Die Rekonstruktion der 3-Dimensional Histologie Volume und seine Anwendung auf Maus Milchdrüsen Studieren

Zusammenfassung

We present an image registration approach for 3-dimensional (3D) histology volume reconstruction, which facilitates the study of the changes of an organ at the level of macrostructures made up of cells . Using this approach, we studied the 3D changes between wild-type and Igfbp7-null mammary glands.

Zusammenfassung

Histologie Volumenrekonstruktion erleichtert die Untersuchung von 3D-Form-und Volumenänderung eines Organs auf der Ebene der Makrostrukturen aus Zellen aufgebaut. Es kann auch verwendet werden, um zu untersuchen und Validierung neuer Techniken und Algorithmen, die in volumetrischen medizinischen Bildgebung und Therapie werden. Erstellen von 3D-High-Resolution-Atlanten von verschiedenen Organen, ^1,2,3 ist eine weitere Anwendung der Histologie Volumenrekonstruktion. Dies stellt eine Ressource für die Untersuchung von Gewebestrukturen und die räumliche Beziehung zwischen verschiedenen zellulären Funktionen. Wir präsentieren eine Bildregistrierung Ansatz für die Histologie Volumenrekonstruktion, die eine Reihe von optischen blockface Bilder verwendet. Das rekonstruierte Histologie Volumen stellt eine zuverlässige Form der verarbeiteten Probe ohne breiteten Post-Processing-Registrierungsfehler. Die Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbten Schnitten von zwei Maus-Brustdrüsen wurden zu den entsprechenden Bildern mit blockface Grenzpunkte von der ed extrahiert registriertges der Probe in der Histologie und blockface Bilder. Die Genauigkeit der Registrierung wurde visuell bewertet. Die Ausrichtung der Makrostrukturen der Brustdrüsen wurde visuell mit hoher Auflösung untersucht.

Diese Studie umreißt die verschiedenen Schritte des Bildregistrierungs Pipeline, von Entfernung der Brustdrüse durch den 3D-Volumenrekonstruktion Histologie. Während 2D-Histologie Bilder zeigen die strukturellen Unterschiede zwischen Paaren von Abschnitten, bietet 3D-Histologie Volumen die Möglichkeit, die Unterschiede in der Form und Volumen der Brustdrüsen zu visualisieren.

Einleitung

IGFBP7 (Insulin-like growth factor binding protein 7) ist ein Mitglied der IGF-bindende Proteinfamilie, und es wurde gezeigt, um die ^{IGF-1-Rezeptor-4} zu binden. Herabregulierung von IGFBP7 ist bekannt, mit einer schlechten Prognose bei Brustkrebs ⁵ korreliert werden, während die Wiedereinführung von IGFBP7 in Xenograft-Tumormodellen hemmt stark die Tumorwachstums ⁶ durch Induktion von Apoptose und Zellalterung ^7. Um die Auswirkungen der IGFPB7 zu untersuchen, wurde ein IGFBP7 null Maus ⁵ (unveröffentlichte Daten) erstellt. Während diese Mäuse keine Tumore entwickeln, Veränderungen in der Histologie des Eierstock-, Muskel-und Leber sowie Mängel in der Brustdrüse Entwicklungs Strukturierung (unveröffentlichte Daten) zeigen sie. Das defekte Phänotyp wurde angegeben als die null-Mäuse haben kleinere Wurfgrößen und sind unfähig, mehrere große Würfe (unveröffentlichte Daten) zu erhalten.

3D-Histologie Bände haben das Potenzial, um nützliche Informat bietenIonen für quantitative und vergleichende Analysen und Bewertung der pathologischen Befunde in Volumen medizinische Bilder. Dreidimensionales konfokales können zwei-Photonen-Mikroskopie hoher Auflösung Zelle morphologische Information der Drüse an lokalen Speicherbereich ¹⁴ zu schaffen, aber eine begrenzte Sichtfeld und Tiefe hat. Histologie Volumenrekonstruktion liefert mehr Informationen über einen viel größeren räumlichen Ausdehnung. Verwendung traditioneller Ansätze gewisse Verzerrung während der Herstellung histologischer Schnitte, wie z. B. Schrumpfung, Expansion, Risse und Falten erwartet. Diese Verzerrungen machen es schwierig, seriellen histologischen Bilder in ein 3D-Stapel Register, um ein 3D-Volumen zu rekonstruieren. Da die Anzahl von aufeinanderfolgenden Abschnitten mit Defekten erhöht die Ähnlichkeiten zwischen intakten Abschnitte reduziert und folglich ist der Registrierungsprozess komplizierter.

