 5 (255), 92 (2012).
  5. Burger, A., Leyland-Jones, B., Banerjee, K., Spyropoulos, D., Seth, A. Essential roles for IGFBP-3 and IGFBP-rP1 in breast cancer. European J. Cancer. 41 (11), 1515-1527 (2005).
  6. Amemiya, Y., et al. Insulin like growth factor binding protein-7 reduces growth of human breast cancer cells and xenografted tumors. Breast Cancer Res Treat. 126 (2), 373-384 (2011).
  7. Benatar, T., et al. IGFBP7 reduces breast tumor growth by induction of senescence and apoptosis pathways. Breast Cancer Res Treat. 133 (2), 563-573 (2012).
  8. Bardinet, E., et al. Co-registration of histological, optical and MR data of the human brain. Medical Image Computing and Computer-Assisted Intervention-Part I. , 548-555 (2002).
  9. Jacobs, M. A., Windham, J. P., Soltanian-Zadeh, H., Peck, D. J., Knight, R. A. Registration and warping of magnetic resonance images to histological sections. Medical Physics. 26 (8), 1568-1578 (1999).
  10. Zhan, Y., Ou, Y., Feldman, M., Tomaszeweski, J., Davatzikos, C., Shen, D. Registering histologic and MR images of prostate for image-based cancer detection. Academic radiology. 14 (11), 1367-1381 (2007).
  11. Dauguet, J., et al. Three-dimensional reconstruction of stained histological slices and 3D non-linear registration with in vivo MRI for whole baboon brain. Journal of Neuroscience Methods. 164 (1), 191-204 (2007).
  12. Lazebnik, R. S., Lancaster, T. L., Breen, M. S., Lewin, J. S., Wilson, D. L. Volume registration using needle paths and point landmarks for evaluation of interventional MRI treatments. IEEE Transactions on Medical Imaging. 22 (5), 653-660 (2003).
  13. Breen, M. S., Lazebnik, R. S., Wilson, D. L. Three-dimensional registration of magnetic resonance image data to histological sections with model-based evaluation. Annals of Biomedical Engineering. 33 (8), 1100-1112 (2005).
  14. Mori, H., Borowsky, A. D., Bhat, R., Ghajar, C. M., Seiki, M., Bissell, M. J. . The American Journal of Pathology. 180 (6), 2249-2256 (2012).
  15. Gibb, M., Gilbert, D., Heiner, M., et al. Resolving the three-dimensional histology of the heart. Computational Methods in Systems Biology. , 2-16 (2012).
  16. Wu, M. L., et al. Three-dimensional virtual microscopy of colorectal biopsies. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 129 (4), 507-510 (2005).
  17. Arganda-Carreras, I., et al. 3D Reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue. Microscopy Research and Technique. 73 (11), 1019-1029 (2010).
  18. Song, Y., Treanor, D., Bulpitt, A. J., Magee, D. R. 3D reconstruction of multiple stained histology images. Journal of Pathology Informatics. 4 (2), 7 (2013).
  19. Shojaii, R., Karavardanyan, T., Yaffe, M., Martel, A. L. Validation of histology image registration. SPIE Medical Imaging. 7962, 79621E, doi:10.1117/12.878762. 7962 (7962E), (2011).
  20. Ridler, T. W., Calvard, S. Picture thresholding using an iterative selection method. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 8 (8), 630-632 (1978).
  21. Freeman, H. Computer processing of line-drawing images. ACM Computing Surveys (CSUR. 6 (1), 57-97 (1974).
  22. Giardina, C. Accuracy of curve approximation by harmonically related vectors with elliptical loci). Computer Graphics and Image Processing. 6 (3), 277-285 (1977).
  23. Shojaii, R., Martel, A. L. A novel edge point selection method for registration of histology images. Optical Tissue Image analysis in Microscopy, Histopathology and Endoscopy. (OPTIMHisE) Workshop, MICCAI. , (2009).
  24. Besl, P., McKay, N. A method for registration of 3-D shapes. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 14 (2), 239-256 (1992).
  25. Chatterjee, S., et al. Loss of Igfbp7 causes precocious involution in lactating mouse mammary gland. PLoS ONE. 9 (2), e87858 (2013).
  26. Manjunath, B. S., Chellappa, R. Unsupervised texture segmentation using Markov random field models. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 13 (5), 478-482 (1991).
  27. Krishnamachari, S., Chellappa, R. Multiresolution Gauss-Markov random field models for texture segmentation. IEEE Transactions on Image Processing: a publication of the IEEE Signal Processing Society. 6 (2), 251-267 (1997).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 89Cilt Histoloji marTransgenik Fare ModeliG r nt KaydSay sal HistolojiG r nt lemeFare Meme Bezi

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır