Reconstrução de 3-Dimensional Volume Histologia e sua Aplicação para o Estudo de Rato glândulas mamárias

Resumo

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

Resumo

Reconstrução de volume Histologia facilita o estudo da forma 3D e variação de volume de um órgão a nível de macroestruturas formadas por células. Ele também pode ser usado para investigar e validar novas técnicas e algoritmos em imagiologia médica volumétrico e terapias. Criação de atlas de alta resolução em 3D de diferentes órgãos ^1,2,3 é outra aplicação de reconstrução do volume histologia. Isto fornece um recurso para investigar estruturas de tecidos e as relações espaciais entre várias características celulares. Nós apresentamos uma abordagem registro de imagens para a reconstrução do volume histologia, que utiliza um conjunto de imagens blockface ópticos. O volume histologia reconstruída representa uma forma confiável do espécime processados ​​com nenhum erro de registro de pós-processamento propagada. Os (H & E) cortes corados hematoxilina e eosina de duas glândulas mamárias do rato foram registrados às suas imagens blockface correspondentes usando pontos de fronteira extraídos do edges do espécime em histologia e blockface imagens. A precisão do registro foi avaliada visualmente. O alinhamento das macroestruturas das glândulas mamarias também foi avaliada visualmente em alta resolução.

Este estudo delineia as diferentes etapas deste gasoduto registro de imagens, que vão desde a excisão da glândula mamária por meio de reconstrução 3D volume de histologia. Enquanto as imagens de histologia 2D revelar as diferenças estruturais entre pares de seções, o volume de histologia 3D proporciona a capacidade de visualizar as diferenças de forma e volume das glândulas mamárias.

Introdução

IGFBP7 (insulina como factor de crescimento da proteína de ligação 7) é um membro da família de proteínas de ligação a IGF, e tem sido demonstrado que se ligam ao receptor de IGF1 ^4. Down-regulação da IGFBP7 é conhecido por ser correlacionados com mau prognóstico no câncer de mama ^5, enquanto a reintrodução de IGFBP7 em modelos de tumores Xenoenxerto inibe significativamente os tumores de crescimento de ⁶ a indução de apoptose e senescência celular ^7. A fim de estudar os efeitos da IGFPB7, um mouse IGFBP7 nulo foi criado ⁵ (dados não publicados). Enquanto estes ratinhos não desenvolveram tumores, que mostram alterações na histologia do ovário, músculo e fígado, assim como defeitos na padronização do desenvolvimento da glândula mamaria (dados não publicados). O fenótipo defeituoso foi indicado pela primeira vez como os ratos nulos têm tamanho das ninhadas menores e são incapazes de sustentar várias ninhadas grandes (dados não publicados).

Volumes de histologia 3D têm o potencial de fornecer informat útilíon para análises quantitativas e comparativas e avaliação de achados patológicos em imagens médicas volumétricos. Confocal tridimensional, microscopia de dois fótons podem fornecer células de alta resolução informação morfológica da glândula em extensão local ^14, mas tem um campo de visão limitado e profundidade. Reconstrução volume de Histologia fornece mais informações sobre uma extensão muito maior espacial. Usando abordagens tradicionais alguma distorção é antecipado durante a preparação dos cortes histológicos, como encolhimento, expansão, lágrimas e dobras. Essas distorções dificultam a registar imagens histológicas de série em uma pilha 3D para reconstruir um volume 3D. À medida que o número de secções consecutivas com defeitos aumenta as semelhanças entre as secções intactas é reduzida e, consequentemente, faz com que o processo de registo mais complicado.

Diferentes métodos têm sido propostos para registar cortes histológicos e criar um vo histologia contínualume. Algumas técnicas dependerá variações de intensidade de ^8, e os outros são baseados na forma de secções ^9. Para alguns espécimes as estruturas anatômicas podem ser usados ​​como pontos de referência ^10,11, juntamente com métodos de registo com base em marcos ^12,13. Mas estas estruturas internas pode não ser detectável durante todo o volume e para algumas amostras sem estruturas anatómicas fiáveis ​​podem ser identificados. Alguns grupos têm usado uma abordagem de registro de pares e registrou imagens de histologia consecutivos de um para outro usando contornos ou estruturas anatômicas ^16-18. Registrando cortes histológicos de série para um outro sem o uso de imagens de referência podem propagar o erro de registro e alterar a forma real do volume de histologia. Abordagem de registro de pares depende da consistência da forma dos cortes histológicos e as estruturas internas em toda a pilha de imagens; portanto, requer amostragem densa da amostra, o quepode nem sempre possível, por exemplo, para amostras clínicas.