Verschiedene Methoden wurden vorgeschlagen, um histologische Schnitte zu registrieren und eine kontinuierliche Histologie vo erstellenlume. Einige Techniken sind abhängig von Intensitätsvariationen ^8, und andere werden von der Form der Abschnitte ⁹ basiert. Bei einigen Proben können die anatomischen Strukturen als Landmarken ^10,11 zusammen mit Wahrzeichen-basierte Registrierungsverfahren ^12,13 verwendet werden. Aber diese inneren Strukturen möglicherweise nicht nachweisbar sein in der gesamten Menge und für einige Proben keine zuverlässigen anatomischen Strukturen identifiziert werden können. Einige Gruppen haben eine paarweise Anmeldung Ansatz verwendet und registriert in Folge Histologie Bilder einem zum anderen mit Konturen oder anatomischen Strukturen ^16-18. Registrieren von Serien Histologie Abschnitte miteinander, ohne die Verwendung von Referenzbildern kann die Registrierung Fehler zu propagieren und ändern Sie die tatsächliche Form der Histologie Lautstärke. Paarweise Anmeldung Ansatz beruht auf der Konsistenz der Form der Histologie Abschnitten und den inneren Strukturen im gesamten Stapel der Bilder; daher dichter Abtastung der Probe, es erfordert dienicht immer möglich ist, z. B. für klinische Proben.

In dieser Pipeline verwenden wir blockface Bilder als eine Reihe von Referenzbildern für die Histologie ¹⁹ Volumenrekonstruktion. Blockface Bilder der Paraffingewebeblöcke nach der Montage am Mikrotom genommen und vor jeder Abschnitt wird abgeschnitten. Somit muss Beschädigungen einzelner Serienschnitte Schnitt nicht mit der Registrierung der Serienschnitte ^8,11,15 stören. Wir erfassen die blockface Bilder in einer anderen Weise von den anderen Gruppen. Die optischen Block Gesichtsbilder werden von einem telezentrischen Objektiv zu beseitigen oder zu minimieren, den Lauf und perspektivische Verzerrung, die in der Regel tritt auf, wenn mit regulären Linsen in der Optik erhalten. Dies ist einer der Vorteile der vorgeschlagenen Vorgehensweise gegenüber den anderen Methoden veröffentlicht, die blockface Bildgebung durchführen mit regulären Linsen. Die Bilder werden in einem geringen spitzen Winkel getroffen werden, um die Reflexion von der Oberfläche des Blocks zur Kontrastverstärkung zwischen dem TISS verwendenue und Paraffinoberfläche und den Schatten des Gewebes in der Tiefe unter der Oberfläche zu beseitigen Paraffin. Photographische Filter wird auch verwendet, um das Licht, das von der Blockoberfläche und dem Gewebe, um den Kontrast ¹⁹ ausgleichen zu polarisieren. Um die Verschiebung des Blocks auf der Rotationsmikrotom korrigieren, zwei bis drei Löcher in den Ecken des Blocks, die in den blockface Bilder leicht nachweisbar sind gebohrt. Die Schwerpunkte dieser Löcher werden zusammen mit Wahrzeichen-basierten starren Anmeldung benutzt, um die Bilder blockface auszurichten.

Protokoll

1. Proben

1. Verbrauchsteuern die Brustdrüsen chirurgisch aus Wildtyp-CDH1 sowie IGFBP7-null-Mäusen 3 Tage nach dem Einsetzen der Laktation.
2. Verbreiten Sie die Drüsen auf Glasobjektträger zu helfen, wieder Muttermilchdrüsenmorphologie.

2. Fixierung und Gewebeverarbeitung

1. Befestigen Sie die Milchdrüsen in neutral gepuffertem 4% PFA O / N bei 4 ° ^C.
2. Bewahren Sie die Drüsen in 70% Ethanol vor der Gewebeverarbeitung.
3. Übertragen Sie die Drüsen, kleine Gewebeverarbeitung Kassetten.
4. Verarbeiten Sie die Gewebe mit Hilfe eines automatisierten Gewebeprozessor
   1. Dehydratisierung der Gewebe in zunehmenden Ethanol und Xylol Bäder von 70% Ethanol für 45 min, 2 mal in 95% Ethanol für 45 Minuten, 3 mal in 100% Ethanol für 1 Stunde und 2 mal in Xylol für 45 min.
   2. Dringen das Gewebe mit Paraffin 3 Mal für jeweils 1 h in einem Vakuum mit Druckvorgabe.
5. Betten Sie das Gewebe in Paraffin zu Blöcken, Für das Schneiden.

3. Histologie und Blockface Imaging

1. Schneiden Sie die Paraffinblöcke mit Hilfe eines Rotationsmikrotoms, bis das überschüssige Paraffin wird entfernt.
2. Verwenden eine Vertikalfräsmaschine 1 mm Bohrungen in mindestens zwei Ecken der Paraffinblock senkrecht zu der Kassette.
3. Montieren Sie den Gewebeblock auf der Rotationsmikrotoms.
4. Richten Sie die blockface Abbildungssystem ¹⁹ vor dem Mikrotom.
5. Optischen Bild blockface Erfassen vor dem Schneiden.
6. Schneiden Bänder aus vier Abschnitten bei 5 um Dicke am Mikrotom.
   1. Übertragen Sie die Bänder an den kalten Wasserbad.
   2. Trennen Sie die zweiten und vierten Abschnitt des Bandes und montieren sie auf Objektträgern. Wahl der zweiten und vierten Abschnitt eine Lücke zwischen 5 &mgr; m Abschnitte.
   3. Erweitern Sie jeden Abschnitt in einem warmen Wasserbad (48 ^{° C),} um sie unwrinkle, dann wieder montieren auf dem Objektträger.
      HINWEIS: CUtting, Montage, Glättungs die Abschnitte führen, dass einige Verzerrungen auf dem Abschnitt, wie Reiß, falten, Schrumpfung und Expansion. Diese Artefakte erschweren die Registrierung der Histologieschnitten.
   4. Färben der Schnitte mit H & E mit einem automatischen stainer.
   5. Deckglas die Folien mit einem automatischen Eindeckautomat.
   6. Digitalisieren Sie die Folien mit einem digitalen Histologie Dia-Scanner mit einer Auflösung von Interesse. Aus diesem Protokoll ist die Vergrößerung 20x und die Auflösung ist 0,47 um.
   7. Down probieren Sie die Histologie Bilder an die Auflösung des blockface Bilder, 18 um.