Neste oleoduto usamos imagens blockface como um conjunto de imagens de referência para o volume de histologia reconstrução ^19. Imagens Blockface são tomadas dos blocos de parafina do tecido após a montagem no micrótomo e antes de cada seção é cortada. Assim, os danos ao indivíduo cortes seriados corte não interfere com o registro de cortes seriados ^8,11,15. Nós capturar as imagens blockface de uma maneira diferente dos outros grupos. As imagens da face do bloco óptico são obtidos por uma lente telecêntrica para eliminar ou minimizar a distorção do tambor e em perspectiva, que normalmente ocorre quando se usa lentes regulares em óptica. Esta é uma das vantagens da abordagem proposta em relação aos outros métodos publicados, que realizam imagiologia blockface usando lentes normais. As imagens são obtidas com um ligeiro ângulo oblíquo para usar a reflexão da superfície do bloco, para aumento do contraste entre a tissue e parafina superfície e para eliminar a sombra do tecido em profundidade, abaixo da superfície da parafina. Um filtro fotográfico também é usada para polarizar a luz vinda a partir da superfície do bloco e o tecido para equilibrar o contraste ^19. Para corrigir o deslocamento do bloco no micrótomo rotativo, 2-3 orifícios são perfurados nos cantos do bloco, que são facilmente detectáveis ​​nas imagens blockface. Os centróides desses buracos são usados ​​juntamente com registro rígido à base de referência para alinhar as imagens blockface.

Protocolo

1. Espécime

1. Especial sobre o consumo das glândulas mamárias cirurgicamente de tipo selvagem CDH1, bem como camundongos IGFBP7 nulo três dias após a início da lactação.
2. Espalhe as glândulas em lâminas de vidro para ajudar a recuperar a morfologia natural da glândula mamária.

2. Fixação e processamento de tecidos

1. Corrigir as glândulas mamárias em neutro tamponado 4% PFA O / N a 4 ^o C.
2. Armazenar as glândulas em etanol a 70% antes do processamento do tecido.
3. Transferir as glândulas para pequenas cassetes de transformação de tecidos.
4. Processar os tecidos utilizando um processador automático de tecido
   1. Desidratar os tecidos no aumento de etanol e de xileno banhos de etanol a 70% durante 45 minutos, duas vezes em etanol a 95% durante 45 minutos, três vezes em etanol a 100% durante 1 hora e duas vezes em xilol durante 45 minutos.
   2. Permear os tecidos com parafina 3 vezes para cada 1 hora em um vácuo com pressão aplicada.
5. Incorporar os tecidos em parafina para formar blocos, Para o corte.

3. Histologia e Blockface Imagem

1. Aparar os blocos de parafina utilizando um micrótomo rotativo até que o excesso de parafinas é removido.
2. Use uma fresadora vertical para perfurar um milímetro furos em pelo menos dois cantos do bloco de parafina perpendicular à fita.
3. Monte o bloco de tecido em micrótomo rotativo.
4. Configure o sistema de imagem blockface ¹⁹ na frente do micrótomo.
5. Capturar imagem blockface óptico antes da corte.
6. Corte tiras de quatro seções em 5 mM espessura no micrótomo.
   1. Transferir as fitas para o banho de água fria.
   2. Separe as segunda e quarta partes da fita e cole-as em lâminas de microscópio. Escolhendo a segunda ea quarta seções fornece uma lacuna 5 mm entre as seções.
   3. Expanda cada seção em um banho de água quente (48 ^{º C)} para unwrinkle-lo, em seguida, re-montar-lo na lâmina de microscópio.
      NOTA: Cutting, montagem, unwrinkling as seções causar algumas distorções no seção, como lágrima, dobra, contração e expansão. Esses artefatos complicar o registro dos cortes histológicos.
   4. Mancha as seções com H & E usando um corante automática.
   5. Lamela os slides usando um coverslipper automática.
   6. Digitalize os slides usando um scanner de slides histologia digitais na resolução de interesse. Para este protocolo a ampliação for 20x ea resolução é de 0,47 m.
   7. Down-provar as imagens de histologia para a resolução das imagens blockface, 18 mM.

4. Registro da Imagem

1. Segmentação de imagem e ponto de Seleção
   1. Em blockface imagens medir os valores de pixel para os furos de registo e utilizar o valor médio como um limite fixo para o segmento de furos de registo nos cantos do bloco de parafina.
   2. Uma vez que algumas peças adicionais também pode ser segmentado porutilizando o limiar fixo, utilizar a circularidade e a zona dos objectos segmentados para encontrar os furos e descartar os objectos adicionais. Para fazer isso, escrever um pequeno código e encontrar a relação de (4π x área) / (perímetro) ² para os objetos segmentados. Esta relação de objetos redondos é 1.
   3. Para cada glândula mamária, seleccionar uma imagem blockface como referência e alinhar o resto das imagens blockface para a referência, utilizando o centro dos furos de registo e de técnicas de registo baseados em marco.
   4. Para as imagens blockface alinhados, o segmento manualmente ou extrair o tecido a partir do fundo. Use o objeto mais considerável na máscara para o resto do protocolo.
   5. Para H & E seções siga os passos abaixo para a segmentação automática.
      1. Use Otsu técnica limiar ^{de 20} a segmentar imagens do fundo e criar máscaras binárias das imagens histológicas.
      2. Identificar e selecionar o objeto mais considerável em cada máscara usando o histogram dos objectos etiquetados.
      3. Extraia os um pixel de largura pontos de fronteira de ambos histologia e máscaras blockface.
      4. Use o algoritmo de código Cadeia ^21, para representar os pontos de fronteira por uma seqüência de linear por partes se encaixa.
2. Registro rígida inicial
   1. Use Descritores de Fourier algoritmo ^22, para encontrar o inicial rígida transformar entre os pontos de fronteira de histologia e suas imagens blockface correspondentes. Este inicial transformar inclui os fatores translação, rotação e escala.
   2. Transformar cada imagem histologia com a inicial transformada obtida no passo anterior.
3. Refinamento do Registro rígida
   1. Remova as seções de alta ponta curvatura do contorno histologia usando um filtro bola rolar ^23.
   2. Selecione 500 pontos a partir dos pontos de fronteira de histologia restantes utilizando aleatoriamente distribuição uniforme.
   3. Transformar o ahistologia pontos de fronteira aleatórios com a transformação inicial obtida a partir de descritores de Fourier.
   4. Selecione o conjunto de blockface pontos de fronteira e usar iterativos pontos mais próximos (ICP) algoritmo ²⁴ para encontrar a transformação rígida entre os pontos de fronteira blockface, destino e histologia pontos de fronteira aleatórios.
   5. Transforme as imagens de histologia alinhados obtidos da etapa anterior e a pilha de imagens de histologia alinhados cria o volume histologia.
   6. Use um software de visualização 3D para criar uma imagem visual do volume histologia.
4. Visualizando a pilha de imagens com ampliação de 5x
   1. Down-provar as imagens histológicas originais 5x ampliação.
   2. Cortar a região de interesse em uma das imagens de histologia.
   3. Calcula-se a localização da região em outras imagens histológicas 5x utilizando a combinação das transformações rígidas das duas etapas de registo.
   4. Corte a regions de interesse para a mesma região tamanho em todas as outras imagens histologia.
   5. Finalmente refinar o alinhamento entre as regiões manualmente. Escreva um programa que se sobrepõe a duas imagens e permite selecionar os valores de rotação e translação de uma das imagens mais o outro e, em seguida, salva a imagem transformada quando o alinhamento é aceito.
   6. Ver as pilhas de regiões histologia 5x alinhadas usando um software de visualização 3D.

Resultados

Uma armadilha de técnicas de microscopia tradicionais é que a compreensão de um órgão a nível microscópico é limitado a um campo de visão de cada vez. Mesmo "totais de divulgação" slides, que fornecem seções de slides inteiros, não fornecem informações tridimensional. Com o desenvolvimento de slides todo, tecnologias dinâmicas de verificação, a nossa capacidade de ver uma seção em sua totalidade aumentou, porém extrapolando estruturas 3D requer a reconstrução do volume histologia.

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Discussão

Neste estudo, desenvolvemos um fluxo de trabalho de registro das imagens para reconstruir um volume 3D a partir de histologia série de imagens de histologia em 2D, que não requer marcos internos selecionados aleatoriamente ou marcadores fiduciais implantados dentro do tecido, o que pode distorcer o tecido. Pelo método descrito, as próprias imagens blockface ópticos são usados ​​como imagens de referência anteriores a corte. Usamos furos externos perfurados no bloco de parafina para auxiliar no alinhamento das...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% PFA	VWR International	15710	16% Paraformaldehyde solution
Small tissue processing cassettes	VWR International	CA95029-956
Leica ASP300 automated tissue processor	Leica	14047643515
100% Ethanol	Fisher Scientific	S25307B
Xylene	VWR International	CA95057-822
Paraffin	Thermo Fisher	39501006	Paraplast tissue embedding medium
Leica EG 1160 embedding center	Leica
Leica rotary microtome	Leica
Milling machine	Argo
Microscope slides	VWR International	CA48312-015
H&E stain	VWR International
Automatic stainer
Coverslips	VWR International	48404-452
MEDITE RCM 7000 glass coverslipper	MEDITE
Leica SCN400 slide scanner	Leica
MATLAB	MathWorks Inc	MATLAB 2007b	Development software
MeVisLab	MeVis Medical Solutions AG	MeVisLab 2.1	3D visualization software