4. Bildregistrierung

1. Bildsegmentierung und Punktauswahl
   1. In blockface Bilder messen die Pixelwerte der Ausrichtungslöcher und benutzen den Durchschnittswert als eine feste Schwelle zu segmentieren die Ausrichtungslöcher in den Ecken des Paraffinblocks.
   2. Da einige Zusatzteile kann auch durch segmentiert werdenmit dem festgelegten Schwellenwert, verwenden Sie die Rundheit und den Bereich der segmentierten Objekte, um die Löcher zu finden und entsorgen Sie die zusätzlichen Objekten. Um dies zu tun, schreibe einen kleinen Code und finden Sie das Verhältnis von (4π x Fläche) / (Perimeter) ² für die segmentierten Objekte. Dieses Verhältnis für runde Objekte 1 ist.
   3. Für jede Brustdrüse, wählen Sie eine blockface Bild als Referenz, und richten Sie den Rest der blockface Bilder zum Referenz, indem die Mitte der Anmeldung Löcher und Wahrzeichen-basierte Registrierungstechniken.
   4. Für die ausgerichteten blockface Bilder manuell Segment oder extrahieren Sie die Gewebe aus dem Hintergrund. Nutzen die meisten großen Objekt durch in der Maske für den Rest des Protokolls.
   5. Für H & E Abschnitte die folgenden Schritte für die automatische Segmentierung.
      1. Verwenden Otsu Schwellwerttechnik ²⁰ bis Segment Bilder aus dem Hintergrund und erstellen binäre Masken der Histologie Bilder.
      2. Identifizieren und wählen Sie die ansehnliche Objekt in jeder Maske mit dem histogram der markierten Objekte.
      3. Extrahieren Sie die ein Pixel breite Grenzpunkte von beiden Histologie und blockface Masken.
      4. Verwenden Chain-Code-Algorithmus ^21, um die Grenzpunkte durch eine Folge von stückweise linearen darstellen passt.
2. Initial Starre Registrierung
   1. Verwenden Fourier Deskriptoren Algorithmus ^22, zu finden, die erste starre Transformation zwischen den Grenzpunkten der Histologie und ihre entsprechenden blockface Bilder. Diese erste transformieren umfasst die Translation, Rotation und Skalierungsfaktoren.
   2. Verwandeln Sie jedes Bild mit der Histologie aus dem vorherigen Schritt die Anfangs Transformation erhalten.
3. Verfeinerung der Starre Registrierung
   1. Entfernen Sie die hohe Krümmung Randabschnitte von der Histologie Kontur mit einem rollenden Ball Filter ^23.
   2. Wählen Sie 500 Punkte aus den verbleibenden Histologie Grenzpunkte zufällig mit gleichmäßigen Verteilung.
   3. Transformieren Sie die dieHistologie Zufallsgrenzpunkte mit der aus der Fourier-Deskriptoren erhalten anfänglichen Transformation.
   4. Wählen Sie die ganze Reihe von blockface Grenzpunkte und benutzen Iterative Closest Point (ICP) Algorithmus ^24, um die starre Transformation zwischen den blockface Grenzpunkte, Ziel und Histologie Zufallsgrenzpunkte zu finden.
   5. Transformation der ausgerichteten Histologie Bilder aus dem vorhergehenden Schritt erhalten, und der Stapel ausgerichtet Histologie Bilder erstellt die Histologie Volumen.
   6. Verwenden Sie ein 3D-Visualisierungs-Software, um eine visuelle Bild der Histologie Volume zu erstellen.
4. Stack anzeigen der Bilder bei 5-facher Vergrößerung
   1. Down probieren Sie die Original Histologie Bilder, um die Vergrößerung 5x.
   2. Crop die Region von Interesse in einer der Histologie Bilder.
   3. Berechnen der Position dieser Region in anderen 5x Histologie Bilder unter Verwendung der Kombination der starren Transformationen aus den zwei Schritten der Registrierung.
   4. Schneiden Sie das regions von Interesse für die gleichen Größenbereich in allen anderen histologischen Bilder.
   5. Schließlich verfeinern die Ausrichtung zwischen den Regionen manuell. Ein Programm zu schreiben, die zwei Bilder überlagert, und ermöglicht die Auswahl der Werte für Rotation und Translation eines der Bilder gegenüber dem anderen ein und speichert dann das transformierte Bild, wenn die Ausrichtung angenommen wird.
   6. Sehen Sie sich die Stapel der ausgerichteten 5x Histologie Regionen mit einem 3D-Visualisierungssoftware.

Ergebnisse

Ein Fallstrick der traditionellen Mikroskopie-Techniken ist, dass das Verständnis von einem Organ auf der mikroskopischen Ebene wird auf einem Feld-of-view in einer Zeit beschränkt. Auch "total Offenlegung" Dias, die gesamte Folie Abschnitte bieten, scheitern, um dreidimensionale Informationen. Mit der Entwicklung des gesamten Objektträger, dynamische Scan-Technologien, unsere Fähigkeit, einen Abschnitt in seiner Gesamtheit zu sehen gestiegen ist, aber die Extrapolation Strukturen erfordert 3D-Histologie V...

Diskussion

In dieser Studie haben wir eine Bildregistrierung Workflow, um ein 3D-Histologie Volumen aus 2D-Serien Histologie Bilder, die nicht internen zufällig ausgewählten Landmarken oder implantiert Bezugsmarker im Gewebe, die das Gewebe verzerren könnten erfordert rekonstruieren entwickelt. Durch das beschriebene Verfahren werden optische Bilder blockface sich als die Referenzbilder vor dem Schneiden verwendet. Wir verwenden externe Löcher in dem Paraffinblock gebohrt, um beim Ausrichten der Bilder blockface unterstützen ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% PFA	VWR International	15710	16% Paraformaldehyde solution
Small tissue processing cassettes	VWR International	CA95029-956
Leica ASP300 Automated Tissue processor	Leica	14047643515
100% ethanol	Fisher Scientific	S25307B
Xylene	VWR International	CA95057-822
Paraffin	Thermo Fisher	39501006	Paraplast Tissue Embedding Medium
Leica EG 1160 Embedding Centre	Leica
Leica rotary microtome	Leica
Milling machine	Argo
Microscope slides	VWR International	CA48312-015
H&E stain	VWR International
Automatic stainer
Coverslips	VWR International	48404-452
MEDITE RCM 7000 Glass Coverslipper	MEDITE
Leica SCN400 slide scanner	Leica
MATLAB	MathWorks Inc	MATLAB 2007b	Development software
MeVisLab	MeVis Medical Solutions AG	MeVisLab 2.1	3D visualization software